一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410218251.7 (22)申请日 2014.05.22 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103980347 A (43)申请公布日 2014.08.13 (73)专利权人 浙江海洋学院 地址 316022 浙江省舟山市临城街道长峙 岛海大南路1号 (72)发明人 迟长凤王斌陈荫胡发远 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 代理人 吴秉中 (51)Int.Cl. C07K 5/103(2006.01) C07K 1/30(2。

2、006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/16(2006.01) C12P 21/06(2006.01) A61P 9/12(2006.01) A23L 33/18(2016.01) 审查员 刘俊 (54)发明名称 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用 途 (57)摘要 本发明公开了一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其 制备方法和用途， 该降压肽的氨基酸序列为Leu- Arg-Pro-Ile （SEQIDNo： 1） ， ESI-MS检测给出分 子量为497.65Da （M+H+498.48Da） 。 制。

3、备时 蒸馏水洗净大黄鱼鱼鳔， 用高速组织捣碎机匀 浆， 用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液抽提， 硫酸铵分级 沉淀得粗蛋白； 粗蛋白经胰蛋白酶和碱性蛋白酶 依次酶解， 酶解物经离心、 超滤和色谱精制， 得到 降压肽。 本发明降压肽的制备工艺科学合理， 双 酶酶解过程易于控制， 制备的降压肽对血管紧张 素转化酶 （ACE） 具有显著的抑制作用， 且具有易 于消化吸收和安全无毒副作用等优点， 可用作药 物和保健食品。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 103980347 B 2017.05.17 CN 103980347 B 1.一种大黄鱼鱼鳔蛋白降压肽的制备方法， 其特。

4、征在于包括以下步骤： 1） 大黄鱼鱼鳔洗净、 破碎匀浆， 按料液比1g:810 ml的比例加入浓度0.2mol/L， pH 7.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液， 于 04 下振荡抽提2448 h， 以800012000rpm的转速 离心1525 min， 得上清液； 上清液中加入硫酸铵， 使硫酸铵浓度达到30%， 静置13 h后， 以800012000rpm的转速离心1525 min， 去除沉淀物， 上清液中继续加入硫酸铵， 使其浓 度达到60%， 静置13 h后， 以800012000rpm的转速离心1525 min， 得沉淀物， 并置于透 析袋中用蒸馏水透析1824 h， 透析液。

5、冷冻干燥， 得鱼鳔粗蛋白； 2） 取鱼鳔粗蛋白， 按照料液比1 g:1520 mL加入双蒸水， 调节pH 值至7.58.0， 于35 40保温1015 min； 按照鱼鳔湿重的1.01.5%加入第一种蛋白酶， 于3540温度下酶解3 5 h； 酶解液调pH 值至9.010.0， 于4050保温1015 min； 按照鱼鳔湿重的1.01.5%加 入第二种蛋白酶， 于4050温度下酶解24 h； 3） 将酶解液加热到9095灭活1015 min， 45005000 rpm离心1520 min， 取上清液； 上清液依次经超滤和层析， 得到降压肽； 该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile。

6、 （SEQ ID No： 1） ， 分子量为497.65 Da； 所述步骤2） 中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶， 酶活力1.85105 U/g； 所述步骤2） 中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶， 酶活力1.90105 U/g。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于所述步骤3） 的超滤和层析的具体过程 为： 超滤： 将上清液调至pH 6.57.5， 于0.10 0.15 MPa的工作压力和2530的工作温 度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理， 收集分子量小于1 kDa部分， 得超滤酶解物； 层析： 将上述超滤酶解物用双蒸水配成1015 mg/mL的溶液， 经过大孔树脂分离， 用双 蒸水、 。

7、25%乙醇、 50%乙醇、 75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱， 分别收集相应梯度的洗脱溶液， 干 燥， 得四个组分， 其中， ACE抑制活最强组分为大孔树脂纯化酶解物； 将上述大孔树脂酶解物 用双蒸水配成1015 mg/mL的溶液， 经过凝胶柱层析分离， 用双蒸水进行洗脱， 根据220 nm 下的吸光度曲线收集洗脱组分， 其中， ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物， 将上述凝胶 层析酶解物用双蒸水配成80100 g/mL的溶液， 利用反相高效液相色谱进行纯化， 根据ACE 抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 。 3.根据权利要求2所述的制备方。

8、法， 其特征在于所述大孔树脂为DA 201-C， 所述凝胶为 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20； 所述RP-HPLC条件为： 进样量1520 L； 色谱柱为Waters Spherisorb ODS-2 C18； 柱温为2530 ； 流动相： A含0.1%三氟乙酸的水和B乙腈； 梯度洗 脱： 010 min乙腈浓度为10%； 1140 min乙腈浓度从10匀速升至60%； 洗脱速度0.81.0 mL/ min； 紫外检测波长220 nm。 4.一种权利要求1中所述的大黄鱼鱼鳔降压肽的应用， 其特征在于Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 用于制备保健食品的用途。 。

9、权利要求书 1/1 页 2 CN 103980347 B 2 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途 技术领域 0001 本发明涉及一种鱼类活性肽及其制备方法和用途， 尤其涉及一种大黄鱼鱼鳔降压 肽及其制备方法和用途。 背景技术 0002 人体血压受多种因素的调节， 其中最重要的因素是升压系统 （肾素血管紧张素 系统， RAS)和降压系统 （激肽释放酶激肽系统， KKS)之间的平衡。 而血管紧张素转化酶 （ACE） 是影响升压系统和降压系统平衡的重要因素。 ACE主要通过三种方式升高人体血压： （1） 将无活性的血管紧张素I （AngI） 碳端的His-Leu切除， 使血管紧张素I转换为具有很。

10、强血 管收缩活性的血管紧张素 （Ang） ， 引起血压升高；（2） 使KKS系统中的降血压物质缓激肽 失活， 导致血压升高；（3） 通过刺激肾上腺皮质释放醛固酮， 减少肾脏对水分和盐的排泄， 增 加了细胞外液量和血浆量， 加大静脉回流量， 间接引起血压升高。 因此， 如果抑制了ACE的活 性， 就可能有效防治高血压。 0003 降血压肽 （ACEIP） ， 又称为ACE抑制肽， 可通过酶解食源蛋白获得， 其突出优点是只 对高血压患者起到降压作用， 对血压正常者无降压作用， 不会有降压过度现象发生。 除降压 功能， ACEIP食用安全性高， 较化学降压药物 （如赖诺普利、 培哚普利等） 副作用小。

11、， 还具有易 消化吸收、 免疫促进， 抗凝血和抗肿瘤等功能。 基于食源蛋白降压肽具有的独特优点， 已成 为目前研究的热点。 0004 但是， 申请人研究发现， 以大黄鱼鱼鳔为原料， 利用酶解技术制备大黄鱼鱼鳔降压 酶解产物的工艺研究处于空白阶段， 而以鱼鳔酶解产物为材料制备降压肽及其应用更是未 见报道。 发明内容 0005 本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种大黄鱼鱼鳔 降压肽， 该降压肽降压作用强、 安全无毒副作用， 易于消化吸收。 0006 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法， 该 工艺科学合理。 0007 本发明所要解决的第三个技术问。

12、题是提供一种大黄鱼鱼鳔降压肽的应用。 0008 本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为： 一种大黄鱼鱼鳔降压 肽， 其特征在于该降压肽的氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） ， ESI-MS检测给 出分子量为m/z 497.65 Da （M+H+ 498.48 Da） 。 0009 本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为： 一种大黄鱼鱼鳔降压肽 的制备方法， 其特征在于包括以下步骤： 0010 1） 大黄鱼鱼鳔蒸馏水洗净、 破碎匀浆， 按料液比1g:810 ml的比例加入NaH2PO4- Na2HPO4缓冲液 （0.2mol/L， pH 。

13、7.0） ， 于 04 下振荡抽提2448 h， 以800012000 rpm 的转速离心1525 min， 得上清液； 上清液中加入硫酸铵， 使硫酸铵浓度 （重量/体积百分 说明书 1/4 页 3 CN 103980347 B 3 比） 达到30%， 静置13 h后， 以800012000rpm的转速离心1525 min， 去除沉淀物， 上清 液中继续加入硫酸铵， 使其浓度达到60% （重量/体积百分比） ， 静置13 h后， 以8000 12000 rpm的转速离心1525 min， 得沉淀物并置于透析袋中用蒸馏水透析1824 h， 透析 液冷冻干燥， 得鱼鳔粗蛋白； 0011 2） 取鱼。

14、鳔粗蛋白， 按照料液比1 g:1520 mL加入双蒸水， 调节pH值至7.58.0， 于 3540保温1015 min； 按照鱼鳔湿重的1.01.5%加入第一种蛋白酶， 于3540温度下酶 解35 h； 酶解液调pH值至9.010.0， 于4050保温1015 min； 按照鱼鳔湿重的1.01.5% 加入第二种蛋白酶， 于4050温度下酶解24 h； 0012 3） 将酶解液加热到9095灭活1015 min， 45005000 rpm离心1520 min， 取上 清液； 上清液依次经超滤和层析， 得到降压肽。 0013 作为优选， 所述步骤2） 中的第一种蛋白酶为胰蛋白酶， 酶活力1.851。

15、05 U/g。 0014 作为优选， 所述步骤2） 中的第二种蛋白酶为碱性蛋白酶， 酶活力1.90105 U/ g。 0015 作为改进， 所述步骤3） 的超滤和层析的具体过程为： 0016 超滤： 将上清液调至pH 6.57.5， 于0.120.15 MPa的工作压力和2530 的工作 温度下采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理， 收集分子量小于1 kDa组分， 得超滤酶解液； 0017 层析： 将上述超滤酶解液用双蒸水配成1015 mg/mL的溶液， 经过大孔树脂分离， 用双蒸水、 25%乙醇、 50%乙醇、 75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱， 分别收集相应梯度的洗脱溶液， 干燥， 得四个组分。

16、； 其中， ACE抑制活性最强组分为大孔树脂纯化酶解物； 将上述大孔树脂酶 解物用双蒸水配成1015 mg/mL的溶液， 经过凝胶柱层析分离， 用双蒸水进行洗脱， 根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分， 其中， ACE抑制活最强组分为凝胶层析酶解物， 将上述凝 胶层析酶解物用双蒸水配成80100 g/mL的溶液， 利用反相高效液相色谱 （RP-HPLC） 进行 纯化， 根据ACE抑制活性得1个高活性降压肽Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 。 0018 优选， 所述大孔树脂为DA 201-C， 所述凝胶为Sephadex LH-20。 0019 再优选， 所述反。

17、相高效液相色谱条件为： 进样量1520L； 色谱柱为Waters Spherisorb ODS-2 C18； 柱温为2530 ； 流动相： A水 （含0.1%三氟乙酸） 和B乙腈； 梯度洗 脱： 010 min乙腈浓度为10%； 1140 min乙腈浓度从10匀速升至60%； 洗脱速度0.81.0 mL/ min； 紫外检测波长220 nm。 0020 本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为： 一种大黄鱼鱼鳔降压肽 的应用， 其特征在于大黄鱼鱼鳔降压肽Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 对ACE具有显著的 抑制作用， 可用作降压药品和保健食品。 0021 与。

18、现有技术相比， 本发明的优点在于：（1） 本发明采用的原料是大黄鱼鱼鳔， 经过 本发明的技术转化可有效提高大黄鱼的加工附加值， 对大黄鱼产业的可持续发展具有重要 意义；（2） 本发明选用胰蛋白酶和碱性蛋白酶作为酶解用酶， 通过生物酶解法同时融合超滤 分级和色谱精制， 使降压肽最大程度地释放； 制备的降压肽是鱼鳔蛋白经酶水解制得， 安 全、 无毒副作用， 并且抑制ACE作用显著， 可用作降压药品和保健食品。 附图说明 0022 图1是本发明的大孔树脂分离组分 （F2） 的凝胶Sephadex LH-20层析图； 说明书 2/4 页 4 CN 103980347 B 4 0023 图2 是本发明的。

19、Sephadex LH-20凝胶制备酶解物 （F23） 的RP-HPLC图； 0024 图3是本发明的降压肽Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 的RP-HPLC图； 0025 图4是本发明的Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 的质谱 （ESI-MS） 图和结构式。 具体实施方式 0026 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。 0027 实施例1： 一种大黄鱼鱼鳔降压肽的制备方法， 制备工艺流程如下： 大黄鱼鱼鳔组 织捣碎缓冲液提取粗蛋白双酶酶解酶解物超滤大孔树脂分段凝胶过滤层析高效液 相色谱制备降压肽。 0028 1） 大黄鱼鱼鳔洗净、 。

20、破碎匀浆， 按料液比1g:10 ml的比例加入NaH2PO4-Na2HPO4缓 冲液 （0.2mol/L， pH 7.0） ， 于 4 下振荡抽提48 h， 以12000rpm的转速离心15 min， 得上清 液； 上清液中加入硫酸铵， 使硫酸铵浓度 （重量/体积百分比） 达到30%， 静置1 h后， 以12000 rpm的转速离心15 min， 去除沉淀物， 上清液中继续加入硫酸铵， 使其浓度达到60% （重量/体 积百分比） ， 静置2 h后， 以12000rpm的转速离心15 min， 得沉淀物并置于透析袋中用蒸馏水 透析24 h， 透析液冷冻干燥， 得鱼鳔粗蛋白； 0029 2） 取鱼。

21、鳔粗蛋白， 按照料液比1 g: 20 mL加入双蒸水， 调节pH值至8.0， 于35保 温10 min； 按照鱼鳔湿重的1.0 %加入胰蛋白酶， 于35 温度下酶解4 h； 酶解液调pH值至 9.5， 于45保温10 min； 按照鱼鳔湿重的1.5%加入碱性蛋白酶， 于45酶解3 h； 0030 3） 将酶解液加热到90 灭活15 min， 5000rpm离心20 min， 取上清液； 上清液依次 经超滤和层析， 得到降压肽。 0031 超滤： 将酶解上清液调至pH 7.0， 于0.12 MPa的工作压力和30 的工作温度下 采用1 kDa的超滤膜进行超滤处理， 收集分子量小于1 kDa部分，。

22、 得超滤酶解液； 0032 DA 201-C大孔树脂分段： 将上述超滤酶解液用双蒸水配成1015 mg/mL的溶液， 经过DA 201-C大孔树脂分离， 用双蒸水、 25%乙醇、 50%乙醇、 75%乙醇和90%乙醇梯度洗脱， 分 别收集相应梯度的洗脱溶液， 干燥， 得四个组分 （F1-F4） ， 其中， 50%乙醇洗脱组分的ACE抑制 活性最强， 记为大孔树脂纯化酶解物(F2)； 0033 Sephadex LH-20凝胶层析： 将上述大孔树脂纯化酶解物(F2)用双蒸水配成15 mg/mL的溶液， 经过Sephadex LH-20凝胶柱层析分离， 用双蒸水进行洗脱， 根据220 nm下的 吸。

23、光度曲线收集洗脱组分， 其中， ACE抑制活性最强组分为凝胶层析酶解物 （F23） （图1） 。 0034 表1大黄鱼鱼鳔蛋白制备降压肽时各制备组分的ACE抑制活性 （n = 3） 0035 制备方法EC50 （mg/mL） 粗蛋白酶解物1.4570.023 超滤分段组分 （MW 1 kDa）0.5720.013 DA201-C大孔树脂分段组分F2 （50%乙醇洗脱组分）0.1030.009 凝胶纯化组分F230.0780.003 Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1）0.0240.0001 0036 高效液相色谱精制： 将上述凝胶制备酶解物 （F23） 用双蒸水配成50。

24、 g/mL的溶 液， 利用反相高效液相色谱 （RP-HPLC） 进行纯化 （条件： 进样量1520 L； 色谱柱为Waters 说明书 3/4 页 5 CN 103980347 B 5 Spherisorb ODS-2 C18； 柱温为30 ； 流动相： A水 （含0.1%三氟乙酸） 和B乙腈； 梯度洗脱： 0 10 min乙腈浓度为10%； 1140 min乙腈浓度从10匀速升至60%； 洗脱速度0.8 mL/min； 紫外 检测波长220 nm） ， 根据ACE抑制活性得1个高活性降压肽 （见图2） 。 0037 结构检测： 收集ACE抑制活性最高的1个降压肽经检测为单一峰 （见图3） ，。

25、 利用蛋 白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） ， ESI-MS检测给出 分子量为m/z 497.65 Da （M+H+ 498.48 Da） （见图4） 。 0038 将上述制得的大黄鱼鱼鳔降压肽Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 进行ACE抑制活 性实验。 实验结果表明： Leu-Arg-Pro-Ile （SEQ ID No： 1） 对ACE具有显著的抑制活性 （EC50 0.0240.0001） 。 0039 最后， 尚需注意的是， 以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。 显然， 本发明不 限于以上实施例。

26、， 还可以有许多变形。 本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形， 均应认为是本发明的保护范围。 说明书 4/4 页 6 CN 103980347 B 6 0001 SEQUENCE LISTING 0002 浙江海洋学院 0003 一种大黄鱼鱼鳔降压肽及其制备方法和用途 0004 2014 0005 1 0006 PatentIn version 3.3 0007 1 0008 4 0009 PRT 0010 人工序列 0011 1 0012 Leu Arg Pro Ile 0013 1 序列表 1/1 页 7 CN 103980347 B 7 图1 图2 说明书附图 1/2 页 8 CN 103980347 B 8 图3 图4 说明书附图 2/2 页 9 CN 103980347 B 9 。