一种快速高效筛选L-精氨酸高产菌株的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102367468 A (43)申请公布日 2012.03.07 CN 102367468 A *CN102367468A* (21)申请号 201110289811.4 (22)申请日 2011.09.28 C12Q 1/04(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道 1800 号江南大学生物工程学院 (72)发明人 饶志明 许正宏 杨娟 徐美娟 窦文芳 (54) 发明名称 一种快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的方 法 (57) 摘要 本发明公。

2、开了一种快速高效筛选 L- 精氨酸 高产菌株的方法， 属于工业微生物育种技术领域。 传统的 L- 精氨酸高产菌株的筛选方法是通过筛 选抗 L- 精氨酸结构类似物的菌株。本发明构建 了一株大肠杆菌 L- 精氨酸缺陷型菌株作为 L- 精 氨酸分泌的指示菌， TTC(2， 3， 5- 氯化三苯基四氮 唑 ) 是一种活细胞指示剂， 它能被活细胞产生的 还原氢还原成红色。 将上述L-精氨酸缺陷型菌株 作为 L- 精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以 TTC 为显色剂实现 L- 精氨酸生产菌株胞外 L- 精 氨酸浓度高低的定性筛选， 在平板上初筛出合成 L- 精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株， 该方法 大大。

3、提高了菌种选育中的筛选效率而且节约了成 本。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 CN 102367476 A1/1 页 2 1. 一种快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的方法， 其特征在于构建一株大肠杆菌 BL21L- 精氨酸缺陷型菌株 将其作为 L- 精氨酸分泌的指示菌， 指示 L- 精氨酸生产菌株胞外 L- 精氨酸多少， 初筛 出 L- 精氨酸高产菌株。 2. 权利要求 1 所述的大肠杆菌 BL21L- 精氨酸缺陷型菌株构建方法如下 ： 在大肠杆菌中， L- 精氨酸合成途径中的 N- 乙酰谷。

4、氨酸激酶 argB 恰好位于精氨酸琥珀 酸酶 argH 的上游， 以下简称 argBH。以 E.coli BL21 基因组 DNA 为模板扩增 argBH 基因， 在 argH 内部插入卡那霉素抗性基因 (Kan)， 实现对 argH 的敲除从而获得该酶缺失的 L- 精氨 酸缺陷型大肠杆菌。 3. 权利要求 1 所述的快速筛选高产 L- 精氨酸菌株平板显色法的建立方法如下 ： 将权利要求 1 所述的 L- 精氨酸缺陷型菌株作为 L- 精氨酸分泌的指示菌通过交互共养 法以活细胞指示剂 TTC(2， 3， 5- 氯化三苯基四氮唑 ) 为显色剂实现钝齿棒杆菌胞外精氨酸 浓度高低的定性筛选， 在平板上。

5、筛选出合成 L- 精氨酸能力高或分泌性能较优型菌株。 权 利 要 求 书 CN 102367468 A CN 102367476 A1/4 页 3 一种快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于 L- 精氨酸缺陷型菌株， 快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的 方法， 属于工业微生物育种技术领域。 背景技术 0002 L- 精氨酸是人体和动物体内的半必需碱性氨基酸， 是合成蛋白质肌酸的重要原 料， 也是生物体尿素循环的一种重要中间代谢产物， 因此在医药和食品工业中具有广泛用 途。 0003 发酵法生产 L- 精氨酸是目前商业化生产比较有效和经济的方法， 而优。

6、良的 L- 精 氨酸高产菌株是发酵生产 L- 精氨酸的关键。目前 L- 精氨酸高产菌株的选育主要是通过传 统的诱变育种和现代基因工程育种获得， 其中基因工程育种因其目的性强， 工作量小而倍 受研究者们青睐， 而诱变育种获得的菌种生产性能往往较稳定， 因此仍在生产实践中广泛 运用。生产实践中还发现， 产 L- 精氨酸菌种在保存传代过程中， 生产性能会逐渐衰退， 产酸 和转化率会不断下降， 因此必须定期进行复壮， 即从衰退的菌株中， 通过分离、 纯化筛选出 未衰退的菌株， 这样才能保持菌株的高产性能， 不断满足生产需要。无论是用传统诱变、 用 现代基因工程手段对现有 L- 精氨酸高产菌株的改造， 。

7、还是高产菌株的复壮， 都需要从众多 的单菌株中挑选出高产菌株。所以， 高产 L- 精氨酸菌株的选育工作在 L- 精氨酸的发酵生 产中必不可少。传统的 L- 精氨酸高产菌株的筛选主要是通过筛选抗 L- 精氨酸结构类似物 菌株， 抗结构类似物抗性强的菌株其产量相应就会较高。但是， 由于 L- 精氨酸的结构类似 物种类较多且价格昂贵， 因此使得筛选工作强度大、 效率低且成本较高。 0004 本发明从另一角度出发， 建立了一种快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的平板显 色法。微生物中从 L- 谷氨酸合成 L- 精氨酸有 3 条途径 ： 线性途径、 循环途径及新发现的 利用氨甲酰基转移酶进行 L- 精氨。

8、酸生物合成的新途径， 大肠杆菌及古细菌主要以线性途 径合成 L- 精氨酸， 而酿酒酵母、 谷氨酸棒杆菌、 假单胞菌等微生物则以循环途径合成 L- 精 氨酸， 图 1。大肠杆菌中， L- 精氨酸合成途径中的 N- 乙酰谷氨酸激酶 argB 恰好位于精氨 酸琥珀酸酶 argH 的上游， 本发明通过敲除 argH 基因获得 L- 精氨酸缺陷型大肠杆菌， 以 E.coli BL21 基因组 DNA 为模板 PCR 获得 argBH 基因片段， 在 argH 内部插入卡那霉素抗性 基因 (Kan)， 实现对 argH 的敲除从而获得该酶缺失的 L- 精氨酸缺陷型大肠杆菌。将 L- 精 氨酸缺陷型菌株作为。

9、 L- 精氨酸分泌的指示菌通过交互共养法以 TTC 为显色剂实现钝齿棒 杆菌胞外精氨酸浓度高低的定性筛选， 在平板上初筛出合成 L- 精氨酸能力高或分泌性能 较优型菌株， 进而再通过摇瓶发酵复筛， 该方法大大提高了菌种选育中的筛选效率而且节 约了成本。因此， 本发明对筛选高产 L- 精氨酸菌株有着积极的作用。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种基于大肠杆菌 L- 精氨酸缺陷型菌株， 快速高效筛选 L- 精氨酸高产菌株的方法。 说 明 书 CN 102367468 A CN 102367476 A2/4 页 4 0006 本发明的技术方案 ： 首先构建大肠杆菌 BL21L- 精氨酸缺陷型。

10、菌株， 应用该菌株平 板显色法筛选 L- 精氨酸高产菌株。 0007 大肠杆菌 BL21L- 精氨酸缺陷型菌株构建方法如下 ： 0008 (1)argBH的扩增 ： 以E.coli BL21基因组DNA为模板， 用引物P15 -CGCGAATTCATG AATCCATTAATTATCAAACTGG-3 (EcoR I)、 P25 CGCGTCGACTTACCCTAACCGAGC CTGC-3 (Sal I) 扩增 argBH 基因， 扩增循环条件 ： 94预变性 5min， 94变性 40s， 56退火 90s， 72延伸 90s， 35 个循环。 0009 (2) 质粒 pMD-18T-ar。

11、gBH:Kan 的构建 ： PCR 获得的 argBH 基因片段电泳胶回收后 与 pMD-18T 载体 16过夜连接， 转化 E.coli JM109， 挑取阳性转化子并验证获得 E.coli JM109(pMD-18T-argBH)。将 T-Kan 用 EcoRV 酶切后胶回收其中大小约为 1.4kb 的包含 Kan 抗性基因的片段， 并将其与同样用EcoRV酶切后的T-argBH进行连接(EcoRV位点位于argH 内部 )， 转化 E.coli JM109， 挑取阳性转化子并验证获得 E.coli JM109(T-argBH:Kan)。 0010 (3)E.coliBL21 精氨酸缺陷型。

12、菌株的获得 ： 将质粒 T-argBH:Kan 以 EcoRI、 XhoI 酶切， 胶回收得到 argBH:Kan 片段。热击转化 E.coli BL21， 卡那霉素抗性平板上筛选阳 性转化子。将得到的阳性转化予分别点种于基本培养基 (MM) 平板和补充培养基 (SM) 平板 对比培养， 在 MM 平板上无法生长， 在添加了 L- 精氨酸的 SM 平板上正常生长的初步认为是 L-精氨酸缺陷菌株。 提取转化子的染色体DNA， 用argBH基因的引物扩增argBH:Kan， 验证 阳性转化子。由此获得 E.coli BL21L- 精氨酸缺陷型菌株。 0011 快速筛选高产 L- 精氨酸菌株平板显色。

13、法的建立 ： 0012 所述的快速筛选平板显色法用到的基本培养基 (g/L) ： 葡萄糖 10， (NH4)2SO43， KH2PO41， MgSO47H2O 0.5， FeSO47H2O 0.02， MnSO4H2O 0.02， 琼脂 20， 生物素 810-5， 硫 胺素 210-4， L- 组氨酸 510-4。pH 7.0 7.2， 1105Pa 灭菌 20min。 0013 所述的快速筛选平板显色法用到的补充培养基 (g/L) ： 基本培养基中以 20mg/L 添 加 L- 精氨酸， pH 7.0 7.2， 1105Pa 灭菌 20min。 0014 所述的快速筛选平板显色法用到的筛选。

14、培养基 ： 基本培养基中以 105个 /mL 细胞 浓度混入 E.coli BL21L- 精氨酸缺陷型菌株。 0015 所述的快速筛选平板显色法是在基本培养基中以105个/mL细胞浓度混入E.coli BL21L- 精氨酸缺陷型菌株制成筛选平板， 将本实验室保藏 L- 精氨酸产量不等的 4 株钝齿 棒杆菌以相同量点种至筛选平板， 30培养5-7d， 于超净工作台均匀喷洒无菌1g/mL TTC 溶液 ( 膜过滤除菌 )， 37放置 1-2h， 观察平板上显色情况。 0016 快速筛选高产 L- 精氨酸菌株平板显色法的应用 ： 0017 基本培养基中以 105个 /mL 细胞浓度混入 E.coli。

15、 BL21L- 精氨酸缺陷型菌株制成 筛选平板， 将待筛选的菌株制成一定浓度的菌悬液， 10 倍系列稀释涂布于该平板上， 30培 养 5-7d， 于超净工作台均匀喷洒无菌 1g/mL TTC 溶液 ( 膜过滤除菌 )， 37放置 1-2h， 观 察平板上显色情况。 0018 本发明的有益效果 ： 传统的 L- 精氨酸高产菌株的筛选方法是筛选抗 L- 精氨酸结 构类似物菌株， 本发明根据高产 L- 精氨酸菌株特点， 利用 L- 精氨酸缺陷型菌株与 L- 精氨 酸生产菌株之间的交互供养， 以 TTC 为显色剂， 间接直观、 快速筛选出 L- 精氨酸高产菌株， 大大提高了筛选工作效率并且节约了成本。。

16、 说 明 书 CN 102367468 A CN 102367476 A3/4 页 5 附图说明 0019 图 1 质粒 pMD-18T-argBH:Kan 的构建 0020 图 2 微生物 L- 精氨酸的合成途径 0021 图 3a argBH 基因的扩增 1 ： DNA/HindIII ； 2 ： argBH gene.3b T-EcargBH:Kan 酶切验证 1.DL2000 ； 2.T-EcargBH:Kan/EcoRI+SalI ； 3.T-EcargBH/EcoRV ； 4.T-EcargBH:Kan/EcoRV ； 5.T-EcargBH:Kan/EcoRI ； 6.DNA/H。

17、indIII 0022 图 4argBH 基 因 敲 除 转 化 子 的 PCR 鉴 定 1 5 ： argBH PCR of 1 5transformants6 7 ： kan PCRof 1 2transformants ； 8 ： HindIII Marker 0023 图 5L- 精氨酸产量不等的 4 株钝齿棒杆菌缺陷型菌株平板显色法结果 具体实施方式 0024 实施例 1 ： 卡那霉素抗性基因 (Kan) 插入大肠杆菌 BL21L- 精氨酸合成途径中精氨 酸琥珀酸酶基因内部实现敲除目的获得缺陷型菌株 ： 0025 argBH的扩增及质粒pMD-18T-argBH:Kan的构建 ： 根。

18、据GeneBank中公布的argBH 序列设计 PCR 获得 argBH 的引物 P15 -CGCGAATTCATGAATCCATTAATTATCAAACTGG-3 (EcoR I)P25 CGCGTCGAC TTACCCTAACCGAGCCTGC-3 (Sal I)。以 E.coli BL21 基因组 DNA 为模 板， 用引物 P1、 P2 扩增 argBH 基因， 扩增循环条件 ： 94预变性 5min， 94变性 40s， 56 退火 90s， 72延伸 90s， 35 个循环， 扩增产物通过 0.8琼脂糖凝胶电泳检测， 如图 3a 所 示， 可以看出在 2.2kb 处有一明亮的带， 。

19、这与 argBH 基因预期大小一致。PCR 获得的 argBH 基因片段电泳胶回收后与 pMD-18T 载体 16过夜连接， 转化 E.coli JM109， 得到 E.coli JM109(pMD-18T-argBH)。重组质粒 pMD-18T-argBH 用 EcoRV 酶切， 线性化后胶回收 4.7kb 的 T-argBH 片段， 将 T-Kan 用 EcoRV 酶切后胶回收其中大小约为 1.4kb 的包含 Kan 抗性基 因的片段， 并将其与同样用 EcoRV 酶切后的 T-argBH 进行连接， 得到 T-argBH:Kan， 酶切验 证结果见图 3b， 可以看到， 第三泳道质粒 T。

20、-EcargBH 以 EcoRV 酶切释放 4.7kb 大小的片段， 表明 T-EcargBH 构建成功， 第二泳道质粒 T-EcargBH:Kan 以 EcoRI、 SalI 双切释放 3.4kb 和 2.7kb 大小的片段， 第四泳道 T-EcargBH:Kan 以 EcoRV 酶切释放 4.7kb 和 1.4kb 大小的 片段， 表明 T-EcargBH:Kan 构建成功。 0026 E.coli BL21 精氨酸缺陷型菌株的获得 ： 将质粒 T-argBH:Kan 以 EcoRI、 XhoI 酶 切， 胶回收得到 argBH:Kan 片段。热击转化 E.coli BL21， 卡那霉素抗。

21、性平板上筛选阳性 转化子。将得到的阳性转化予分别点种于基本培养基 (MM) 平板和补充培养基 (SM) 平板 对比培养， 在 MM 平板上无法生长， 在添加了 L- 精氨酸的 SM 平板上正常生长的初步认为是 L-精氨酸缺陷菌株。 提取转化子的染色体DNA， 用argBH基因的引物扩增argBH:Kan， 验证 阳性转化子， 验证结果如图4所示 ： 阳性转化子的原argBH基因被含有Kan片段长度大约为 3.4kb的argBH:Kan替换， 而原始对照菌株argBH基因长度约2.2kb， 两者相差约1.2kb。 说 明阳性转化子已经成功的用 argBH:Kan 片段替换了原 argBH 基因，。

22、 达到了对 argH 基因敲 除的目的。 实施例2 ： 利用L-精氨酸缺陷型大肠杆菌， 以TTC为显色剂， 快速筛选高产L-精 氨酸菌株平板显色法的建立 ： 0027 基本培养基中以 105个 /mL 细胞浓度混入 E.coli BL21L- 精氨酸缺陷型菌株制成 说 明 书 CN 102367468 A CN 102367476 A4/4 页 6 筛选平板， 将本实验室保藏 L- 精氨酸产量不等的 4 株钝齿棒杆菌以相同量点种至筛选平 板， 30培养 5-7d， 于超净工作台均匀喷洒无菌 1g/mL TTC 溶液 ( 膜过滤除菌 )， 37放 置 1-2h， 观察平板上显色情况。如图 5 所。

23、示， 实验结果表明红色圈大小与菌株 L- 精氨酸产 量呈正比， 表明此方法用于筛选高产 L- 精氨酸突变株有效可行。 0028 实施例 3 ： 快速筛选高产 L- 精氨酸菌株平板显色法的应用 0029 基本培养基中以 105个 /mL 细胞浓度混入 E.coli BL21L- 精氨酸缺陷型菌株制成 筛选平板， 将待筛选的菌株制成一定浓度的菌悬液， 10 倍系列稀释涂布于该平板上， 30培 养 5-7d， 于超净工作台均匀喷洒无菌 1g/mL TTC 溶液 ( 膜过滤除菌 )， 37放置 1-2h， 观 察菌株生长情况。 说 明 书 CN 102367468 A CN 102367476 A1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 102367468 A CN 102367476 A2/3 页 8 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102367468 A CN 102367476 A3/3 页 9 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102367468 A 。