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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610101332.8 (22)申请日 2016.02.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105693772 A (43)申请公布日 2016.06.22 (73)专利权人 中国石油大学 （华东） 地址 266000 山东省青岛市经济技术开发 区长江西路66号 (72)发明人 孙亚伟王勃徐海曹美文 王继乾姬燕云王栋 (74)专利代理机构 青岛联信知识产权代理事务 所 37227 代理人 高洋 (51)Int.Cl. C07F 9/655(2006.01)。
2、 审查员 肖晶 (54)发明名称 一种化合物及其在DNA端基修饰中的应用 (57)摘要 本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种化 合物及其在DNA端基修饰中的应用， 通过简单的 还原和酯化等标准的有机单元反应， 以2-呋喃丙 酸为起始原料， 将其通过氢化铝锂还原为2-呋喃 丙醇， 并进一步将其与2-氰乙基-N,N-二异丙基 氯代亚磷酰胺反应得到2-氰乙基-N,N-二异丙 基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯。 该化合物具有较高的 反应活性和良好的底物适应性， 可直接用于DNA 自动合成仪上， 极大简化了DNA端基化的操作， 丰 富了DNA端基化试剂的种类， 是一类很有市场前 景的核酸端基修饰试剂。 权利要求。
3、书2页 说明书5页 附图4页 CN 105693772 B 2017.03.15 CN 105693772 B 1.式(1)化合物或其药物上可接受的盐， 式(1)化合物为： 2.一种如权利要求1所述的式(1)化合物的制备方法， 其特征在于， 以2-呋喃丙酸为起 始原料， 首先将其通过氢化铝锂还原为2-呋喃丙醇， 并进一步将其与2-氰乙基-N,N-二异丙 基氯代亚磷酰胺反应得到2-氰乙基-N,N-二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯。 3.根据权利要求2所述的式(1)化合物的制备方法， 其特征在于， 按照如下反应路线和 反应条件进行： 其中， a.氢化铝锂， 四氢呋喃， 80； b.2-氰乙基-N,N-。
4、二异丙基氯代亚磷酰胺， 三乙胺， 0。 4.根据权利要求2所述的式(1)化合物的制备方法， 其特征在于， 具体的步骤如下： 步骤a： 将2-呋喃丙酸加入到含有0.004g/mL氢化铝锂的无水四氢呋喃中的溶液， 反应 液在80搅拌下回流1小时， 反应结束后， 向冷却的反应液中滴加饱和氯化铵溶液， 待气泡 结束后滴加饱和碳酸钾溶液至沉淀完全， 滤除不溶物， 滤饼用四氢呋喃洗涤， 有机相以无水 硫酸钠干燥， 旋转蒸发有机相， 得到呋喃丙醇； 步骤b： 将同等质量的呋喃丙醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中， 冰浴搅拌下， 滴加 2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺， 反应于室温下搅拌2小时， 滤除不。
5、溶物， 滤液以饱和 碳酸氢钠溶液洗涤， 有机相无水硫酸钠干燥， 得到2-氰乙基-N,N-二异丙基-呋喃丙醇亚磷 酰胺酯。 5.一种如权利要求1所述的式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用。 6.一种呋喃基DNA端基修饰试剂， 其特征在于， 所述修饰试剂的有效成分为如权利要求 1所述的式(1)化合物或其药物上可接受的盐， 式(1)化合物为： 7.一种如权利要求6所述的呋喃基DNA端基修饰试剂的应用方法， 其特征在于， 步骤1： 将式(1)化合物溶于无水乙腈中， 氮气保护下转移至DNA合成仪的端基修饰位试 剂瓶中， 输入DNA序列， 执行合成。 步骤2： 合成完毕后将固相载体取出， 分散在1毫升2。
6、3氨水中， 55下密闭加热2小时， 权利要求书 1/2 页 2 CN 105693772 B 2 离心去除不溶物， 溶液浓缩即得到新合成的DNA序列。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105693772 B 3 一种化合物及其在DNA端基修饰中的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 特别涉及一种化合物及其在DNA端基修饰中的应用。 背景技术 0002 随着DNA技术的发展， 端基修饰的DNA在分子生物学、 分子检测以及生物材料的构 建等领域扮演着越来越重要的角色。 除了已经较为成熟的DNA氨基和巯基方法， 人们在不断 开发新的DNA端基化修饰技术和端基化修饰试剂， 来满足日益增。
7、长的科研及商业需求。 上世 纪90年代以来， 人们开始关注以呋喃作为DNA的端基/碱基修饰单元， 呋喃可与马来酰亚胺 在室温下高效地发生Diels-Alder环合反应， 为DNA的端基化修饰和负载提供了一种新的选 择； 此外， 呋喃在特定氧化剂的存在下可被氧化为二醛， 在研究DNA双链交联中有着重要的 应用。 0003 但是目前在DNA端基中引入呋喃的方法多局限于使用含有呋喃的羧酸与DNA端基 的氨基反应， 操作繁琐而且成本居高不下； 在糖环或碱基上引入呋喃单元则需要进行大量 的有机合成工作， 极大提高了使用成本。 发明内容 0004 本发明针对现有技术中的不足， 本发明提供一种新型的呋喃基亚。
8、膦酰亚胺酯， 可 直接应用于DNA合成仪， 实现了简单高效地在DNA5 端引入呋喃单元的目的。 0005 本发明的技术方案是： 0006 本发明公开式(1)化合物获其药物上可接受的盐， 式(1)化合物为： 0007 0008 式(1)化合物的制备方法以2-呋喃丙酸为起始原料， 首先将其通过氢化铝锂还原 为2-呋喃丙醇， 并进一步将其与2-氰乙基-N， N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应得到2-氰乙基- 二异丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯。 0009 按照如下反应路线和反应条件进行： 0010 0011 其中， a.氢化铝锂， 四氢呋喃， 80； b.2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺， 三 乙胺， 。
9、0。 说明书 1/5 页 4 CN 105693772 B 4 0012 具体的步骤如下： 0013 步骤a： 将2-呋喃丙酸于加入到含有0.004g/mL氢化铝锂的无水四氢呋喃中的溶 液， 反应液在80搅拌下回流1小时， 反应结束后， 向冷却的反应液中滴加饱和氯化铵溶液， 待气泡结束后滴加饱和碳酸钾溶液至沉淀完全， 滤除不溶物， 滤饼用四氢呋喃洗涤， 有机相 以无水硫酸钠干燥， 旋转蒸发有机相， 得到呋喃丙醇； 0014 步骤b： 将同等质量的呋喃丙醇和无水三乙胺溶于无水四氢呋喃中， 冰浴搅拌下， 滴加2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺， 反应于室温下搅拌2小时， 滤除不溶物， 滤液以。
10、 饱和碳酸氢钠溶液洗涤， 有机相无水硫酸钠干燥， 得到2-氰乙基-N， N-二异丙基-呋喃丙醇 亚磷酰胺酯。 0015 本发明的另一个目的在于公开式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用。 0016 本发明的第三个目的在于公开一种呋喃基DNA端基修饰试剂， 其特征在于， 所述修 饰试剂的有效成为式(1)化合物获其药物上可接受的盐， 式(1)化合物为： 0017 0018 本发明的第四个目的在于公开上述呋喃基DNA端基修饰试剂的应用的方法， 其特 征在于， 0019 步骤1： 将式(1)化合物溶于无水乙腈中， 氮气保护下转移至DNA合成仪的端基修饰 位试剂瓶中， 输入DNA序列， 执行合成。 00。
11、20 步骤2： 合成完毕后将固相载体取出， 分散在1毫升23氨水中， 55下密闭加热2 小时， 离心去除不溶物， 溶液浓缩即得到新合成的DNA序列。 0021 本发明的有益效果是： 0022 1、 本发明设计合成的化合物(1)可以通过简单的有机单元反应制备得到， 合成步 骤中没有副反应出现； 并且可以直接用于DNA合成仪上， 极大简化了修饰步骤； 操作简便， 成 本低廉， 具有较好的底物适应性。 0023 2、 本发明所述的DNA端基修饰试剂具有较高的反应活性和良好的底物适应性， 是 一类很有市场前景的核酸端基修饰试剂。 附图说明 0024 附图1为式(1)化合物的核磁共振氢谱； 0025 附。
12、图2为式(1)化合物的核磁共振碳谱； 0026 附图3为式(1)化合物的质谱图； 0027 附图4为未修饰的DNA质谱图； 0028 附图5为5 端修饰有呋喃基团的DNA质谱； 0029 附图6为未修饰DNA的HPLC谱图； 0030 附图7为5 端修饰有呋喃基团的HPLC谱图。 说明书 2/5 页 5 CN 105693772 B 5 具体实施方式 0031 本发明的具体实施方式如下： 0032 1、 式(1)化合物合成： 0033 0034 a.氢化铝锂， 四氢呋喃， 80； b.2-氰乙基-N， N-二异丙基氯代亚磷酰胺， 三乙胺， 0 。 0035 步骤a： 0.8克氢化铝锂溶于200。
13、毫升无水四氢呋喃中， 冰浴搅拌下一次性加入2.8 克2-呋喃丙酸于20毫升无水四氢呋喃中的溶液， 反应液在80搅拌下回流1小时。 反应结束 后， 向冷却的反应液中滴加4毫升饱和氯化铵溶液， 待气泡结束后滴加饱和碳酸钾溶液至沉 淀完全， 滤除不溶物， 滤饼用50毫升四氢呋喃洗涤， 有机相以无水硫酸钠干燥。 旋转蒸发有 机相， 得到2.4克呋喃丙醇(淡黄色油状液体)， 收率94； 0036 步骤b： 1.2克呋喃丙醇和1.2克无水三乙胺溶于50毫升无水四氢呋喃中， 冰浴搅拌 下滴加2.4克2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺。 反应于室温下搅拌2小时， 滤除不溶 物， 滤液以饱和碳酸氢钠溶液洗。
14、涤。 有机相无水硫酸钠干燥。 得到2.0克2-氰乙基-N,N-二异 丙基-呋喃丙醇亚磷酰胺酯(式1化合物)(黄色粘稠液体)， 收率66。 0037 本发明的对得到的化合物进行了结构鉴定， 其检测结果见图1-3， 核磁共振氢谱， 碳谱及质谱图。 0038 1H-NMR(CDCl3) ,400MHz:7.30(s,1H,ArH) ,6.27(s,1H,ArH) ,6.00(d,1H,ArH) , 3.84-3.86(m,2H,CH2OP),3.84-3.86(m,4H,CH2O+CHN),3.64-3.67(t,J4.0Hz,2H,CH2O), 2.70-2.74(t,J8.0Hz,2H,ArCH。
15、2),2.60-2.63(t,J8.0Hz,2H,CH2CN),1.95-1.97(t,J 4.0Hz,2H,CH2),1.17-1.26(m,12H,CH3) 0039 13C-NMR(CDCl3),100MHz:155.47,140.97,111.62,110.12,105.19,62.63,62.28, 58.40,58.21,43.09,42.96,29.63,24.58,20.24. 0040 ESI-MS:Chemical Formula:C16H27N2O3P,calc 326.1759,detec 326.1920(M+H+), 345.20(M+H+NH4+) 0041 综合。
16、以上分析， 最终将式1化合物的结构鉴定为2-氰乙基-N,N-二异丙基-呋喃丙 醇亚磷酰胺酯， 结构如式(1)所示， 为一个新的含有呋喃基团亚膦酰亚胺酯。 0042 0043 Chemical Formula:C16H27N2O3P 0044 Exact Mass:326.1759 0045 Molecular Weight:326.3709 0046 2、 式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用 说明书 3/5 页 6 CN 105693772 B 6 0047 0048 步骤1： 540毫克式(1)化合物溶于10毫升无水乙腈中， 氮气保护下转移至ABI 3400DNA合成仪的端基修饰位试剂瓶。
17、中。 输入DNA序列： 5 CCT AGA TTC AGT TCA ACT TG 3 ， 执行1 mol量级的合成。 0049 步骤2： 合成完毕后将固相载体取出， 分散在1毫升23氨水中， 55下密闭加热2 小时， 离心去除不溶物， 溶液浓缩即得到粗产物。 目标产物通过高效液相分离， 并通过ESI- MS进行结构信息表征。 0050 表1.式(1)化合物在DNA端基修饰中的应用 0051 样品计算分子量(g/mole)实测分子量(g/mole)DNA质谱图 DNA60676065附图4 Furan-Modified-DNA62546253附图5 0052 所有有机分子的结构和纯度均由核磁共振。
18、氢谱来确定， DNA的结构信息由电喷雾 解离质谱来确定， 反应效率由高效液相色谱来确定。 0053 核磁型号为Bruker AMX 400Spectrometer(500MHz)， 质谱型号为Agilent 6510Q- TOF， 高效液相色谱型号为Waters 2695， 检测柱型号为XBriage Oligonucleotides BEH C18(2.1mm50mm； Column2.5um)， 淋洗条件如下： 0054 0055 如图6所示， 未修饰DNA的HPLC谱图， 出峰时间为10.317分钟； 0056 如图7所示， 经过本发明的式(1)化合物修饰后的DNA的HPLC谱图， 出峰。
19、时间为 14.245分钟。 0057 综上可知， 式(1)化合物应用于DNA的5 端修饰中， 取得了良好的效果。 实验表明该 DNA端基修饰试剂具有较高的反应活性和良好的底物适应性， 是一类很有市场前景的核酸 说明书 4/5 页 7 CN 105693772 B 7 端基修饰试剂。 说明书 5/5 页 8 CN 105693772 B 8 图1 图2 说明书附图 1/4 页 9 CN 105693772 B 9 图3 图4 说明书附图 2/4 页 10 CN 105693772 B 10 图5 图6 说明书附图 3/4 页 11 CN 105693772 B 11 图7 说明书附图 4/4 页 12 CN 105693772 B 12 。