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1、(10)申请公布号 CN 102382862 A (43)申请公布日 2012.03.21 CN 102382862 A *CN102382862A* (21)申请号 201010268857.3 (22)申请日 2010.09.01 C12P 7/22(2006.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 张卫 岳向国 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 利用悬浮培养葡萄细胞生产 13C 标记反式白 藜芦醇的方法 (57) 摘要 本发明涉及植物细胞培养。
2、技术， 具体地说是 一种利用葡萄悬浮培养细胞生产 13C 标记反式白 藜芦醇的方法， 将葡萄细胞置于液体培养基中培 养， 细胞接种量为 50 200g/L 湿重， 在细胞接种 时每升培养基中加入 50 200g 的无菌吸附剂 ； 在细胞指数生长初期， 于每升培养基中加入浓度 分别为51000M的单一诱导剂或诱导剂组合， 同时添加浓度为110mM的 13C标记前体 ； 所述诱 导剂为非生物诱导剂或真菌诱导子。 本发明中， 因 绝大部分 13C 标记反式白藜芦醇外泌到胞外且被 吸附到吸附剂上， 因而大大简化了提取分离纯化 的操作， 从而降低了成本， 易于实现工业化生产。 同位素标记反式白藜芦醇在心。
3、脑血管疾病和癌症 的治疗研究中被广泛应用， 因此该技术有重要的 应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 CN 102382878 A1/1 页 2 1. 利用悬浮培养葡萄细胞生产 13C 标记反式白藜芦醇的方法， 其利用悬浮培养葡萄细 胞经过诱导， 添加吸附剂和添加 13C 标记前体产生13C 标记反式白藜芦醇， 其特征在于 ： 将葡 萄细胞置于液体培养基中培养， 细胞接种量为50200g/L湿重， 在细胞接种时每升培养基 中加入50-200g的无菌吸附剂 ； 在细胞指数生长初期， 于每升。
4、培养基中加入浓度分别为5 1000M 的单一诱导剂或诱导剂组合， 同时添加 1 10mM13C 标记前体 ； 所述诱导剂为非生 物诱导剂或真菌诱导子。 2. 按照权利要求 1 所述方法， 其特征在于 ： 所述非生物诱导剂为硝酸银、 水杨酸或茉莉 酸及其衍生物。 3. 按照权利要求 1 所述方法， 其特征在于 ： 所述葡萄细胞的培养条件为 ： 培养温度为 20 30， 暗培养 ； 培养周期为 5 20 天， 每隔 5 14 天传代一次。 4. 按照权利要求 1 所述方法， 其特征在于 ： 所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培 养基后的第 4 10 天， 即诱导剂的添加时间。 5. 按照权利要求 。
5、1 所述方法， 其特征在于 ： 所述吸附剂为大孔吸附树脂或对白藜芦醇 及其他植物酚类和黄酮类化合物有优良吸附作用的树脂。 6. 按照权利要求 1 所述方法， 其特征在于 ： 所述 13C 标记前体为13C 标记苯丙氨酸或酪 氨酸。 7. 按照权利要求 1 所述方法， 其特征在于 ： 所述葡萄细胞的培养基组成为， 于 B5 基础 培养基中添加 0.1 1.0mg/L- 萘乙酸， 0.2 1mg/L 激动素， 0.2 2g/L 酶解酪蛋白及 10 60g/L 蔗糖， pH 值为 5.5 6.5。 权 利 要 求 书 CN 102382862 A CN 102382878 A1/4 页 3 利用悬浮。
6、培养葡萄细胞生产 13C 标记反式白藜芦醇的方法 技术领域 0001 本发明涉及植物细胞培养技术， 具体地说是一种通过添加 13C 标记前体生产13C 标 记反式白藜芦醇的方法。 背景技术 0002 反式白藜芦醇 (trans-resveratrol) 是一种类黄酮类多酚化合物， 化学名为 3， 5， 4 - 三羟基 - 反 - 二苯代乙烯 )。天然的白藜芦醇存在于葡萄皮、 花生及传统中药虎杖 等植物体中， 它属于一种植物抗毒素， 在恶劣环境或是植物受到霉菌感染时产生 (M.Jang， L.Cai， G.Udeani， K.Slowing， C.Thomas， C.Beecher， H.Fon。
7、g， N.Farnsworth， A.Kinghorn， R.Mehta， Cancer chemopreventive activity of resveratrol， anatural product derived from grapes， Science， 1997， 275 ： 218)。大量研究表明， 反式白藜芦醇能够阻 止低密度脂蛋白的氧化， 具有抗菌、 抗脂质过氧化、 防治心脏病、 抗癌、 抗血小板凝集与血 管松弛、 降低血脂和抗诱变等多种药理作用， 被确认为抗肿瘤剂和治疗心血管疾病的有效 成分 (Donnez， D.， et al.， Bioproduction of res。
8、veratrol and stilbene derivatives by plant cells and microorganisms.Trends in biotechnology， 2009.27(12) ： p.706-713.)。 0003 随着反式白藜芦醇药理作用的阐明和研究， 反式白藜芦醇正成为人们研究和 开发的热点， 在 1990 年到 2000 年的十年间共报道有 170 多篇白藜芦醇的研究工作， 而 在 2000 年到 2002 年的两年时间里白藜芦醇的研究文献骤然上升到 238 篇 (P.Jeandet， A.C.Douillet-Breuil， R.Bessis， S.D。
9、ebord， M.Sbaghi， M.Adrian， Phytoalexins from the Vitaceae ： Biosynthesis， Phytoalexin Gene Expression in Transgenic Plants， Antifungal Activity， and Metabolism， Journal of Agriculture and Food Chemistry， 2002， 50 ： 2731-2741)。而同位素 13C 标记反式白藜芦醇作为研究反式白藜芦醇在人和动物 中代谢吸收的一个重要工具， 其重要性越来越受到人们的关注。 目前， 市场上并没有专。
10、门供 应 13C 标记反式白藜芦醇的公司， 国外一些反式白藜芦醇药代动力学研究机构中的13C 标记 反式白藜芦醇的应用也主要来源于化学合成。但是， 化学合成除了造价昂贵之外， 其生产 过程毒性较大也成为制约了这种方式生产的 13C 标记反式白藜芦醇在临床研究中的应用。 葡萄细胞培养作为生产 13C 标记反式白藜芦醇的替代方法已受到关注 (Krisa， S.， et al.， Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures ： methyl jasmonate induction and 13C biolabeling。
11、.J.Nat.Prod， 1999.62(12) ： p.1688-1690 ； Aumont， V.， et al.， Production of highly C-13-labeled polyphenols in Vitis vinifera cell bioreactor cultures.Journal of Biotechnology， 2004.109(3) ： p.287-294)。 0004 目前国际上通过诱导剂及吸附剂联合诱导调控同时添加 13C 标记前体来高产量生 产 13C 标记反式白藜芦醇的方法还未见报道。 发明内容 说 明 书 CN 102382862 A CN 1。
12、02382878 A2/4 页 4 0005 本发明的目的是提供一种利用葡萄(Vitis vinifera)悬浮细胞培养体系， 以一种 或多种诱导剂联合诱导并与吸附剂添加相结合， 同时添加 13C 标记前体的联合调控手段来 生产 13C 标记反式白藜芦醇的方法。 0006 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0007 将葡萄细胞置于液体培养基中悬浮培养， 细胞接种量为50200g/L湿重， 在细胞 接种时每升培养基中加入50200g的无菌吸附剂 ； 在细胞指数生长初期， 于每升培养基中 加入浓度分别为 5 1000M 的诱导剂， 同时添加 13C 标记前体。所述诱导剂为非生物诱导 剂。
13、， 所述前体为 13C 标记苯丙氨酸或酪氨酸。 0008 所述非生物诱导剂为硝酸银、 水杨酸或茉莉酸及其衍生物， 所述前体为 13C 标记苯 丙氨酸或酪氨酸。 0009 葡萄细胞的培养条件为 ： 培养温度为 20 30， 暗培养 ； 培养周期为 5 20 天， 每隔 5 10 天传代一次 ； 所述细胞指数生长初期是指细胞接种于培养基后的第 2 6 天， 即两种诱导子及前体的添加时间。 0010 所述吸附剂为经处理对白藜芦醇有较强吸附能力并对细胞无毒的多孔材料， 如各 种大孔吸附树脂。 0011 葡萄细胞的液体培养基组成为 ： 于 B5 基础培养基中添加 0.1 0.4mg/L 激动素， 0.0。
14、5 0.3 萘乙酸， 0.1 1g/L 酶解酪蛋白及 10 40g/L 蔗糖， pH 值为 5.5 6.5。 0012 本发明方法原理 ： 在添加多种诱导剂的同时添加特定种类和浓度的吸附剂能显著 提高反式白藜芦醇产量， 同时添加 13C 标记前体可使得部分同位素标记前体转化为13C 标 记反式白藜芦醇， 其主要原理有以下四方面 ： 1、 诱导剂能有效刺激植物细胞次生代谢能力， 促进白藜芦醇生物合成生产 ； 2、 多种诱导剂能产生协同效应共同促进白藜芦醇生物合成生 产 ； 3、 通过特定吸附剂的加入使细胞中的白藜芦醇苷以白藜芦醇的形式外泌到细胞外， 从 而合成了价格昂贵的白藜芦醇并解除了产物的反。
15、馈抑制， 避免了白藜芦醇苷存在于胞内对 细胞生长的伤害及对进一步生产的阻碍， 同时也避免了白藜芦醇苷在胞内的降解 ； 4、 由于 标记前体为反式白藜芦醇生物合成步骤中必须的底物， 因此 13C 标记前体的添加可以使得 生产的部分反式白藜芦醇被标记。 0013 本发明具有如下优点 ： 0014 1、 联合应用两种或多种诱导剂和吸附剂同时添加 13C 标记前体来在葡萄细胞中生 产 13C 标记反式白藜芦醇， 获得的产量远远超过目前国内外文献报道的最高值。Krisa 等 人的报道中称总芪的产量达 770mol/L( 主要产物为白藜芦醇苷， 折合 13C 标记白藜芦醇 的产量为 300mg/L)(Kr。
16、isa， S.， et al.， Stilbene production by Vitis vinifera cell suspension cultures ： methyl jasmonate induction and 13C biolabeling.J.Nat.Prod， 1999.62(12) ： p.1688-1690)。之后， Aumont 等人在 2L 生物反应器中获得 360mg/L 的 13C 标记白藜芦醇苷 ( 折合 210mg/L13C 标记白藜芦醇 )， 本发明中生产 13C 标记反式白藜芦醇 ( 白藜芦醇分为正式和反式， 反式白藜芦醇为其活性构型 ) 产量可达 10。
17、00 1200mg/L. 0015 2、 本发明使得反式白藜芦醇 95以上外泌， 被吸附到吸附剂上。大大简化了提取 分离纯化的操作， 降低了成本， 为进一步工业化生产提供了很大的可能性 ( 在国内的文献 中反式白藜芦醇的生产大都通过对生产得到反式白藜芦醇苷进行酶解而获得 )。 0016 3、 13C 标记前体的添加使得生产的反式白藜芦醇被标记， 标记率最高可达到 说 明 书 CN 102382862 A CN 102382878 A3/4 页 5 30 40， 这种生产方法代替了常规的化学合成的生产方法， 生产过程无毒， 大大降低了 生产的成本和对环境的污染。 附图说明 0017 图 1 显示。
18、反式白藜芦醇的 13C 标记位置 ； 0018 图 2 为 13C 标记反式白藜芦醇的二维核磁的谱图 ； 0019 图 3 为不同树脂促进反式白藜芦醇生产的效果比较。 具体实施方式 0020 以下将通过实施例对本发明的有关内容作进一步说明。 0021 一种利用葡萄细胞诱导产生白藜芦醇的方法， 包括以下步骤 ： 0022 (1) 葡萄细胞的培养 ： 0023 本实验细胞株为市购获得， 也可通过对葡萄 (Vitis vinifera) 的种子按照 常规方法诱导获得 (Cormier， F.， et al.， Development of process strategies for anthocy。
19、anin-based food colorant using Vitis vinifera cell cultures.Plant cell cultures secondary metabolism ： toward industrial application， ed.F.Dicosmo and M.Misawa.1996， New York ： CRC Press)。采用常用培养基 B5 培养基 (Gamborg， O.L.， R.A.Miller， and K.Ojima， Nutrient requirements of suspension cultures of soybean 。
20、root cells.Experimental Cell Research， 1968.50(1) ： p.151)， 添加0.10.4mg/L激动 素， 0.05 0.3 萘乙酸， 0.1 1g/L 酶解酪蛋白及 10 40g/L 蔗糖， pH 值为 5.5 6.5。每 隔 7 天传代一次， 使用旋转式摇床时转速为 60 200rpm， 培养温度为 20 30， 暗培养。 0024 (2)13C 标记反式白藜芦醇的联合诱导生产 ； 0025 将步骤 (1) 所获得的葡萄细胞置于含上述培养基中培养， 细胞接种量为 50 200g/L 湿重。培养条件为 ： 培养温度为 20 30， 暗培养。培养。
21、周期为 5 20 天。 0026 在细胞接种时每升培养基中加入 50 200g 的无菌吸附剂， 在细胞指数生长初 期同时添加一种或多种诱导剂和 13C 标记前体， 于每升培养基中加入诱导子浓度为 5 1000M， 前体浓度为 0.1 2mM。 0027 从由获得的培养物分离得到的吸附剂部分中提取反式白藜芦醇。 反式白藜芦醇最 高产量可达 1000 1200mg/L。 0028 (3)13C 标记反式白藜芦醇含量的测定 ： 0029 取 1g 吸附剂， 加入 20ml 的甲醇， 摇床上过夜提取 ； 取提取液 14,000g 离心， 备做 HPLC。 0030 HPLC 采用 Agilent110。
22、0 高效液相色谱仪， 检测波长为 307nm。色谱柱采用购买的 美国菲罗门公司生产的Luna柱(100mm4.6mm， 5m)， 流动相分别为20的乙腈和85的 乙腈。流速 0.4ml/min， 进样量 10L。用提前制作的标准曲线来计算反式白藜芦醇含量。 0031 (4)13C 标记反式白藜芦醇的纯化 ： 0032 吸附剂的甲醇提取物旋转蒸发后溶于 5mL 的甲醇中， 然后用反相 C18柱分离纯化， 包含反式白藜芦醇的部分浓缩后用硅胶柱进一步纯化， 最后在 SEP-PAKC18半制备柱中纯化 后过滤得到白色粉末即为反式白藜芦醇纯品。 说 明 书 CN 102382862 A CN 10238。
23、2878 A4/4 页 6 0033 (5)13C 标记反式白藜芦醇的鉴定及 13C 标记率的测定 0034 13C 标记反式白藜芦醇的标记位置通过二维核磁 (Varian INOVA 400 MNMR) 来确 定， 13C 标记率通过 EA-IRMS(Flash EA 1112HT， Finnigan MAT DeltaV advantage) 测定。 0035 实施例 1 0036 培养条件 ： 100ml摇瓶悬浮培养， 采用B5培养基， 另添加0.2mg/L激动素和0.1mg/ L 萘乙酸， 0.25g 酶解酪蛋白和 30g/L 蔗糖， pH 为 6.0。将过滤得到的 2g 提前培养的湿。
24、葡萄 细胞接种到含有 20ml 上述培养基的摇瓶中， 旋转式摇床转速 100rpm， 25培养。 0037 第 0 天添加 200g/L 的 HP2MGL， 第 4 天添加茉莉酸和水杨酸至终浓度分别为 10M 和 500M 同时添加 1mM 的 1-13C-L- 苯丙氨酸。继续培养至第 10 天收获。13C 标记反式 白藜芦醇在第 10 天产量达到最大 (1144.1mg/L)， 此时反式白藜芦醇的标记率为 20.8， 13C 标记反式白藜芦醇在第 5 天标记率最大达到 35.7， 此时13C 标记反式白藜芦醇产量为 746.2mg/L。 0038 0039 实施例 2 0040 实施例 2 与实施例 1 不同之处在于， 通过对几种常用树脂 (XAD-4、 XAD-7、 XAD-16、 HP20 和 HP2MGL) 的比较， 结果见图 3， 图 3 中表明， HP2MGL 和 XAD-7 树脂在促进反式白藜芦 醇的生产方面优于其他树脂。 说 明 书 CN 102382862 A CN 102382878 A1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102382862 A CN 102382878 A2/2 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 102382862 A 。