技术领域
本发明涉及一种高灵敏度的蛋白检测方法。
背景技术
邻位连接检测（proximity ligation assay,PLA）技术是2000年以 后由Fredriksson等以后发展起来的一种蛋白质检测技术。最初，PLA 技术所用的探针也可以是一种被称为核酸适配子(aptamer)的DNA单链 。该核酸适配子是通过一种体外筛选方法筛选而获得的，可与靶分子 高特异性、高亲和力地结合，从而起到识别目的分子的作用。核酸适 配子合成简单，储存容易，目前已被广泛应用于基础研究、诊断、治 疗试剂的研制及药物筛选等领域。但目前能够用于PLA技术的核酸适配 子种类有限，这大大限制了核酸适配子在该技术中的应用。
目前，PLA技术已经得到了较大的发展。用PLA检测蛋白质，一般首先 将不同的DNA单链分别与蛋白质识别分子相结合，形成PLA探针。PLA探 针和样品温育后，2条含有不同DNA序列的PLA探针会同时结合到同1个 待测蛋白质分子上。这时，2条探针的DNA尾部在空间上紧密靠近，在 过量的互补连接序列和DNA连接酶的作用下，2条探针DNA尾部的游离5 ’端和3’端发生连接反应，形成1个环状的蛋白质-蛋白识别分子-单 链DNA复合物。连接而成的单链DNA量和样品中待检测蛋白分子的量正 相关。用实时荧光定量PCR对复合物中的单链DNA部分扩增，即可对连 接复合物中的蛋白质进行定量检测。该技术综合了抗原抗体结合的高 特异性和实时荧光定量PCR技术的高灵敏度等多方面优势, 使对蛋白 质的检测转变为对DNA的检测，实现了痕量蛋白质的分析。
抗体（包括单抗、多抗、重组单链抗体）是使用最广泛的蛋白质特异 性识别分子，可以用化学共价结合法和生物素法，将DNA单链与抗体结 合，制备出抗体-单链DNA复合物，作为探针用于PLA反应。化学法是利 用双功能交联试剂4-[p-maleimidophenyl] butyrate (SMPB)将抗体 与巯基修饰的DNA单链相结合；生物素法则是利用链亲和素(streptav idin)与生物素(biotin)之间的高亲和力，先将马来酰亚胺修饰的链亲 和素与巯基修饰的DNA单链结合，形成链亲和素-单链DNA复合物，经纯 化除去游离的链亲和素以及游离的单链DNA后，链亲和素-单链DNA复合 物可直接与生物素修饰的抗体按1：l的比例在室温下结合，无需进一 步的纯化，便可形成终产物抗体。但这两种方法用于PLA探针的制备， 过程都很复杂，成本高，耗时长。探针的难以制备也限制了PLA的广泛 使用。
经过10多年的发展，PLA技术已经迅速应用到细胞因子、肿瘤标志物检 测、蛋白质功能研究等领域。根据其检测的方式，可以分为液相PLA和 固相PLA两大类。
液相PLA是指蛋白质和探针的识别、DNA的连接和定量PCR都在同一液相 中，不需要洗涤的步骤。这种方法样品用量少，只需要1ul，无需洗涤 ，检测快速。但对于血清等复杂样品，由于其中可能含有DNA连接酶和 DNA聚合酶的抑制剂，以及样品用量太少，会造成结果误差大和不稳定 等情况，难以得到推广应用。
固相PLA是指将抗体固定在磁珠上，以此作为固相用于从样品中捕捉靶 蛋白，并通过洗涤，将靶蛋白从样品中分离出来用于PLA的检测。固相 PLA方法可以将靶蛋白从血清等复杂样品中分离出来，并起到浓缩作用 。通过洗涤步骤，可以去除杂质，保持检测的灵敏度和特异性。因此 ，固相PLA方法的实用性更强，已用于白细胞介素-2（IL-2）、白细胞 介素-6（IL-6）、白细胞介素-8（IL-8）、血管内皮生长因子（VEGF ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、前列腺特异抗原（PSA）等细胞因子 的检测，检测灵敏度一般可以达到0.1 pM以上。因此，就可操作性来 说，利用磁珠的固相PLA比液相PLA方法要好。但磁珠固相PLA也存在一 些问题影响它的使用。首先，由于磁珠的存在，在进行荧光定量PCR时 ，磁珠会造成本底升高从而影响检测的灵敏度；其次，在洗涤过程中 ，并不是所有的磁珠会被磁力架捕获，每次洗涤磁珠都会减少一些， 影响检测的灵敏度，结果误差较大，稳定性较差；另外，磁珠的洗涤 技术要求高，需要磁力架等设备，难以快速洗涤，过程缓慢，难以实 现样品高通量检测。这些问题都影响了固相PLA的推广和使用。
因此，虽然PLA作为一项新的蛋白质检测技术，具有很高的灵敏度，但 其也存在着很多问题影响它的使用，难以用此方法生产出产品用于疾 病等领域的检测，服务社会。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高灵敏度的蛋白检测方法，该方 法将抗体固定在PCR管上进行蛋白质PLA检测的方法，检测的过程中不 再需要磁珠，摒弃了由于使用磁珠所导致的缺陷，并且对蛋白质的检 测灵敏度也有了极大的提高。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种高灵敏度的蛋白检测方法， 任选以下一种方式：
方式一、直接包被法进行管壁固相PLA：
蛋白质或抗体直接吸附到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测；
方式二、交联剂固定法进行管壁固相PLA：
蛋白质或抗体通过戊二醛交联到实时荧光定量PCR管壁，进行PLA检测 。
作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的改进：使用单克隆抗体pab2 40，从而建立P53 蛋白（P53蛋白突变体）、cTnI蛋白的PLA检测。
作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：方式一的直接 包被法为依次进行以下步骤：
1）、在每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul ，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2.5小时后，PBST 缓冲液洗涤；
2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液1 80~220 ul（较佳为200 ul），36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去B SA溶液，23~27℃烘干（置4 ℃备用）；
3）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行 如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时； 从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素 偶联物；
将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各 自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗 体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，CATALOG # AF13 55），从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；
探针DNA1:
5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCA AGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；
探针DNA2:
5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATA TGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；
4）、检测时，在步骤2）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放 置20~40分钟（较佳为30分钟）后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul P LA探针，室温温浴20~40分钟（较佳为30分钟）；温浴后用PBST缓冲液 洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1 ×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量PCR检测 ；
所述正向和反向引物、互补DNA为：
正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’
反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’
互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；
PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环， 用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测；
上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法 为：
在含有浓度为50×10-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）10 00 ml中加入2.5×10-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10-6 mol，80×10-6 mol ATP，互补DNA0.1×10-6 mol，dNTPs 0.2×10 -3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶 ，1000×浓度的SYBGreen 1ml。
作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的另一种改进，方式二的交联 剂固定法为包括以下步骤：
1）、定量PCR管中加入交联剂溶液40~60 ul （较佳为50 ul），3 6~38℃放置4.5~5.5小时（较佳为37 ℃放置5小时）后，用去离子水 洗涤（目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；
2）、在步骤1）所得的每个定量PCR管中加入0.1~1 ug/ml浓度的PAB 240抗体50 ul，于3~5℃放置11~13小时或者于36~38 ℃放置1.5~2. 5小时后，PBST缓冲液洗涤；
3）、在步骤2）所得的每个定量PCR管中加入浓度为10g/L的BSA溶液1 80~220 ul（较佳为200 ul），36~38 ℃放置1.5~2.5小时后弃去B SA溶液，23~27℃烘干（置4 ℃备用）；
4）、生物素化的两个单链DNA---探针DNA1和探针DNA2，分别各自进行 如下内容：以1：1的摩尔比加入到链酶亲和素溶液中，25℃ 1小时； 从而相应的得到探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素 偶联物；
将探针DNA1-链霉亲和素偶联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物分别各 自进行如下内容：按照 1：1摩尔比加入生物素化的p53蛋白多克隆抗 体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，CATALOG # AF13 55），从而相应的分别得到PLA检测探针1和PLA检测探针2；
探针DNA1:
5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCA AGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；
探针DNA2:
5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATA TGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；
5）、检测时，在步骤3）所得的PCR管中加入50ul的待测血清，室温放 置20~40分钟（较佳为30分钟）后用PBST缓冲液洗涤，再加入50ul P LA探针，室温温浴20~40分钟（较佳为30分钟）；温浴后用PBST缓冲液 洗涤，PBST缓冲液洗涤后再加入含有连接酶、SYBGreen及互补 DNA的1×定量PCR缓冲液 40~60 ul，室温5-30分钟后进行荧光定量 PCR检测；
所述正向和反向引物、互补DNA为：
正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’
反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’
互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；
PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环， 用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测；
上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液的制备方法 为：
在含有浓度为50×10-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）10 00 ml中加入2.5×10-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10-6 mol，80×10-6 mol ATP，互补DNA0.1×10-6 mol，dNTPs 0.2×10 -3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶 ，1000×浓度的SYBGreen 1ml。
作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：步骤1）中的交 联剂溶液为：体积浓度为0.5~5 ％的戊二醛溶液。
作为本发明的高灵敏度的蛋白检测方法的进一步改进：步骤1）中的交 联剂溶液为：体积浓度为1％的戊二醛溶液。
在本发明中：
DNA1是5’端生物素化，DNA2是3’端生物素化，而且5’端是磷酸化的 。
本发明的发明思路和原理如下：
PCR反应过程中要经历90℃以上的高温，因此定量PCR管大多由聚丙烯 、聚乙烯或聚碳酸酯这些耐高温材料制成。发明人发现，用这些材料 制备出的定量PCR管，虽然对蛋白质的吸附能力较低，但也能用此替代 磁珠固定抗体，用于管壁固相PLA方法。本发明将抗体通过物理吸附， 直接固定到定量PCR管壁上的方法，称为直接包被法。
A:用直接包被法进行管壁固相PLA：
Tp53基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因 ，其产物P53蛋白通过多种途径抑制肿瘤的发生。大量的研究表明，约 50％的肿瘤病人，其P53蛋白发生了突变，有些肿瘤100％的病人P53蛋 白发生突变。因此，突变型P53蛋白是很好的肿瘤标志物。但是，突变 型P53蛋白是由肿瘤组织产生的，前期微小的肿瘤只能分泌及其微量的 突变型P53蛋白到病人血清中。目前国际上最好的商业化的突变型P53 蛋白ELISA检测试剂盒的检测灵敏度约为150 pg/ml，这基本已经达到 了ELISA检测方法的灵敏度极限。但如用于早期肿瘤 的筛查，肿瘤复发、转移的检测，其灵敏度还是远远不够的。高灵敏 度的血清突变型P53蛋白检测试剂的开发是一个世界性的难题。
P53有很多种突变体，本发明中用R175H这种突变体作为标准品，特异 性识别P53蛋白突变体，但不识别野生型P53蛋白的一种单克隆抗体pa b240，从而来建立P53蛋白突变体的PLA检测。因为p53蛋白突变后，就 会发生构象的变化，暴露出氨基酸213-217 (RHSVV)这个抗原表位， 抗体pab240就是识别这个表位。P53蛋白还有其它突变体如R248W、R2 73H、R282W、G245S等等，都可以被pab240识别（备注说明：P53突变 体可能有几百种，目前已知大部分的突变体都能被pab240识别，pab2 40已经成为检测是否存在P53突变体的最常用的抗体）。当然也包括其 它单抗可以识别其它类型的突变体。但是pab240是最常用的用于检测 P53蛋白突变体的抗体。
结果：
证实直接将P53蛋白突变体的单克隆抗体包被在PCR管壁上，可以用PL A方法检测突变型的P53蛋白。其检测灵敏度和用磁珠的固相PLA方法相 差不大，都达到1 pg/ml。但是由于检测过程中无需磁珠，洗涤过程 简单快速，结果重复性好，成本也降低很多。用这种方法检测P53蛋白 突变体，比用磁珠法固相PLA更具有实用性和可操作性。
B：交联剂固定法：
发明人继续研究增加抗体在PCR管壁上的包被量对PLA检测蛋白质灵敏 度的影响。戊二醛是实验室常用的组织固定剂，该分子两端为化学性 质活泼的羰基，易与其他分子产生共价结合。定量PCR管壁被戊二醛活 化，从而戊二醛结合，而戊二醛上的另一个羰基可以和包被的抗体结 合。这样，抗体就可以通过戊二醛与PCR管共价结合，不但抗体和管壁 的结合更牢固，不会在洗涤过程中脱落而影响检测结果，而且同样面 积的PCR管壁上结合抗体分子更多，更有利于增加检测的灵敏度。
我们用专一识别P53蛋白突变体的单克隆抗体PAB240包被在定量PCR管 上，实现了用PLA方法高灵敏度检测P53蛋白突变体。
结果：PLA方法和美国Oncogene公司ELISA试剂盒（Cat# QIA03）方法 检测P53蛋白突变体，PLA的最低检测限为0.01 pg /ml，ELISA的最 低检测限为50 pg/ml，PLA的灵敏度比ELISA高5000倍。
在发明过程中，发明人还选用EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化 二亚胺盐酸化物), SMCC【 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸 琥珀酰亚胺酯】等交联剂用于将抗体固定在PCR管壁上，但优选戊二醛 ，因其成本低，效果好，使用方便。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明的管壁固相PLA方法原理示意图；
图2为管壁固相PLA和ELISA方法检测P53蛋白突变体的比较图；
图2中，■代表PLA（本发明），▲代表ELISA；
图3为用直接包被法管壁固相PLA技术检测野生型和突变型P53蛋白的对 比图；
图3中：■代表突变型P53蛋白，▲代表野生型P53蛋白。
图4 为交联剂固定法进行管壁固相PLA检测野生型和突变型P53蛋白的 对比图；；
图4中：■代表突变型P53蛋白；▲代表野生型P53蛋白。
图5是EDC作为交联剂处理PCR管后对突变型P53蛋白的检测效果图；
图6是SMCC 作为交联剂处理PCR管后对突变型P53蛋白的检测效果图；
图7是交联剂固定法的管壁固相PLA法对心肌肌钙蛋白cTnI的检测效果 图。
具体实施方式
实施例1、一种高灵敏度的蛋白检测方法，采用方式一的直接包被法进 行管壁固相PLA，具体为依次以下步骤：
1）、在每个定量PCR管中加入0.1 ug/ml浓度的PAB240抗体50 ul， 于4℃放置12小时后，用PBST缓冲液洗涤3次（每次的用量为200 ul） ；洗涤的目的是让没有结合在管壁上的抗体被洗掉。
2）、在上述包被抗体的每个定量PCR管（即步骤1）所得的每个定量P CR管）中加入浓度为10g/L的BSA溶液200 ul， 37 ℃放置2小时后 弃去BSA溶液，25 ℃烘干后置4 ℃备用；在4 ℃的保质期可以达到 6-12个月。
3）、浓度为100 纳摩尔/升的生物素化的两个单链DNA（探针DNA1和 探针DNA2）各 100微升，分别各自进行如下内容：
以摩尔比为1：1的比例，与100微升浓度为100 纳摩尔/升的链酶亲和 素溶液混匀，25℃ 1小时后，分别制备得到探针DNA1-链霉亲和素偶 联物、探针DNA2-链霉亲和素偶联物。
上述探针DNA1-链霉亲和素偶联物以及探针DNA2-链霉亲和素偶联物分 别各自进行如下内容：
分别以1：1摩尔比的比例与200微升浓度为50纳摩尔/升的生物素化的 p53蛋白多克隆抗体（可购自美国R&D公司，羊抗人p53多克隆抗体，C ATALOG # AF1355）混合，从而分别得到PLA探针1和PLA探针2；浓度 均为25纳摩尔/升。
探针DNA1:
5’-Biotin-AAAACTCAAATCAACAGGCGAGCCGGACGCTACCAGCTTCTATACCGCA AGCAGCTTGGCCTGAATCTGCTC-OH-3’；
探针DNA2:
5’-P-TACGCCTCGACAGGACGCTGTGGCATTGCAGAGCGTGGCGCTTTACCTATGATA TGATCGTGGTGATATCCGTC-Biotin-3’；
4）、将偶联了正常P53蛋白（野生型P53蛋白）多克隆抗体（也可以结 合突变型P53蛋白）的免疫磁珠加入到无突变型P53蛋白的正常人血清 中，吸附过夜后取出磁珠。通过这种方法得到了不含野生型及突变型 P53蛋白的阴性血清。当然，也可以直接选用不含野生型及突变型P53 蛋白的阴性血清。在这种处理后的血清中，加入不同浓度的突变型P5 3蛋白，配制成含有0 pg/ml、0.01 pg/ml、0.1 pg/ml、1.0 pg/ ml、10 pg/ml、100 pg/ml、1000 pg/ml、10000 pg/ml的突变型 P53蛋白标准品。
检测时，步骤2）中处理好的PCR管中加入50ul的不同浓度的标准品， 每个样品重复3孔。室温放置30分钟后，PBST缓冲液洗涤3次（每次的 用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上抗体结合的血清内物质 被洗掉），再加入50ul 浓度为1nM的 PLA探针（即，25ul 浓度为 2 nM的PLA探针1和25ul 浓度为2 nM的PLA探针2），室温温浴30分 钟；PBST缓冲液洗涤后（用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁 上的结合蛋白相结合的PLA探针被洗掉），加入含有连接酶、SYBGree n、以及互补DNA的1×定量PCR缓冲液50 ul室温20分钟后进行荧光定 量PCR检测；
所述正向和反向引物、互补DNA为：
正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’
反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’
互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；
PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环， 用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测。
备注说明：上述含有连接酶、SYBGreen及互补DNA的1×定量PCR缓冲液 的制备方法为：
在含有浓度为50×10-3 mol/L的KCl的Tris-Cl缓冲液（0.1mol/L）10 00 ml中加入2.5×10-3 mol的 MgCl2、正向和反向引物各0.1×10-6 mol，80×10-6 mol ATP，互补DNA0.1×10-6 mol，dNTPs 0.2×10 -3 mol，1500 单位Taq DNA聚合酶，500 单位 T4 DNA 连接酶 ，1000×浓度的SYBGreen 1ml。
上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计 算处理后，得图2中“■”曲线所示的结果。以0 pg/ml标准品孔的平 均Ct值减去其3倍SD值作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度达 到1 pg/ml。
验证试验1、将实施例1中所用的待测血清按照常规的ELISA方法检测P 53蛋白突变体，所得的结果如图2中的“▲”曲线所示。
所用的检测试剂是美国Oncogeng 公司的p53 蛋白突变体ELISA检测 试剂盒（Cat# QIA03）。用此试剂盒按照说明书检测实施例1中所用 的标准品。证实ELISA试剂盒对标准品的检测灵敏度 为50 pg/m l 。直接包被的管壁固相PLA方法对P53突变体的检测灵敏度比ELISA方法 高50倍左右。
验证试验2、
将偶联了正常P53蛋白（野生型P53蛋白）多克隆抗体的免疫磁珠加入 到无突变型P53蛋白的正常人血清中，吸附过夜后取出磁珠。通过这种 方法得到了不含野生型及突变型P53蛋白的阴性血清。在这种血清中加 入不同浓度的基因重组的正常P53蛋白，配制成含有0 pg/ml、0.01 pg/ml、0.1 pg/ml、1.0 pg/ml、10 pg/ml、100 pg/ml、1000 pg/ml、10000 pg/ml的正常P53蛋白标准品。
检测时，如同实施例1，步骤2）中处理好的PCR管中加入50ul的不同浓 度的标准品，每个样品重复3孔。室温放置30分钟后，PBST缓冲液洗涤 3次（每次的用量为200 ul，洗涤的目的是让没有与管壁上抗体结合 的血清内物质被洗掉），再加入50ul 浓度为1nM的 PLA探针，室温 温浴30分钟；PBST缓冲液洗涤后（用量为200 ul，洗涤的目的是让没 有与管壁上的结合蛋白相结合的PLA探针被洗掉），加入含有连接酶、 SYBGreen、以及互补DNA的1×定量PCR缓冲液50 ul室温20分钟后进行 荧光定量PCR检测；
所述正向和反向引物、互补DNA为：
正向引物: 5’-AAAACTCAAATCAACAGGCG-3’
反向引物: 5’-GACGGATATCACCACGATCA-3’
互补DNA: 5’-TTTTCGAGGCGTAGAGCAGATTCAAA-3’；
PCR循环的条件为95℃保温2分钟；90℃15秒，60℃1分钟，40个循环， 用Mx-3000 定量PCR仪 (Stratagene公司)检测。
同时，如同实施例1，检测血清中的突变型P53蛋白标准品。
上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL的计 算处理后，对于正常P53蛋白标准品的检测得图3中“▲”曲线所示的 结果。同时，如同实施例1，检测血清中的突变型P53蛋白标准品。所 得的结果如图2中的“■”曲线所示。
结果表明，我们发明的直接包被法进行的管壁固相PLA方法检测突变型 P53蛋白，不受正常的野生型P53蛋白的干扰，对突变型P53蛋白的检测 灵敏度为1 pg/ml。
实施例2、一种高灵敏度的蛋白检测方法，采用方式二的交联剂固定法 进行管壁固相PLA，具体为：
在实施例1的步骤1）之前插入以下前序步骤：
定量PCR管中加入交联剂溶液（体积浓度为1 ％的戊二醛溶液）50 ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处 理后定量PCR管。
然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其 余同实施例1。同时，以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1） 的定量PCR管，如同实施例1中的验证试验2，检测正常P53蛋白标准品 。
最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的C t值，再用EXCEL的计算处理后，对于突变型P53蛋白标准品的检测，得 图4中“■”曲线所示的结果。对于正常P53蛋白标准品的检测，得图 4中“▲”曲线所示的结果，证明此产品不会检测出正常的P53蛋白。 以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值作为检测试剂的灵敏度 。证明本产品的对突变型P53蛋白的检测灵敏度达到0.01 pg/ml，并 且线性检测范围可达到7个数量级。而且野生型的P53蛋白对本产品无 干扰。
对比例2-1：
定量PCR管中加入交联剂溶液【浓度为100 ug/ml的EDC (1-乙基-3- [3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物) PBS溶液】50 ul/管，3 7 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗 涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量 PCR管。
然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其 余同实施例1。
最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的C t值，再用EXCEL的计算处理。得图5中“◆”曲线所示的结果。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值后，所对应的样品中突变型 P53蛋白浓度作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度为0.1 pg /ml。其结果比实施例1中直接包被法进行管壁固相PLA的灵敏度高10倍 左右, 差于实施例2中用戊二醛的交联剂固定法进行管壁固相PLA的灵 敏度0.01 pg/ml。
对比例2-2：
定量PCR管中加入交联剂溶液【DMSO溶解的浓度为1 mg/ml的SMCC（ 4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯】50 ul/管， 37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤3次（每次的用量为200 ul；洗 涤的目的是为了去除PCR管中没有反应的交联剂）；得前置处理后定量 PCR管。
然后以此前置处理后定量PCR管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，其 余同实施例1。
最终所得的结果为：上述检测结果，可得到每个样品经定量PCR后的C t值，再用EXCEL的计算处理。得图6中“◆”曲线所示的结果。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值后，所对应的样品中突变型 P53蛋白浓度作为检测试剂的灵敏度。证明本产品的灵敏度为0.1 pg /ml。其结果比实施例1中直接包被法进行管壁固相PLA的灵敏度高10倍 左右, 差于实施例2中用戊二醛的交联剂固定法进行管壁固相PLA的灵 敏度0.01 pg/ml。
实施例3 、对心肌肌钙蛋白cTnI的检测
人血清中心肌肌钙蛋白cTnI与心肌梗死密切相关。我们用检测灵敏度 较高的方式二的交联剂固定法进行管壁固相PLA检测心肌肌钙蛋白cTn I。即，按照实施例2，定量PCR管中加入交联剂溶液（体积浓度为1 ％的戊二醛溶液）50 ul/管，37 ℃放置5小时后，用去离子水洗涤 3次（每次的用量为200 ul；洗涤的目的是为了去除PCR管中没有反应 的交联剂）；得前置处理后定量PCR管。然后以此前置处理后定量PCR 管代替实施例1步骤1）的定量PCR管，但是用cTnI的单克隆抗体（购自 美国R&D公司，目录号：ab47003）替代P53突变体单克隆抗体包被到管 壁上。cTnI的多克隆抗体（购自美国R&D公司，目录号：ab19615）用 生物素修饰标记后，用此抗体替代生物素化的P53蛋白克隆制备PLA探 针1和PLA探针2。在cTnI阴性的正常人血清中加入重组的cTnI蛋白，配 置成不同浓度的cTnI标准品用于检测。其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：可得到每个样品经定量PCR后的Ct值，再用EXCEL 的计算处理结果。以0 pg/ml标准品孔的平均Ct值减去其3倍SD值作为 检测试剂的灵敏度。得图7中“◆” 曲线所示的结果。证明本方法对心肌肌钙蛋白cTnI的检测灵敏度达到 0.01 pg/ml，并且线性检测范围可达到7个数量级。这说明本方法可 以高灵敏度检测各种不同的蛋白质。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例 。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普 通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均 应认为是本发明的保护范围。