人血清白蛋白与白介素1受体拮抗剂融合蛋白的表达系统.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102766648 A (43)申请公布日 2012.11.07 CN 102766648 A *CN102766648A* (21)申请号 201210259705.6 (22)申请日 2012.07.25 C12N 15/81(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38 号 (72)发明人 陈枢青 沈其 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限 公司 33224 代理人 胡红娟 (54) 发明名称 人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗。

2、剂融合蛋 白的表达系统 (57) 摘要 本发明公开了一种人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗剂融合蛋白的表达系统， 包括宿主细胞 和转化入宿主细胞的表达载体， 所述表达载体包 括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插入有 二硫键异构酶基因的第二表达载体， 所述融合蛋 白基因包括人血清白蛋白基因和白介素 1 受体拮 抗剂基因， 所述宿主细胞为毕赤酵母 GS115。本发 明构建PDI与IGH共表达的宿主， 使得IGH的表达 量显著提高， 由于 PDI 在胞内表达， 而 IGH 分泌表 达到胞外， 所以收集的培养基上清中 IGH 浓度增 加的同时不会新产生其他蛋白。 (51)Int.Cl. 权利要求书 。

3、1 页 说明书 7 页 序列表 9 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 9 页 附图 3 页 1/1 页 2 1. 一种人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗剂融合蛋白的表达系统， 包括宿主细胞和转 化入宿主细胞的表达载体， 其特征在于， 所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表 达载体和插入有二硫键异构酶基因的第二表达载体， 所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白 基因和白介素 1 受体拮抗剂基因， 所述宿主细胞为毕赤酵母 (Pichia pastoris)GS115。 2. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特。

4、征在于， 所述融合蛋白基因包括连接人血清白 蛋白基因和白介素 1 受体拮抗剂基因的连接肽序列。 3. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特征在于， 所述融合蛋白基因的碱基序列如 SEQ ID NO.1 所示。 4. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特征在于， 所述的二硫键异构酶基因的碱基序列 如 SEQ ID NO.2 所示。 5. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特征在于， 所述第一表达载体和第二表达载体的 原始载体均为 pPIC 系列载体。 6. 如权利要求 5 所述的表达系统， 其特征在于， 所述第一表达载体包含信号肽， 所述第 二表达载体不包含信号肽。 7. 如权利要求 6 。

5、所述的表达系统， 其特征在于， 所述第一表达载体的原始载体为 pPICZB。 8. 如权利要求 6 所述的表达系统， 其特征在于， 所述第二表达载体的原始载体为 pPIC3.5K。 9. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特征在于， 所述第一表达载体的拷贝数为 3 4 个。 10. 如权利要求 1 所述的表达系统， 其特征在于， 所述第二表达载体的拷贝数为至少两 个。 权 利 要 求 书 CN 102766648 A 2 1/7 页 3 人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗剂融合蛋白的表达系统 技术领域 0001 本发明涉及一种蛋白表达系统， 尤其涉及一种人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗 剂。

6、融合蛋白的表达系统。 背景技术 0002 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近些年来一个较为成功的外源蛋 白真核表达系统， 与大肠杆菌表达系统相比， 它能更好地表达结构复杂的蛋白质， 并且能够 完成如二硫键形成这样的翻译后修饰。 与哺乳类细胞、 昆虫细胞表达系统相比， 它具有操作 简单、 表达量高、 容易产业化放大等优势。 0003 白介素1受体拮抗剂(Interleukin 1 receptor antagonist， IL1ra)， 是一种可与 IL1 受体结合的蛋白， 当其与 IL1 受体结合后可阻断 IL1 的生物学活性。因此一定浓度的 IL1ra 能使这两个细。

7、胞因子在生理学和病理生理学以及炎症反应中的生物学活性被中和。 2001 年 11 月 14 日美国 FDA 正式公布批准美国 Amgen 公司生产的商品名为 Kineret 的重组 (rh-)IL1ra 用于治疗类风湿性关节炎， 批准适应症为 “18 岁以上的中度和严重的类风湿性 关节炎患者， 在使用一种或多种改善疾病的抗风湿药物后失效时， 明显减轻病人的体征和 症状” 。 0004 由于 IL1ra 分子量只有 17kDa， 易被肾小球滤过， 因而在临床治疗时， 血药半衰期 较短， 一般需要大剂量频繁用药， 如100mg/day。 为了提高重组IL1ra在体内的血药时间， 中 国专利2008。

8、10060568.7利用基因工程手段将其与HSA融合后插入毕赤酵母中并表达， 经融 合后的蛋白 (IGH) 在小鼠体内血药半衰期显著提高， 但该融合蛋白基因在毕赤酵母中为单 拷贝， 蛋白表达量不够高。 发明内容 0005 本发明提供了一种人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗剂融合蛋白的表达系统， 以 解决现有表达系统融合蛋白表达量不高的问题。 0006 一种人血清白蛋白与白介素 1 受体拮抗剂融合蛋白的表达系统， 包括宿主细胞和 转化入宿主细胞的表达载体， 所述表达载体包括插入有融合蛋白基因的第一表达载体和插 入有二硫键异构酶基因的第二表达载体， 所述融合蛋白基因包括人血清白蛋白基因和白介 素 。

9、1 受体拮抗剂基因， 所述宿主细胞为毕赤酵母 GS115。 0007 二硫键异构酶 (PDI) 是硫氧化还原酶家族中的一种， 主要功能是在内质网上催化 新合成的蛋白形成正确的二硫键。在毕赤酵母的内质网上有一套严格的质量控制体系， 只 有形成正确结构的蛋白才能从内质网分泌到高尔基体当中。如果蛋白没有形成正确的结 构， 则会被降解或积聚在内质网上， 最终降低该蛋白的表达。 IGH融合蛋白中含有18对二硫 键， 更多的 PDI 可以帮助融合蛋白形成正确的二硫键， 以提高表达量。 0008 在第一表达载体中包含 IGH 融合蛋白基因为目的基因， 它插入在启动子的下游， 在第二表达载体中包含二硫键异构酶。

10、基因为目的基因， 它同样插入在启动子的下游。 说 明 书 CN 102766648 A 3 2/7 页 4 0009 在第一表达载体中， 人血清白蛋白基因和白介素 1 受体拮抗剂基因可以直接连 接， 也可以通过连接肽序列连接， 所述连接肽序列是指编码连接肽的 DNA 序列， 连接肽用于 连接人血清白蛋白和白介素 1 受体拮抗剂。该连接肽的氨基酸残基序列可以由甘氨酸、 丝 氨酸、 丙氨酸和苏氨酸中的一种或多种连接组成， 具体可以为 GGGSn， n 为不大于 4 的自然 数。在融合蛋白基因中， 人血清白蛋白基因和白介素 1 受体拮抗剂基因两者之间的相对位 置是任意的。 所述融合蛋白基因还包括限制。

11、性酶切位点， 使得酶切后可以产生粘性末端， 便 于基因序列的连接。关于融合蛋白的基因结构可以参考中国专利 200810060568.7 公开的 内容。 0010 所述第一表达载体和第二表达载体为真核表达载体， 优选的， 所述第一表达载体 包含信号肽， 所述第二表达载体不包含信号肽， 如此融合蛋白可以分泌到胞外， 而 PDI 可以 存留在胞内， 便于融合蛋白的分离纯化。 更优选的， 所述第一表达载体和第二表达载体的原 始载体优选为 pPIC 系列载体， 其中第一表达载体的原始载体优选为 pPICZB， 第二表达载 体的原始载体优选为 pPIC3.5K。 0011 在本发明中第一表达载体可以为单拷。

12、贝， 但为了提高表达量， 最好选用为多拷贝， 拷贝数至少为 2 个， 优选为 3 4 个。 0012 本发明还提供所述表达系统的构建方法， 包括 ： 0013 (a) 用限制性内切酶将融合蛋白基因 (IGH 基因 ) 从 pPIC9-IGH 上切下并回收 ； 0014 (b) 将步骤 (a) 中得到的 IGH 基因插入到 pPICZB 相应的酶切位点中 ； 0015 (c) 将步骤 (b) 中得到的 pPICZB-IGH 线性化后电转到表达宿主 GS115 中， 转化 了的细胞在含有 Zeocin 的平板上筛选单克隆 ； 0016 (d) 鉴定步骤 (c) 中得到的单克隆菌株表达量及 IGH 。

13、基因拷贝数。 0017 (e) 将二硫键异构酶 (PDI 基因 ) 插入 pPIC3.5K， 得到 pPIC3.5K-PDI ； 0018 (f) 将步骤 (e) 中得到的 pPIC3.5K-PDI 载体用 BspE I 线性化后电转化步骤 (d) 得到的含有pPICZB-IGH的GS115菌株， 转化后的细胞先涂布到RDB平皿， 然后在含有0.5 或 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选转化子 ； 0019 (g) 将步骤 (f) 中挑选到的转化子在摇瓶条件下表达 IGH 蛋白， 培养基上清用 SDS-PAGE 分析表达量。 0020 步骤 (a) 中， IGH 基因。

14、即为本发明所述的融合蛋白基因， 其碱基序列如 SEQ ID NO.1 所示， 质粒 pPIC9-IGH 结构及其构建方法已在中国专利 200810060568.7 中公开， 切下 的 IGH 基因上游序列含有 Xho I 酶切位点， 下游含有 Not I 酶切位点。 0021 步骤 (b) 中， 空质粒 pPICZB 首先用 Xho I 和 Not I 酶切， 然后与 IGH 基因连接， 得到 pPICZB-IGH 质粒。 0022 步骤 (c) 中， pPICZB-IGH 质粒用 Pme I 线性化后电转化 GS 115 表达宿主， 转化 后的细胞涂布于含有 100， 700 或 1500g。

15、/mLZeocin 的平板上筛选单克隆菌株。 0023 步骤 (d) 中， 将步骤 (c) 中挑选的克隆在摇瓶条件下表达 IGH 蛋白， 培养基上清用 SDS-PAGE 分析表达量， 挑选的克隆中 IGH 基因的拷贝数用 RT-PCR 鉴定， 可参考 Norden 等 (Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporins in Pichia pastoris， BMC biotechnology， 2011) 公开的方法。 0024 步骤 (e) 中， PDI 基因的碱基序列可以如 SEQ I。

16、D NO.2 所示。 说 明 书 CN 102766648 A 4 3/7 页 5 0025 毕赤酵母 GS 115、 质粒 pPICZB 为商业化产品 (Invitrogen Corp.San Diego. California.USA)。 0026 与现有技术相比较， 本发明具有的有益效果为 ： 0027 (1) 毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少， 因此， 高分泌的外源蛋白易从培养 基中分离 ； 另外与酿酒酵母相比， 赤酵母不产生过度的糖基化， 所分泌的糖蛋白的免疫原性 较低， 更利于临床应用。 0028 (2) 本发明构建 PDI 与 IGH 共表达的宿主， 使得 IGH 的表达量显。

17、著提高， 由于 PDI 在胞内表达， 而IGH分泌表达到胞外， 所以收集的培养基上清中IGH浓度增加的同时不会新 产生其他蛋白。 附图说明 0029 图 1 为重组质粒 pPICZB-IGH 的构建示意图。 0030 图 2 为 IGH 融合蛋白在不同 Zeocin 浓度下挑选得到的克隆菌株的 PAGE 分析。a 为 SDS-PAGE 电泳图， 其中 L1-L5 为 100g/mLZeocin 的平板上筛选单克隆菌株， H1-H4 为 700g/mLZeocin 的平板上筛选单克隆菌株 ； b 为所对应的菌株用蛋白定量软件 Quantity One 定量然后计算出单位菌体表达量比较 ( 方差来。

18、自三个平行 )。 0031 图 3 为重组质粒 pPIC3.5K-PDI 的示意图。 0032 图 4 为导入了 PDI 或 BiP(immunoglobulin binding protein) 基因的多拷贝 IGH 宿主表达上清 SDS-PAGE 分析图。a 为 SDS-PAGE 电泳图， 其中 1 为 IGH 单拷贝菌株， 2 为步 骤 (c) 得到的多 IGH 拷贝菌株， 3 为 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的转了 PDI 的 多IGH拷贝单克隆菌株， 4， 5为1.5mg/ml Geneticin的YPD平皿上挑选的转了PDI的多IGH 拷贝单克隆菌株。

19、， 6 为 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的转了 BiP 的多 IGH 拷贝单 克隆菌株， 7， 8 为 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的转了 BiP 的多 IGH 拷贝单克隆 菌株。b 为所对应的菌株用 Biorad 公司的蛋白定量软件 Quantity One 定量然后计算出单 位菌体表达量比较 ( 方差来自三个平行 )。 0033 图 5 为 Real Time PCR 鉴定 PDI 是否被诱导结果图。 0034 图 6 为 Real Time PCR 鉴定 BiP 是否被诱导结果图。 具体实施方式 0035 实施例 1 构建质。

20、粒 pPIC9-IGH， 并获得可表达 IGH 蛋白的 DNA 序列 0036 使用专利申请号 200810060568.7 公开的质粒 PGEM-T-HSA 和 PGEM-T-IL1ra 作为 模板， 根据IL1ra基因和HSA基因的序列设计引物IL1ra up(SEQ ID NO.16)、 IL1ra dn(SEQ ID NO.17)、 HSAup(SEQ ID NO.18) 和 HSA dn(SEQ ID NO.19) 进行 PCR 扩增。鉴于 BamH I 酶切位点的碱基序列正好编码 -GS-， 特将编码连接肽 -GGGGS- 的密码子设计在 IL1ra dn 5 端， 如此也设计入了。

21、 BamH I 酶切位点。且在 HSA up 5 端也添加 BamHI 酶切位点， 如此 可通过 BamH I 酶切、 连接从而融合 IL1ra 基因和 HSA 基因。将 IL1ra 基因扩增产物用 Xho I 和 BamH I 酶切后回收， 将 HSA 基因扩增产物用 BamH I 和 EcoR I 酶切后回收， 将 pPIC9 空 质粒用 Xho I 和 EcoR I 酶切后回收。将酶切后的 IL1ra 基因、 HSA 基因和 pPIC9 基因三片 段相连得到质粒 pPIC9-IGH， 其中 IGH 表达序列见 SEQ ID NO.1。 说 明 书 CN 102766648 A 5 4/7。

22、 页 6 0037 用Xho I和Not I双酶切质粒pPIC9-IGH， 将含有IGH基因片段的酶切产物电泳纯 化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目的条带。 0038 实施例 2 重组质粒 pPICZB-IGH 构建 0039 将空 pPICZB 载体用 Xho I 和 Not I 酶切， 电泳回收载体片段。将酶切后的 pPICZB 载体和实例 1 中得到的 IGH 表达序列以适当比例混合， 用 T4 连接酶在 16水浴 中连接 12 小时， 形成 pPICZB-IGH( 构建原理见图 1)。pPICZB-IGH 转化入 DH5 后， 铺 于含 25g/mL Zeocin 的 LB 琼脂。

23、平皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种 5mL 含 25g/mLZeocin的LB液体培养基中， 37培养过夜。 获得的阳性克隆送上海生工测序验证 正确。 0040 实施例 3 重组质粒 pPICZB-IGH 转化 GS115 0041 将实例2中得到的验证正确的pPICZB-IGH质粒用Pme I线性化后以电转化的方 式转化入毕赤酵母 GS115， 转化后的细胞在 YPD 液体培养基中 30孵育 2 小时， 然后涂布到 含有 100， 700 或 1500g/mL Zeocin 的 YPDS 琼脂平皿 (1 yeast extract， 2 peptone， 2葡萄糖， 1M 山梨醇，。

24、 2琼脂糖， 1M 山梨醇 )。在 30培养 3 天后， 100， 700 或 1500g/ mL Zeocin 的 YPDS 琼脂平皿上分别长出约 200 个， 4 个， 0 个单菌落。在 100 和 700g/mL Zeocin 的 YPDS 琼脂平皿上分别挑取 5 个 ( 命名为 L1 5) 和 4 个 ( 命名为 H1 4) 单菌 落。 0042 实施例 4 融合蛋白 IGH 在多拷贝宿主中提高表达 0043 参 考 Norden 等 (Increasing gene dosage greatly enhances recombinant expression of aquaporin。

25、s in Pichia pastoris， BMC biotechnology， 2011)公开的方法， 用 Real Time PCR 确定实施例 3 中挑选的 9 个克隆 IGH 拷贝数， 结果见表 1。 0044 表 1 0045 Strain IH copy number Strain IH copy number L1 1.20.3 H1 2.00.3 L2 0.90.2 H2 3.20.2 L3 0.90.2 H3 3.50.7 L4 0.80.1 H4 3.20.3 L5 1.20.1 0046 将实施例3中挑选的9个克隆接种至装有30mL BMGY培养基(1yeast extr。

26、act， 2 peptone， 100mmol/L 磷酸钾， pH6.0， 410-5生物素， 1.34无氨基酸酵母氮源， 1甘 油 ) 的 100mL 锥形瓶， 200 转 / 分钟， 30培养至 OD 2 6 后， 换成 30mL BMMY 培养基 (1 yeast extract， 2 peptone， 100mmol/L 磷酸钾， pH6.0， 410-5生物素， 1.34无氨 基酸酵母氮源， 1甲醇 )。然后每隔 24 小时补加 1总培养基体积的甲醇， 诱导 72 小时后 离心取上清， SDS-PAGE 分析表达产物， 每个菌株同时表达三份作为平行， SDS-PAGE 结果参 说 明。

27、 书 CN 102766648 A 6 5/7 页 7 见图 2.a， 完整 IGH 条带用 Quantity One Software 定量并用培养基 OD600均一化后的结果 参见图 2.b。结合表 1 和图 2 可以看出含有 3 4 个 IGH 基因拷贝的宿主表达量显著高于 单拷贝宿主。 0047 实施例 5PDI 基因的扩增 0048 用PCR方法从酵母基因组中获得PDI片段， 所用的引物PDIup(SEQID NO.3)和PDI dn(SEQ ID NO.4)用寡聚核苷酸合成仪合成。 用于扩增的上下游引物中都引入EcoR I酶切 位点和保护碱基。 0049 PDI up ： 5 -G。

28、CGAATTCACCATGCAATTCAACTGGGATATT-3 0050 PDI dn ： 5 -GCGAATTCTTAAAGCTCGTCGTGAGCGTC-3 0051 PCR 反应条件 ： 50L 反应体系中， 加入 1L 酵母基因组， 10mol/L 的上下游引 物各 1L， 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4L， 5Buffer(Mg2+plus)10L， PrimeSTAR DNA 聚合酶0.5L， 剩余用ddH2O补足。 用EPPENDORF公司的(型号为Matstercycler Gradient) PCR 仪， PCR 反应条件为 98预变性 5min ；。

29、 然后 98变性 20s ； 55退火 30s ； 72延伸 2min， 共 30 个循环以后， 再 72延伸 10min。通过 1凝胶电泳分析得到预期为 1573bp 的 PCR 产物。 0052 实施例 6 重组载体 pPIC3.5K-PDI 的构建 0053 将实施例 5 中得到的 PDI 扩增产物电泳纯化后用 DNA 片段回收试剂盒回收纯化目 的条带。纯化后的 PCR 产物用 EcoR I 酶切， 电泳回收 ； 质粒 pPIC3.5K 同样用 EcoR I 酶切， 电泳回收线性化后的片段。将酶切后的 PDI 片段与载体 pPIC3.5K 以 3 1 比例混合， 用 T4 连接酶在16水。

30、浴中连接过夜后转化入DH5感受态细胞中。 转化后的DH5细胞铺于含 氨苄青霉素 (50g/ml) 的 LB 琼脂平皿， 37培养过夜。挑选平皿上数个克隆送上海生工 基因测序， 测序结果确定 PDI 插入方向及基因序列正确的 DH5 菌株 (pPIC3.5K-PDI) 用于 后续实验。 0054 实施例 7pPIC3.5K-PDI 转化入含多拷贝 IGH 的 GS115 表达菌株 0055 将实施例 6 中得到的 pPIC3.5K-PDI 质粒用 BspE I 线性化后转化入含多拷贝 IGH 的 GS115 表达菌株 H2( 参见表 1)。转化后的细胞先铺于 RDB 琼脂平板 (1mol/L 山。

31、梨醇， 1 葡萄糖， 410-5生物素， 1.34无氨基酸酵母氮源 (YNB， Difeocorp.)， 0.005氨基酸混 合液 ( 谷氨酸、 甲硫氨酸、 赖氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸各 0.005 )， 37培养 3-5 天。然后将 RDB 上的阳性克隆涂布于含有 0.5 或 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上继续挑选转化子。 0056 实施例 8 共表达 PDI 提高 IGH 表达 0057 选取三个实施例 7 中得到的转化子用于比较 IGH 蛋白的表达， 其中一个菌株选自 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿， 两个菌株选自 1.5mg/mlGe。

32、neticin 的 YPD 平皿。选取单 拷贝 IGH 基因的 GS115 表达菌株和含有多拷贝 IGH 基因 ( 用 RT-PCR 方法确定含有 3.2 个 IGH 基因拷贝数 ) 的 GS115 表达菌株作为对照。将各菌株接种至装有 30mL BMGY 培养基 (1 yeast extract， 2 peptone， 100mmol/L 磷酸钾， pH6.0， 410-5生物素， 1.34无氨 基酸酵母氮源， 1甘油 ) 的 100mL 三角瓶， 200 转 / 分钟， 30培养至 OD600 2-6 后， 换成 30mL BMMY 培养基 (1 yeast extract， 2 pept。

33、one， 100mmol/L 磷酸钾， pH6.0， 410-5 生物素， 1.34无氨基酸酵母氮源， 1甲醇 )， 此后添加 1甲醇 /24h， 诱导 3d 后离心取上 清， SDS-PAGE 分析表达产物。 说 明 书 CN 102766648 A 7 6/7 页 8 0058 结果参见图 2.a， 泳道 1 为单拷贝 IGH 菌株， 泳道 2 为多拷贝 IGH 菌株， 泳道 3 为 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的多拷贝 IGH 基础上共表达 PDI 菌株， 泳道 4 和 5 为 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的多拷贝 IGH 。

34、基础上共表达 PDI 菌株， 每个菌株 表达时做三个平行。图 2.b 为 PAGE 条带用软件 Qulaitity One 分析定量后用菌液的 OD600 均一化后比较结果， 发现当 PDI 与 IGH 共表达时， 上清中的 IGH 表达量显著增加。 0059 实施例 9 共表达 PDI 菌株中 PDI 基因 mRNA 水平鉴定 0060 用 RT-PCR 来检测共表达宿主 ( 来自实施例 3 中 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平 皿 ) 中的 mRNA 水平变化， 含有多拷贝 IGH 基因的 GS115 表达菌株作为对照。 0061 将诱导后的酵母菌体用lyticase破。

35、壁， 然后用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit提 取菌体中的 mRNA。提取的 mRNA 作为模板， 用 TakaRa 的 PrimeScript RT Reagent Kit 试剂 盒逆转录为 cDNA 用于 RT-PCR 分析。用于 PDI 转录水平分析的引物分别为 RT PDI up(SEQ ID NO.5) 和 RT PDI dn(SEQ ID NO.6)， 内参序列为 RT ACT up(SEQ ID NO.7) 和 RT ACT dn(SEQ ID NO.8)， 用寡聚核苷酸合成仪合成。PCR 反应体系 ： 20L 反应体系中， 加入 2L cDNA 样品， 10mo。

36、l/L 的上下游引物各 0.8L， 10LSYBR Premix Ex Taq II， 0.4L ROX Reference， 6L dH2O。PCR 在 ABIStepone plus 系统上进行， 反应条件为 95预变性 30s ； 然后 95变性 5s ； 55退火 30s ； 72延伸 30s， 共 30 个循环以后， 用溶解曲线分析确定扩 增产物特异性良好， 每个样品做三个副孔。RT-PCR 得到结果用 2-Ct方法计算 PDI 的 mRNA 水平变化， 结果如图 5 所示， 1 号样品为多拷贝 IGH 菌株， 2 号样品为 1.5mg/ml Geneticin 的YPD平皿上挑选的。

37、多拷贝IGH基础上共表达PDI菌株， 结果显示共表达PDI的菌株中PDI mRNA 量提高了约 30 倍， 说明 PDI 基因可以在 pPIC3.5K 质粒上启动子的作用下转录水平显 著提高。 0062 实施例 10 在多拷贝 IGH 基础上共表达 BiP 0063 类似实施例 5 的方法， 用 PCR 方法从酵母基因组中获得 BiP(SEQ IDNO.9) 片段， 所 用的引物 BiP up(SEQ ID NO.10) 和 BiP dn(SEQ IDNO.11)， 用寡聚核苷酸合成仪合成。用 于扩增的上下游引物中都引入 EcoRI 酶切位点和保护碱基。 0064 BiP up ： 5 -GC。

38、GAATTCACCATGCTGTCGTTAAAACCATCT-3 0065 BiP dn ： 5 -GCGAATTCCTACAACTCATCATGATCAT-3 0066 PCR 反应采用实施例 5 的条件， 1凝胶电泳分析得到预期为 2056bp 的 PCR 产 物。将该片段连接到 TaKaRa18-T 载体上后， 用 TaKaRa MutanBEST 试剂盒将 BiP 上本身带有的 EcoR I 位点除去 ( 不改变翻译后的氨基酸序列 )， 用于突变的引物序列为 BiP1125-F(SEQ ID NO.12) 和 BiP1125-R(SEQ ID NO.13)。突变后的质粒用 EcoR I。

39、 酶切后 用1凝胶电泳回收BiP片段， 然后将该片段插入pPIC3.5K相应的位点， 经上海生工验证序 列以及方向正确的质粒定义为 pPIC3.5K-BiP。 0067 类似于实施例 7 的方法， 将 pPIC3.5K-BiP 质粒转化入含多拷贝 IGH 的 GS115 表达 菌株 ( 实施例 4 中的 H2 菌株 ) 后进行赛选。 0068 类似于实施例 8 的方法， 选取三个含有 BiP 共表达的转化子用于比较 IGH 蛋白 的表达， 其中一个菌株选自 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿， 两个菌株选自 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿。表达上清用。

40、 SDS-PAGE 分析表达产物。结果参见图 2.a， 泳道 3 为 0.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的多拷贝 IGH 基础上共表达 BiP 菌株， 泳道 4 和 5 说 明 书 CN 102766648 A 8 7/7 页 9 为 1.5mg/mlGeneticin 的 YPD 平皿上挑选的多拷贝 IGH 基础上共表达 BiP 菌株， 每个菌株 表达时做三个平行。图 2.b 为 PAGE 条带用软件 Qulaitity One 分析定量后用菌液的 OD600 均一化后比较结果， 发现当 BiP 与 IGH 共表达时， 上清中的 IGH 表达量反而有所减少。 006。

41、9 用 RT-PCR 来检测 BiP 共表达宿主 ( 来自实施例 3 中 1.5mg/mlGeneticin 的 YPD 平皿 ) 中的 mRNA 水平变化， 含有多拷贝 IGH 基因的 GS115 表达菌株作为对照。用于 BiP 转 录水平分析的引物分别为 RT BiP up(SEQ ID NO.14) 和 RT BiP dn(SEQ ID NO.15)， 内参 序列为 RT ACT up(SEQ ID NO.7) 和 RT ACT dn(SEQ ID NO.8)， 用寡聚核苷酸合成仪合成。 PCR 条件和数据处理方法参照实施例 9， 结果如图 6 所示， 1 号样品为多拷贝 IGH 菌株，。

42、 2 号 样品为 1.5mg/ml Geneticin 的 YPD 平皿上挑选的多拷贝 IGH 基础上共表达 BiP 菌株， 结果 显示共表达 BiP 的菌株中 BiPmRNA 量提高了约 10 倍， 说明 BiP 基因可以在 pPIC3.5K 质粒 上启动子的作用下转录水平显著提高。但是 BiP 翻译水平提高后菌株分泌表达的 IGH 融合 蛋白反而有所减少。与共表达 PDI 菌株表达结果比较后可以发现并非所有的分子伴侣都可 以帮助提高 IGH 融合蛋白表达量。 说 明 书 CN 102766648 A 9 1/9 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102766648 A 10 。

43、2/9 页 11 0003 序 列 表 CN 102766648 A 11 3/9 页 12 0004 序 列 表 CN 102766648 A 12 4/9 页 13 0005 序 列 表 CN 102766648 A 13 5/9 页 14 0006 序 列 表 CN 102766648 A 14 6/9 页 15 0007 序 列 表 CN 102766648 A 15 7/9 页 16 0008 序 列 表 CN 102766648 A 16 8/9 页 17 0009 序 列 表 CN 102766648 A 17 9/9 页 18 序 列 表 CN 102766648 A 18 1/3 页 19 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102766648 A 19 2/3 页 20 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102766648 A 20 3/3 页 21 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102766648 A 21 。