技术领域
本发明涉及一种糖基蒽醌类化合物及其用途，具体地说，涉及一种含三氮唑偶联糖基的 蒽醌类化合物及其石墨烯电化学生物传感器的构建。
背景技术
糖-凝集素(即含有糖识别区域的蛋白质)间的相互识别作用被认为是众多细胞生理学及 病理学过程的基础，如信号传导、细胞黏附、受精、增殖、分化、免疫应答、细菌入侵、病 毒感染和肿瘤转移。对于这些动态历程的精确捕捉是现今“糖组学”研究的热点，而对于糖 组学的解疑可大幅提升人类对于自然界以及自身的认知并促进如肿瘤、艾滋病疫苗和糖类先 导药物的发展。
现有对于糖-凝集素特异识别的手段主要基于对糖分子的化学修饰使其可被固载化至经特 殊处理的固体表面、呈现拟细胞形态的“天线”簇集状分布形态，从而以高亲合力与特异的、 经荧光标记的凝集素响应，并通过荧光光谱学手段表征其识别行为。然而，这些技术普遍具 有合成及固载化修饰繁复、检测仪器设备昂贵等缺陷，且对于蛋白质分子的光标记这一额外 工作也有可能导致其本身生物功能特性的改变。
发明内容
本发明的发明人经广泛及深入的研究，设计并合成了系列含三氮唑偶联糖基的蒽醌类化 合物，且发现该系列含三氮唑偶联糖基的蒽醌类化合物中蒽醌基团不但作为标记糖的电化学 报告基团，还可作为可与氧化石墨烯(GO)通过π-π用进行堆叠的芳香稠环。即在氧化石 墨烯π-堆叠效应诱导下的丝网印刷电极(SPE)自组装，构建含电化学标记团的糖基化SPE， (用于以电化学传感方式检测凝集素)。
本发明的一个目的在于，提供一种含三氮唑偶联糖基的蒽醌类化合物，所述的蒽醌类化 合物具有式I所示结构：
式I中，R1和R2分别独立选自氢(H)或式II所示基团中一种，且R1和R2不同时为H；
其中，R3为有乙酰基缩写为Ac)保护或没有乙酰基保护的单糖基团(所述单糖基团包括：葡萄糖基团(Glc-)、半乳糖基团(Gal-)、甘露糖基团(Man-)、乙酰氨基葡萄糖基团(GlcNAc-)、乙酰氨基半乳糖基团(GlcNAc-)、岩藻糖基团(Fuc-)或唾液酸基团(Sia-))，其结构如式IIIa～IIIg所示：
式IIIa～IIIg中，R4为H或Ac。
本发明的另一个目的在于，揭示上述蒽醌类化合物(式I所示化合物)的一种用途，即 式I所示化合物在制备检测凝集素电化学传感器中的应用。
此外，本发明还提供一种制备式I所示化合物的方法，所述方法的主要步骤是：在有抗 坏血酸钠和CuSO4·5H2O存在、及室温(15℃～35℃，下同)和搅拌条件下，首先由乙酰基 保护的1-叠氮1-脱氧的上述各种单糖(R3-N3)与含单丙炔基(式IV所示化合物)或双丙炔 基(式V所示化合物)的蒽醌类化合物于干燥有机溶剂中反应，得到三氮唑基偶联乙酰基糖- 醌复合物的中间体；然后将所得中间体溶解于有机溶剂中，加入过量三乙胺，70℃搅拌至少 3个小时，经纯化得到目标产物(式I所示化合物)；
其中，所述由乙酰基保护的1-叠氮1-脱氧的各种单糖化合物(R3-N3)可经由各种乙酰化 单糖的经典端基溴化及叠氮取代制得，具体步骤参见AlvarezS.G.&Alvarez，M.T.Synthesis， 1997，413-414；式IV或式V所示化合物由1-羟基蒽醌或1，8-二羟基蒽醌与溴丙炔在碱性条件 下的WilliamsonO-烷基化反应制备，具体Williamson法参见He，X.-P.etal.NewJ.Chem.，2011， 35，622-631。
附图说明
图1为GO及化合物IA和IB与GO堆叠后的原子力显微镜图像
其中a为GO的原子力显微镜图像；b为GO与化合物IA堆叠后的原子力显微镜图像； c为GO与化合物IB堆叠后的原子力显微镜图像
图2为GO及化合物IA和IB与GO堆叠后的拉曼光谱与红外光谱
其中a1为GO的拉曼光谱；a2为GO与化合物IA堆叠后的拉曼光谱；a3为GO与化合 物IB叠后的拉曼光谱；b1为GO的红外光谱；b2为GO与化合物IA堆叠后的红外光谱； b3为GO与化合物IB堆叠后的红外光谱。
图3为化合物IA和IB在不同扫速下的循环伏安图
其中a为化合物IA的循环伏安图；b为化合物IA的循环伏安图
图4为应用示差脉冲伏安(DPV)检测化合物IA和IB经由GO堆叠搭建的SPE对于 特异或非特异凝集素的电化学传感
其中a为不同浓度花生凝集素存在时含化合物IA传感器的DPV电流改变；b为不同浓 度花生凝集素存在时含化合物IB传感器的DPV电流改变；c不同特异或非特异凝集素存在 时含化合物IA和化合物IB传感器的DPV电流淬灭效率
图5为应用DPV检测化合物IA经由GO堆叠搭建的SPE对于Hep-G2肝癌细胞系的电 化学传感
其中a为不同浓度野生Hep-G2细胞存在时含化合物IA传感器的DPV电流改变；b为 Hep-G2表面ASGP-R1受体的敲除效率；c为不同浓度对照组Hep-G2细胞存在时含化合物IA 传感器的DPV电流改变；d为不同浓度ASGP-R1受体部分敲除Hep-G2细胞存在时含化合物 IA传感器的DPV电流改变
图6为使用所制备糖基蒽醌化合物经由氧化石墨烯的π-堆叠效应在SPE上构建生物传感 器，并应用DPV检测野生型(表面ASGP-R受体不敲除)或部分敲除ASGP-R受体的Hep-G2 肝癌细胞的示意图。
具体实施方式
下面通过实施例及说明书附图对本发明作进一步阐述，其目的仅在于更好理解本发明的 内容。因此，所举之例不限制本发明的保护范围。
实施例1
式IA所示化合物(简记为化合物IA，下同)的制备：
(1)化合物VII的制备：
将化合物VI(253mg，0.68mmol)和化合物V(94.2mg，0.34mmol)溶于10mLCH2Cl2中，依次加入水(10mL)、CuSO4·5H2O(4当量)和L-抗坏血酸钠盐(6当量)，室温下搅 拌过夜。TLC显示初始物基本消失，且反应液上层呈绿色，下层呈棕黄色，混合液用CH2Cl2稀释，水洗，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱层析分离提纯(乙酸乙酯∶石 油醚＝3∶1，V/V)，得到淡黄色针状晶体(化合物VII，193mg，52％)，Rf＝0.27(乙酸乙酯∶ 石油醚＝3∶1，V/V)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ＝8.20(s，2H)，7.90(d，J＝7.6Hz，2H)，7.64(t，J＝8.0Hz，2H)， 7.46(d，J＝8.4Hz，2H)，6.04(d，J＝9.2Hz，2H)，5.67(t，J＝9.6Hz，2H)，5.56(d，J＝3.2Hz，2H)， 5.45(m，4H)，5.36(dd，J＝3.6，10.4Hz，2H)，3.45(t，J＝6.8Hz，2H)，4.22-4.13(m，4H)，2.22，2.03， 2.01，1.82(4S，24H)；
13CNMR(100MHz，CDCl3)：δ＝183.5，182.4，170.3，170.1，170.0，168.8，157.8，144.3，134.8， 134.0，124.8，122.9，121.3，120.2，86.0，73.8，70.8，67.9，67.0，63.8，61.2，20.7，20.6，20.5，20.2；
HR-ESI-MS：calcd.for[C48H50N6O22+Na]+1085.2867，found1085.2864.
(2)目标化合物(化合物IA)的制备：
将化合物VII(100mg，0.09mmol)溶于甲醇(10mL)中，加热至80℃，待化合物溶解 后加入水和过量三乙胺并于80℃下回流反应3小时。TLC检测反应结束，液减压蒸馏除去 溶剂，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶乙醇＝5∶1，V/V)，得到淡黄色针状晶体(化合物IA， 33mg，49％)。Rf＝0.32(乙酸乙酯∶乙醇＝5∶1，V/V).
1HNMR(400MHz，D2O，90℃)：δ＝8.74(s，1H)，8.13-8.06(m，4H)，7.96(d，J＝7.6Hz，2H)， 6.07(d，J＝9.2Hz，2H)，5.82(brs，4H)，4.74-4.59(m，2H)，4.49(d，J＝3.2Hz，2H)，4.37(t，J＝6.4 Hz，2H)，4.27(dd，J＝3.6，9.6Hz，2H)，4.15(d，J＝5.6Hz，4H)；
FTIR(KBr)：2922，2854，1669，1586，1455，1382，1320，1283，1242，1096，1044，988，893，872，744(cm-1)；
HR-ESI-MS：calcd.for[C32H34N6O14+Na]+749.2031，found749.2027；
HPLC(tR＝9.9minover25minofeluent(acetonitrile/H2O＝5％∶95％to95％∶5％，purity 96.9％)。
实施例2
化合物IB的制备：
(1)化合物VIII的制备：
将化合物VI(224mg，0.6mmol)和化合物IV(100mg，0.4mmol)溶于10mLCH2Cl2， 依次加入水(10mL)、CuSO4·5H2O(4当量)和L-抗坏血酸钠盐(6当量)，室温下搅拌过 夜。TLC显示初始物基本消失，且反应液上层呈绿色，下层呈棕黄色，混合液用CH2Cl2稀释， 水洗，无水MgSO4干燥，过滤，浓缩，残余物经硅胶柱层析分离提纯(乙酸乙酯∶石油醚＝ 4∶1，V/V)，得到淡黄色针状晶体(化合物VIII，218mg，88％)。Rf＝0.23(乙酸乙酯∶石油醚＝ 1∶2，V/V)。
1HNMR(400MHz，CDCl3)：δ＝8.31-8.26(m，2H)，8.25(s，1H)，8.03(d，J＝7.6Hz，1H)， 7.84-7.75(m，2H)，7.74(t，J＝8.0Hz，1H)，7.53(d，J＝8.4Hz，1H)，5.88(t，J＝9.2Hz，1H)，5.65(t， J＝10.0Hz，1H)，5.58(d，J＝3.2Hz，1H)，5.49(s，2H)，5.27(dd，J＝3.2，10.0Hz，1H)，4.28-4.15 (m，3H)，2.27，2.07，2.03，1.88(4s，12H)；
13CNMR(100MHz，CDCl3)：δ＝183.2，182.3，170.4，170.1，169.9，168.9，158.7，144.5，135.7， 135.0，134.9，134.2，133.4，132.5，127.1，126.7，122.3，122.2，120.7，120.3，86.3，74.0，70.8，67.9， 66.9，63.7，61.3，20.7，20.6，20.5，20.2；
HR-ESI-MS：calcd.for[C31H29N3O13+H]+651.1779，found651.1775。
(2)目标化合物(化合物IB)的制备：
将化合物VIII(120mg，0.19mmol)溶于甲醇(10mL)中，加热至80℃，待化合物溶解 后加入水和过量三乙胺并于80℃下回流反应3小时。TLC检测反应结束，液减压蒸馏除去 溶剂，硅胶柱层析分离(乙酸乙酯∶甲醇＝4∶1，V/V)，得到淡黄色针状晶体(化合物IB，80mg， 91％)。Rf＝0.45(乙酸乙酯∶甲醇＝4∶1，V/V).
1HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ＝8.46(s，1H)，8.15-8.12(m，2H)，7.93-7.84(m，5H)，5.57 (d，J＝9.2Hz，1H)，5.44-5.38(m，2H)，5.31(d，J＝6.0Hz，1H)，5.09(d，J＝5.6Hz，1H)，4.78(t，J ＝5.6Hz，1H)，4.72(d，J＝5.2Hz，1H)，4.14-4.07(m，1H)，3.79-3.74(m，2H)，3.60-3.52(m，3H)；
13CNMR(100MHz，DMSO-d6)：δ＝182.7，181.1，158.6，142.4，135.4，135.0，134.6，134.4，133.5，131.9，126.6，126.1，123.6，120.9，120.4，119.4，88.1，78.5，73.7，69.3，68.5，62.5，60.5；FTIR(KBr)：2924，2878，1670，1587，1457，1384，1319，1270，1239，1096，1065，1050，974，872，803，710(cm-1)
HR-ESI-MS：calcd.for[C23H22N3O8+H]+468.1407，found468.1406；
HPLC(tR＝11.7minover25minofeluent(acetonitrile/H2O＝5％∶95％to95％∶5％)，purity 99％)。
实施例3
电极的自组装制备及表征
(1)将丝网印刷电极(SPE)在0.1M的PBS溶液中进行活化，电压为2.0V，活化 时间为200s。电极在室温下晾干，放在冰箱中待用。将4mL的化合物IA或IB的水 溶液(1mg/ml)与氧化态石墨烯(GO，其采用两步氧化法制备，具体参见Kovtyukhova，N. I.，etal.Chem.Mater.1999，11，771-778)的水溶液(0.1mg/L)混合，室温下搅拌4小时。 形成均一体系后取GO与化合物IA或IB的混合液0.2μL滴于SPE的工作电极上(由 石墨组成)，室温下晾干。
(2)由图1可知，应用原子力显微镜观测制备好的GO厚度为1到1.2nm(图a)， 与文献报道相符(Song，W.，etal.Biosens.Bioelectron.2011，26，3181-3186)，而经π- 堆叠作用后的石墨烯-糖醌(化合物IA(图b)或IB(图c))复合纳米材料厚度上升 为1.6～1.7nm，证明两者间已紧密结合。
(3)由图2可知，应用Raman光谱和红外表征复合纳米材料的形成。GO的Raman 谱中(图2-a1)在1354和1604cm-1处出现石墨烯的标准D与G谱带，其强度比ID/IG为0.82。对于修饰过的GO(图2-a2(与化合物IA结合)和图2-a3(与化合物IB结 合)显示其ID/IG比率分别上升至0.98和0.99，说明相比未修饰的GO这些复合物的碳 sp2-杂化程度由于化合物的存在而增强。
同样由图2可知，应用傅立叶变换红外对复合材料进行进一步表征，经化合物IA 修饰的GO(图2-b2)、经化合物IB修饰修饰的GO(图2-b3)和未修饰GO(图2-b1) 比较，明显多出了化合物蒽醌与三氮唑连接键、半乳糖环以及三氮唑环上键的红外特征 峰。这些数据进一步说明GO与蒽醌糖可经由π-作用诱导成功进行堆叠。
(4)由图3可知，应用循环伏安法(CV)对含GO-IA和GO-IB的SPE进行电化学 表征，使用设备为CHI660电化学工作站，扫速为0到0.12V/s，扫描范围为0到-0.8V，由 化合物IA(图3a)和化合物IB(图3b)的循环伏安图可知：其还原峰为0.5V左右，氧 化峰为0.45V左右，两峰对称且峰间距较小，说明电子传递过程较快。图3a中双糖-醌复合 物的峰间距(96mV)比图3b中单糖-醌复合物间距(56mV)大，说明说明前者由于更多糖 残基的存在而在更大程度上阻碍了醌的电子传递。在不同扫速的情况下，其电流与扫速成正 比关系，证明化学行为是由界面控制的(内插图)，从而推测GO-糖醌复合物在SPE上形成 了良好、稳固的修饰层。
实施例4
糖-凝集素的电化学生物传感
(1)应用灵敏的电化学检测手段示差脉冲伏安法(DPV)对糖-凝集素识别进行检测(凝 集素为市售品)。将3μL溶于PBS缓冲液(pH值为7.0)的凝集素滴于含GO-IA和GO-IB 的SPE工作电极，室温下孵育30分钟后用PBS及去离子反复水冲洗3次以除去非特异吸附。 将电极置入预先除氧的PBS溶液中，设置扫描范围-0.7到-0.2V，静置时间2s，扫描幅度5V 进行DPV数据采集，具体见图4。
图4中，图4a和4b分别代表含化合物IA和化合物IB的SPE体系中加入由上到下0，0.05， 0.1，0.2，0.3，0.4和0.5mM可特异识别半乳糖的花生凝集素(PNA)后其DPV的改变，可见 两个电极在浓度渐增凝集素的存在下均显示了逐渐淬灭的电流，这是由于PNA与半乳糖结合 从而使电极表面形成了凝集素涂层以阻碍蒽醌基团的电子传递。此外，在所有浓度条件下， 含2个糖基的双齿化合物IA的电流淬灭程度始终高于含一个糖基的化合物IB，且在最高浓 度下前者最大淬灭效率较后者高出41％，可归结于前者的一种“多簇状效应”(Peters，R.J.Org. Biomol.Chem.2009，7，2013-2025)。
随后对两个电极加入0.3mM的各种特异或非特异凝集素，考量其生物特异性(结果见图 4c)。我们发现在PNA的存在下，化合物IA和化合物IB同样显示了程度不同的电流淬灭 率(I0为初始电流，I为加入凝素后的电流变化)，而在其余非特异凝集素伴刀豆球蛋白(Con A)、荆豆凝集素(UEA-I)、麦胚凝集素(WGA)和豌豆凝集素(PSA)的存在下，其电 流基本不产生变化。有趣的是，加如大豆凝集素(SBA)后含化合物IA的SPE同样产生了 一个较小的电流淬灭，这是由于此类凝集素可弱特异地识别半乳糖。于是，通过上述实例我 们证明了所搭建的简易电化学传感器具备良好的生物特异性，可灵敏区分特异、非特异以及 弱特异凝集素的存在。
(2)应用DPV检测覆盖GO-IA的SPE对于表面含有半乳糖特异识别受体蛋白ASGP-R 肝癌细胞Hep-G2(细胞由中科院上海药物研究所新药筛选中心提供)，结果见图5。
图5中，图5a所示，当对电极加入5000，10000，100000，200000和500000个/mL的野生 型Hep-G2后，其电流呈浓度依赖式下降。为验证这一现象是由ASGP-R受体与半乳糖的特 异识别结合诱导的，对细胞进行了ASGP-R1的敲除实验(Yang，J.，etal.J.ViralHepatitis2006， 13，158-165)；图5b显示参照组细胞含有完整的受体(左)而敲除组的受体含有量降为约30％ (右)。随后的DPV实验证明，在相同细胞浓度的情况下，化合物IA对于参照组细胞的响 应完全与野生型组相同(图5c)而对于敲除组显示了显著弱化的电流淬灭(图5d)，说明这 一结合是由细胞表面糖识别受体与电极覆盖糖的特异作用介导的。这些数据验证我们构建的 体系适用于探测细胞间的糖-凝集素识别。