技术领域
本发明涉及一种分生孢子的生产方法，具体地说，涉及一种哈茨 木霉固体发酵生产分生孢子的方法。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丛 梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤 微生物的重要群落。木霉属真菌广泛分布于自然界，广泛存在于腐木、 种籽、植物残体、空气中，可从中分离得到。
木霉菌具有重要的经济意义，被广泛地应用到农业的各个方面， 如防治植物病害、促进植物生长、生物修复土壤和环境、应用于生物 有机肥等。近些年，木霉菌的研究与应用得到了快速的发展。结合遗 传学、分子生物学、生物化学及生态学等研究方法，木霉菌及其代谢 产物在促进植物生长，增加营养物质的吸收利用率，提高农作物的产 量，以及增强对病害的防御性方面势必有更为广阔的应用前景。特别 是在倡导绿色农业的大背景下，木霉菌的大面积推广应用已成为构建 现代和高效的生物防治病虫害体系中不可或缺的一部分。
随着社会的进步,人们越来越深刻地认识到长期大量使用化学农 药对生态环境和人类健康的危害。生物防治可以有效地克服这些弊端, 因而生物农药越来越受到人们的重视。其中拮抗微生物在植病生防中 的应用倍受人们关注。在2013年已发现的拮抗微生物中,木霉菌具有 很好的生防活性。
木霉属中应用最多的是哈茨木霉（Trichoderma harzianum）。在 哈茨木霉生产过程中容易出现菌丝生长过于旺盛，而分生孢子产量不 足的问题。用哈茨木霉制成菌剂用于农业方面的关键在于该菌剂含所 述分生孢子的数量，数量高，菌剂货架期就会比较长，此外分生孢子 数量高的菌剂能够在田间迅速萌发定殖，形成优势菌落，进而产生代 谢产物，作用于植株和植株的生长微环境，从而起到生防和促进植株 生长作用。因此，所述分生孢子的产量与菌剂的质量密切相关，因而 需要研究开发一种哈茨木霉高产分生孢子的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种哈茨木霉在固体培养基中高产分生孢 子的方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种发酵培养基，所述培 养基由以下重量份的物质组成：麸皮3-4.5份，豆粕粉0.75-1.5份，无 机盐离子溶液4-6.25份；其中，所述无机盐离子溶液的成分质量百分 比为：硫酸铵0.5%～2%、磷酸二氢钠0.05%～0.8%、磷酸氢二钠 0.05%～0.8%、磷酸氢二钾0.05%～0.5%、硫酸镁0.1%～1%、硫酸锰 0.1%～1%、蔗糖0.5%～2.5%、葡萄糖0.05%～2%，余量为水。
优选的，所述培养基由以下重量份的物质组成：麸皮3.8-4.2份， 豆粕粉0.8-1.2份，无机盐离子溶液4.6-5.6份；其中，所述无机盐离子 溶液的成分质量百分比为：硫酸铵0.8%～1.4%、磷酸二氢钠0.1%～ 0.5%、磷酸氢二钠0.1%～0.5%、磷酸氢二钾0.1%～0.4%、硫酸镁 0.2%～0.8%、硫酸锰0.2%～0.8%、蔗糖1%～1.8%、葡萄糖0.1%～ 1.2%，余量为水。
更为优选的，所述培养基由以下重量份的物质组成：麸皮4份， 豆粕粉1份，无机盐离子溶液5份；其中，所述无机盐离子溶液的成分 质量百分比为：硫酸铵1.25%、磷酸二氢钠0.4%、磷酸氢二钠0.4%、 磷酸氢二钾0.25%、硫酸镁0.55%、硫酸锰0.55%、蔗糖1.5%、葡萄糖 1%，余量为水。
本发明还提供了前述发酵培养基在哈茨木霉发酵生产分生孢子 中的应用。
本发明还提供了一种哈茨木霉固体发酵生产分生孢子的方法，包 括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和发酵培养基的配制及发酵控制 工艺步骤。
其中发酵步骤以前述发酵培养基为培养基，置于发酵培养箱中并 在日光灯照射下培养，培养温度为22℃～29℃，培养时间为6～9天， 培养期间通入无菌空气，通气量为2.5L/min，保证发酵箱中相对湿度 在80%以上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基。
温度低于22℃时，哈茨木霉生长缓慢；温度高于29℃时，发酵箱 中的培养基会变坏变臭，导致发酵失败。发酵相对湿度低于80%时， 培养基容易变干，培养基变干后发酵只产菌丝不产孢子。发酵时间低 于6天时，哈茨木霉尚未全部产分生孢子；发酵时间6～9天为哈茨木霉 产分生孢子的活跃期；发酵时间超过9天时，培养基不再产生分生孢 子。
本发明还提供了利用上述方法生产得到的哈茨木霉分生孢子。
本发明还提供了一种含有上述分生孢子的生物菌剂。
该菌剂主要用于秸秆的腐熟。主要微生物为哈茨木霉、枯草芽孢 杆菌。其中的主要成分含量为：哈茨木霉1.05亿/g、黑曲霉2.0亿/g、 米曲霉2.0亿/g、枯草芽孢杆菌5.0亿/g、地衣芽孢杆菌5.0亿/g。
本发明对哈茨木霉的发酵方法，可产生大量的分生孢子，基质孢 子量最高可达4.89*109cfu/g，发酵单位高，生产过程不产生废料，全 过程零排放，环保无污染。发酵所获得的孢子—基质混合物经干燥后 可直接用于生产，生产出来的分生孢子可用于农作物的生防及秸秆的 腐熟。
附图说明
图1为本发明所述发酵培养基上生长的哈茨木霉；
图2为本发明所述方法生产得到的分生孢子粉；
图3为本发明所述方法生产得到的分生孢子镜检图；
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1发酵生产分生孢子
1、液体种子的制作方法
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 ACCC31707菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后然后转接至PDA 的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。
配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数 计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、 余量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后 在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下倒入该液体培养基 中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。
检测悬浮液菌落数为1.62*108cfu/mL。检测方法为采用梯度稀释 法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。
2、三角瓶固体种子制备方法
按麸皮4.8Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制固 体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：硫酸铵8g、磷酸二氢钾8g、 结晶硫酸镁16g、硫酸锰0.8g、硫酸亚铁2.4g、葡萄糖40g，余量为水。 配制好培养基后分装至三角瓶，每个三角瓶的装量为90g固体种子培 养基。用棉塞塞好羊皮纸绑好口子后灭菌处理，温度121℃，灭菌25 分钟。
待固体种子培养基冷却后，在超净工作台中接种培养好的液体种 子，接种量为10mL，振荡混合均匀后放入恒温培养箱中培养，日光 灯照射下培养，培养温度为24℃。培养时间为4天
3、固体发酵产孢
按麸皮4Kg，豆粕粉1Kg，无机盐离子溶液5Kg的比例配置好固 体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵62.5g、磷酸二氢钠 20g、磷酸氢二钠20g、磷酸二氢钾12.5g、硫酸镁27.5g、硫酸锰27.5g、 蔗糖75g、葡萄糖50g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的 装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的固体种子100g，用铲子将种子和固体发酵培养 基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光灯照射下培养，培养温度 为25℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度 在80%以上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是 7天。
4、后处理
培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为35℃， 干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢子粉（如图1所示），对分生孢子进行 镜检，镜检图如图2所示。检测哈茨木霉分生孢子量达到4.89*109cfu/g。 检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。
实施例2发酵生产分生孢子
1、液体种子的制作方法
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 ACCC31707菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后然后转接至PDA 的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。
配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数 计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1%、吐温80含量为0.1%、余 量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后在 超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下倒入该液体培养基中， 在恒温摇床中培养18小时，培养温度为24℃。
检测悬浮液菌落数为1.2*108cfu/mL。检测方法为采用梯度稀释 法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。
2、三角瓶固体种子制备方法
按麸皮4.8Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制固 体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：硫酸铵8g、磷酸二氢钾8g、 硫酸镁16g、硫酸锰0.8g、硫酸亚铁2.4g、葡萄糖40g，余量为水。配 制好培养基后分装至三角瓶，每个三角瓶的装量为90g固体种子培养 基。用棉塞塞好羊皮纸绑好口子后灭菌处理，温度121℃，灭菌25分 钟。
待固体种子培养基冷却后，在超净工作台中接种培养好的液体种 子，接种量为8mL，振荡混合均匀后放入恒温培养箱中培养，日光灯 照射下培养，培养温度为24℃。培养时间为4天，以三角瓶内刚刚长 满了白色菌丝为宜，菌丝生长不宜过久，过久则会产孢，不利于哈茨 木霉在浅盘中快速生长繁殖。
3、固体发酵产孢
按麸皮3Kg，豆粕粉0.75Kg，无机盐离子溶液6.25Kg的比例配置 好固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵31.25g、磷酸二 氢钠3.12g、磷酸氢二钠3.12g、磷酸二氢钾3.12g、硫酸镁6.25g、硫酸 锰6.25g、蔗糖31.25g、葡萄糖3.12g，余量为水。配好后分装至面粉 袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的固体种子50g，用铲子将种子和固体发酵培养 基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光灯照射下培养，培养温度 为24℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度 在80%以上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是 7天。
4、后处理
培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为35℃， 干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢子粉，检测哈茨木霉分生孢子量达到 2.65*109cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。 实施例3发酵生产分生孢子
1、液体种子的制作方法
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 ACCC31707菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后然后转接至PDA 的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。
配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数 计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、 余量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后 在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下倒入该液体培养基 中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。
检测悬浮液菌落数为1.62*108cfu/mL。检测方法为采用梯度稀释 法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。
2、三角瓶固体种子制备方法
按麸皮4.8Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制固 体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：硫酸铵8g、磷酸二氢钾8g、 结晶硫酸镁16g、硫酸锰0.8g、硫酸亚铁2.4g、葡萄糖40g，余量为水。 配制好培养基后分装至三角瓶，每个三角瓶的装量为90g固体种子培 养基。用棉塞塞好羊皮纸绑好口子后灭菌处理，温度121℃，灭菌25 分钟。
待固体种子培养基冷却后，在超净工作台中接种培养好的液体种 子，接种量为10mL，振荡混合均匀后放入恒温培养箱中培养，日光 灯照射下培养，培养温度为24℃。培养时间为4天
3、固体发酵产孢
按麸皮4.5Kg，豆粕粉1.5Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制好 固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵80g、磷酸二氢钠 32g、磷酸氢二钠32g、磷酸二氢钾20g、硫酸镁40g、硫酸锰40g、蔗 糖100g、葡萄糖80g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的 装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的固体种子100g，用铲子将种子和固体发酵培养 基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光等照射下培养，培养温度 为25℃，通入无菌空气2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以上， 在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是8天。
4、后处理
培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为35℃， 干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢子粉，检测哈茨木霉分生孢子量达到 1.83*109cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。 实施例4发酵生产分生孢子
1、液体种子的制作方法
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 ACCC31707菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后然后转接至PDA 的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。
配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数 计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、 余量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后 在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下倒入该液体培养基 中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。
检测悬浮液菌落数为1.62*108cfu/mL。检测方法为采用梯度稀释 法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。
2、三角瓶固体种子制备方法
按麸皮4.8Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制固 体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：硫酸铵8g、磷酸二氢钾8g、 结晶硫酸镁16g、硫酸锰0.8g、硫酸亚铁2.4g、葡萄糖40g，余量为水。 配制好培养基后分装至三角瓶，每个三角瓶的装量为90g固体种子培 养基。用棉塞塞好羊皮纸绑好口子后灭菌处理，温度121℃，灭菌25 分钟。
待固体种子培养基冷却后，在超净工作台中接种培养好的液体种 子，接种量为10mL，振荡混合均匀后放入恒温培养箱中培养，日光 灯照射下培养，培养温度为24℃。培养时间为4天
3、固体发酵产孢
按麸皮4.2Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液5.6Kg的比例配制 固体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：无机盐离子溶液的成分 为硫酸铵78.4g、磷酸二氢钠28g、磷酸氢二钠28g、磷酸二氢钾22.4g、 硫酸镁44.8g、硫酸锰44.8g、蔗糖100.8g、葡萄糖67.2g，余量为水。 配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃， 灭菌时间30分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的固体种子100g，用铲子将种子和固体发酵培养 基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光灯照射下培养，培养温度 为22℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度 在80%以上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是 9天。
4、后处理
培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为35℃， 干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢子粉，检测哈茨木霉分生孢子量达到 3.5*109cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。
实施例5发酵生产分生孢子
1、液体种子的制作方法
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 ACCC31707菌种在PDA试管斜面上活化，经活化后然后转接至PDA 的茄形瓶中培养，培养温度28℃，培养时间4天。
配制哈茨木霉斜面种子液体活化培养基，培养基成分按质量分数 计：硫酸铵含量为1.5%、葡萄糖含量为1.2%、吐温80含量为0.2%、 余量为水。按上述比例配培养基250mL，121℃灭菌15分钟，冷却后 在超净工作台中将培养好的茄子瓶斜面菌苔刮下倒入该液体培养基 中，在恒温摇床中培养18小时，培养温度为28℃。
检测悬浮液菌落数为1.62*108cfu/mL。检测方法为采用梯度稀释 法，用涂布法检测，检测用培养基为PDA培养基。
2、三角瓶固体种子制备方法
按麸皮4.8Kg，豆粕粉1.2Kg，无机盐离子溶液4Kg的比例配制固 体种子培养基。无机盐离子溶液的成分为：硫酸铵8g、磷酸二氢钾8g、 结晶硫酸镁16g、硫酸锰0.8g、硫酸亚铁2.4g、葡萄糖40g，余量为水。 配制好培养基后分装至三角瓶，每个三角瓶的装量为90g固体种子培 养基。用棉塞塞好羊皮纸绑好口子后灭菌处理，温度121℃，灭菌25 分钟。
待固体种子培养基冷却后，在超净工作台中接种培养好的液体种 子，接种量为10mL，振荡混合均匀后放入恒温培养箱中培养，日光 灯照射下培养，培养温度为24℃。培养时间为4天
3、固体发酵产孢
按麸皮3.8Kg，豆粕粉0.8Kg，无机盐离子溶液4.6Kg的比例配制 好固体发酵培养基。无机盐离子溶液的成分为硫酸铵36.8g、磷酸二 氢钠4.6g、磷酸氢二钠4.6g、磷酸二氢钾4.6g、硫酸镁9.2g、硫酸锰9.2g、 蔗糖46g、葡萄糖4.6g，余量为水。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋 的装量约为3.3Kg，灭菌条件为121℃，灭菌时间30分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的固体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的固体种子100g，用铲子将种子和固体发酵培养 基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光灯照射下培养，培养温度 为29℃，通入无菌空气，通入量为2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度 在80%以上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是 6天。
4、后处理
培养结束将发酵基质用鼓风热循环烘箱干燥，干燥温度为35℃， 干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢子粉，检测哈茨木霉分生孢子量达到 3.8*109cfu/g。检测方法为涂布法，所用检测培养基为PDA培养基。
实施例6发酵生产分生孢子（对比实验）
为说明本发明的优势，选择国内公开发表比较先进的方法进行比 较说明。本实施例为目前国内公布的适宜于车间生产哈茨木霉分生孢 子的发酵方法，中国专利公开号为CN101748070A。
具体步骤如下：
1、斜面菌种活化
采用固体PDA培养基，将ACCC30317菌株二代种子接种在试 管培养基上，28℃培养4天。
2、种子发酵液的制备
液体发酵培养液的成分为：全麦粉2%、葡萄糖0.5%、酵母膏 0.2%、CaCO31.0%、KH2PO40.4%、MgSO4·7H2O、pH7.0。采用500mL 的三角瓶装培养液，装液量为200mL。采用高温高压121℃，20min 条件灭菌。在无菌条件下接种哈茨木霉斜面种子至摇瓶。置于双层小 容量摇床培养，培养温度为26℃、200rmp，开启摇床日光灯，培养 时间为5天。
3、固体发酵培养
按复方甘蔗片渣：玉米粉：豆饼粉比例为93:6:2的比例配制固体 培养基4kg，加水6kg，混匀。配好后分装至面粉袋灭菌，每袋的装量 约为3.3Kg，灭菌条件为0.13～0.17MPa高压、121℃，灭菌时间100 分钟。
将空气过滤器、空气管道、发酵箱进行蒸气灭菌，发酵用不锈钢 盘子用高压锅灭菌处理，灭菌条件为121℃，灭菌时间15分钟。并且 用过氧乙酸对环境进行消毒处理。
在超净工作台中接种培养好的液体种子，不锈钢盘子装培养基 1Kg/盘，接种培养好的液体种子100g，用铲子将液体种子和固体发酵 培养基混合均匀后放入发酵培养箱中培养，日光照射下培养，培养温 度为25℃，通入无菌空气2.5L/min，调节发酵箱中相对湿度在80%以 上，在发酵过程中每隔2～3天翻动一次培养基，培养时间是8天。
4、后处理
培养结束将发酵基质自然风干，干燥粉碎后即得哈茨木霉分生孢 子粉，检测哈茨木霉分生孢子量达到8.6*108cfu/g。检测方法为涂布 法，所用检测培养基为PDA培养基。
通过实施例比较可以看出，本发明所述方法比目前公开的哈茨木 霉发酵产分生孢子方法培养的分生孢子量数量提高了一个数量级，更 适用于大规模生产哈茨木霉分生孢子，可产生规模经济效益。
实施例7含分生孢子菌剂的制备
本发明还提供了一种含上述分生孢子的一种生物制剂。该生物制 剂为可溶性秸秆腐熟剂，该生物制剂按重量份计构成如下：复合菌剂 20份、营养成分50份、植物源乳化渗透剂5份、可溶性载体25份。 所述复合菌剂构成如下：哈茨木霉1.05亿/g、黑曲霉2.0亿/g、米曲 霉2.0亿/g、枯草芽孢杆菌5.0亿/g和地衣芽孢杆菌5.0亿/g。
所述复合菌剂由以下步骤制得：
细菌混合孢子粉的制备：
1）斜面培养：将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，原始菌种在 无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在28±2℃条件下培养48小 时；
2）摇床培养：将上述步骤1）培养的菌种在无菌条件下分别 接种于液体培养基，在pH6.5、温度为30℃条件下，160r/min摇床培 养36小时；
3）发酵罐培养：将上述步骤2）培养的菌种在无菌条件下分 别接种于发酵罐培养基，在pH8.0、罐压0.5kg、温度为30℃、通风 量1：0.8-1.1条件下，培养56小时后，菌数大于1.0×1010cfu/mL， 80％菌体转成芽孢时下罐，得到发酵液；
4）将步骤3）中得到的发酵液按等重量混合，经过浓缩干燥制 备成细菌混合孢子粉；
在上述细菌混合孢子粉的制备中，步骤1）中选用的斜面培养基 的配方如下：葡萄糖15g、鱼蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000mL、琼 脂15g。上述步骤2）中的液体培养基配方如下：葡萄糖10g、牛肉 膏5g、酵母粉5g、淀粉10g、豆饼粉5g、K2HPO40.5g、MgSO40.2g、 水1000mL。上述步骤3）中的发酵罐培养基配方如下：玉米粉26kg、 豆饼粉16kg、硫酸铵4kg、葡萄糖8kg、酵母粉2.5kg、蛋白胨1.7kg、 加水至600kg。
真菌混合孢子粉的制备：
1）米曲霉、黑曲霉，原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培 养基上，在28±2℃条件下培养48小时；
2）摇床培养：将上述步骤1）培养的菌种在无菌条件下分别 接种于液体培养基，在pH6.6、温度为30℃条件下，160r/min摇床培 养24小时；
3）发酵罐培养：将上述步骤2）培养的菌种在无菌条件下分别 接种于发酵罐培养基，在pH6.6、罐压0.5kg、温度为28℃、通风量 为1：0.6，在培养48h后，菌丝体约占总体积的20％时终止发酵， 进行固体发酵产孢；
4）固体发酵产孢：将上述步骤3）经过发酵罐培养后的菌丝体 接种到固体发酵培养基上，培养48h，90％产孢；
5）哈茨木霉的生产方法按本专利申请所述方法进行；
6）将上述步骤4）、5）中完全产孢的培养基分别浸在清水中制 成孢子悬浮液，从而得到哈茨木霉孢子悬浮液、米曲霉孢子悬浮液、 黑曲霉孢子悬浮液；
7）将上述步骤5）中得到的哈茨木霉孢子悬浮液、黑曲霉孢子 悬浮液、米曲霉孢子悬浮液分别浓缩干燥制备成真菌混合孢子粉；然 后，按照1∶1∶1比例混合配制成真菌混合孢子粉。
在上述真菌混合孢子粉的制备中，步骤1）中选用的斜面培养基 的配方如下：葡萄糖20g、土豆汁200g、琼脂20g、水1000mL，pH自 然。上述步骤2）中的液体培养基配方如下：白糖20g、酵母膏0.5g、。 淀粉20g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸镁0.2g、氯化钠0.2g、水1000mL。 上述步骤3）中的发酵罐培养基配方如下：淀粉12kg、豆饼粉1.2kg、 玉米粉3kg、白糖12kg、酵母膏0.3kg、硫酸镁0.12kg、氯化钠0.12kg、 加水至600kg。上述步骤4）中的固体发酵培养基配方如下：固体料： 棉籽壳25kg、玉米粉10kg、麸皮65kg。固体料与水的重量比为1： 0.8。将上述制得的细菌混合孢子粉和真菌混合孢子粉按照4：1的 比例混合，从而制备得到复合菌剂。
所述乳化剂为植物源表面活性剂，所述植物源表面活性剂为油茶 饼浸提物。
所述营养成分是按照下述方法制备：将白砂糖、红砂糖、淀粉、 蛋白粉、用氨基酸或腐植酸螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼，按照1： 2.8：5：1：0.2的质量配比混合均匀制得。
所述用氨基酸和或腐植酸螯合的铁、硼、锌、铜、锰和钼购自成 都螯合生物技术有限公司。产品名称为螯合微量元素。其中铁、硼、 锌、铜、锰、钼均为氨基酸螯合物。螯合态微量元素总含量(铁+硼 +锌+铜+锰+钼)≥8％。
所述可溶性载体为可溶性淀粉。
实施例8腐熟秸秆的效果实验
1、试验目的：
验证含哈茨木霉分生孢子的菌剂对玉米秸秆的降解作用及哈茨 木霉对秸秆腐熟降解的作用。
2、试验材料：
由实施例7制备得到的一种可溶性秸秆腐熟剂；
按实施例7方法制备的不加哈茨木霉的一种可溶性秸秆腐熟剂；
秸秆：玉米秸秆（粉碎）；
尿素：普通施用尿素；
水：自来水。
3、实验设计：
1）试验地点：温室。室内温度控制：22℃-25℃、平均湿度： 60％。
2）秸秆降解试验设置4个处理：
处理1：秸秆220g+一种可溶性秸秆腐熟剂+尿素+水
处理2：秸秆220g+不加哈茨木霉的一种可溶性秸秆腐熟剂+ 尿素+水
处理3：秸秆220g+尿素+水
处理4：秸秆220g+水
4、试验方法：
1）准备菌液或溶液：
处理1：按推荐比例(一种可溶性秸秆腐熟剂∶水∶尿素＝ 150∶45000∶4000)(重量比)配制菌液。
处理2：按推荐比例(不加哈茨木霉的一种可溶性秸秆腐熟 剂∶水∶尿素＝150∶45000∶4000)(重量比)配制菌液。
处理3：不加一种可溶性秸秆腐熟剂，按推荐比例(水∶尿素＝ 45000∶4000)(重量比)配制溶液。
处理4：只加水。
2）将玉米秸秆按每个处理220g装盆，按推荐使用量进行计算， 处理1喷施菌液16.5ml，处理2喷施尿素溶液16.5ml，处理3喷施 尿素溶液16.5ml，处理4喷施水16.5ml，用土将秸秆封闭。
3）每天喷水，保持秸秆湿度，以利于微生物生长和秸秆腐熟， 各处理秸秆喷水量基本一致，保持含水量为60％。
4）每三天观察一次秸秆腐解程度，项目包括：颜色，手感，抗 拉力。
5）将各处理秸秆烘干，称取质量，计算腐解率，比较各个处理 的腐解速率。
5、试验结果：
1）颜色、手感及抗拉力变化：从颜色、手感及抗拉力方面比较 3个处理的秸秆腐解变化情况，两周后经一种可溶性秸秆腐熟剂处理 的秸秆腐解效果显著，处理1中秸秆颜色变黑，用手抓有糜烂感，抗 拉力相当差。处理1的腐解速度较处理2、处理3和处理4快，经 现场肉眼查看发现处理1腐熟程度较处理2、处理3和处理4大。
2）腐解率：腐解率为腐烂样的重量占总重量的比。经过计算， 15天后处理1腐解率为94.5％，比处理2（腐熟率为66.2%）的高 出28.3%，比处理3（腐解率为38.3％）的高出56.2%，比处理4（腐 解率为33.8％）高出60.7%。
6、结论：
本实验说明一种可溶性秸秆腐熟剂对玉米秸秆有着很显著的腐 熟效果，同时说明哈茨木霉在该菌剂中起到重要的作用。具体的原因 在于玉米秸秆主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。纤维素、半纤 维素、木质素形成一个复杂的结构，其中木质素的包被作用严征阻碍 着纤维素酶对纤维素的作用。而哈茨木霉能够产漆酶等物质对秸秆中 的木质素进行分解，进而有利于将秸秆里面的纤维素物质暴露出来直 接和其他微生物产生的纤维素酶反应，从而加快了秸秆腐熟的进度。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。