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1、(10)申请公布号 CN 102787127 A (43)申请公布日 2012.11.21 CN 102787127 A *CN102787127A* (21)申请号 201210184123.6 (22)申请日 2012.09.07 C12N 15/52(2006.01) C12N 15/10(2006.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/41(2006.01) (71)申请人 上海大学 地址 200444 上海市宝山区上大路 99 号 (72)发明人 朱晨光 宋任涛 王佩佩 沈春磊 唐远平 许政暟 (74)专利代理机构 上海上。
2、大专利事务所 ( 普通 合伙 ) 31205 代理人 陆聪明 (54) 发明名称 快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种快速克隆细菌谷氨酰胺合 成酶 （GS） 基因的方法。该方法的主要内容包括 ： （1） 针对细菌类群的 GS 基因序列设计嵌套式兼并 引物 ；（2） 使用嵌套引物中的外引物和内引物下 游引物对土壤 DNA 进行第一轮扩增， 扩增产物纯 化后作为模版， 用内引物上下游引物进行第二轮 PCR 扩增 ；（3） 对第二轮扩增后的特异片段进行纯 化， 连接pMD18-T载体， 转化大肠杆菌Top10， 挑取 正确的阳性克隆 ；（4） 对阳性克隆的插入片段进 。
3、行测序和序列分析， 确定基因的正确性 ；（5） 用大 肠杆菌 GS 缺陷型 ET6017 的功能互补实验来验证 所克隆基因的功能。本发明所描述的基因克隆方 法具有很高的成功率和较好的准确性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法， 其特征在于该方法的具体步骤如 下 ： a. 根据常见细菌类群的 GS 基因序列设计嵌套式兼并引物， 引物序列如下 ： a-1.。
4、 扩增假单胞菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Ps4-elF: 5 -GCATCACCCAAATTCAAGGG-3 内引物上游引物 Ps4F: 5 -ATGTCGAAGTCGGTTCAACT-3 内引物下游引物 Ps4R: 5 -TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3 ； a-2. 扩增蜡样芽胞杆菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Bc1-elF: 5 -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3 内引物上游引物 Bc1F: 5 -ATGGCTAGGTACACAAAAGA-3 内引物下游引物 Bc1R: 5 -TTAGTAHAGAGACATATATT-3 ； a-3. 扩增根瘤菌 GS 。
5、I 基因的引物 ： 外引物 Rz1-elF: 5 -CGCAAAGTCCGWTACCGTCA-3 内引物上游引物 Rz1F: 5 -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3 内引物下游引物 Rz1R: 5 -TCAGGCCGAATARTACATGT-3 ； a-4. 扩增根瘤菌 GS II 基因的引物 ： 外引物 Rz2-elF: 5 -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3 内引物上游引物 Rz2F: 5 -ATGACAAAATATAAGCTCGA-3 内引物下游引物 Rz2R: 5 -TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3 ； b. 使用嵌套引物中的外引物和内引物下游引物对。
6、所抽提的环境样品总 DNA 进行第一 轮 PCR 扩增， 扩增产物纯化后作为模版， 用内引物上下游引物进行第二轮 PCR 扩增， 得到第 二轮扩增产物 ； c. 对步骤 b 所得第二轮扩增产物进行纯化， 连接 pMD18-T 载体， 转化大肠杆菌 Top10， 挑取正确的阳性克隆， 即得到细菌谷氨酰胺合成酶基因。 2. 根据权利要求 1 所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法， 其特征在于所述 的所抽提的环境样品的总 DNA 是指从土壤、 污泥或人畜胃肠道中抽提的样品的总 DNA。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法， 其特征在于 设计嵌套式兼并引物。
7、的具体步骤为 ： 先挑选一种细菌种属的所有 GS 基因序列中数量较多 的一组相似序列群的读码框区域为模版， 进行简并引物设计， 得到内引物上游引物和内引 物下游引物 ； 同时针对细菌种属的GS基因读码框的起始密码上游约4065bp位置区段再设 计一条引物， 该引物即为外引物。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法， 其特征在于 所述的挑取正确的阳性克隆的方法为 ： 将第二轮扩增产物进行纯化后， 连接 pMD18-T 载体， 转化大肠杆菌 Top10 菌株， 获得一系列单克隆后， 再用内引物 PCR 验证， 挑取正确的阳性克 隆。 权 利 要 求 书 CN 。
8、102787127 A 2 1/4 页 3 快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法。 背景技术 0002 原核生物 （尤其是细菌） 几乎生存于地表的所有区域， 它们拥有巨大的潜在基因资 源， 等待被科学地开发和利用。 已有文献表明， 目前能够从环境中被分离和鉴定的细菌种类 还不到地球所有细菌种属的 1%。因此， 如要对环境中的细菌基因进行挖掘， 就必须避开细 菌的不可培养性， 直接从环境宏基因组中克隆相应的细菌基因。土壤是一类复杂的天然生 境， 是微生物尤其是细菌的大本营， 含有十分丰富的细菌多样性。近十几年来， 从土壤宏基。
9、 因组中获取细菌的特异功能基因一直是全世界微生物学家的关注热点之一。 目前从土壤中 筛选特异功能基因的主要技术手段是 ： 通过大肠杆菌和克隆载体构建高覆盖率的宏基因组 文库， 然后用基于序列或基于功能的方法从文库中克隆特异的基因。此类方法尽管可以筛 选到新颖的功能基因， 但由于高覆盖率文库构建的复杂性以及后期文库中阳性克隆筛选工 作的高通量、 低几率， 给此法的推广应用前景带来一定的困难。 0003 对于生物体的生长发育而言， 氮素的同化是十分重要的生理过程。无机氮必须 同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶 (glutamine synthetase ,GS) 是。
10、 GS-GOGAT 氮同化路径上的关键酶， 催化 NH4+和谷氨酸同化成谷氨酰 胺， 谷氨酰胺在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体， 外界的无机氮元素也通过 这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此， GS 在生物体氮同化过程中起了十分重要的 作用， 从土壤等生物多样性很丰富的复杂环境中直接克隆 GS 基因具有十分重要的现实意 义。发明内容 本发明的目的在于提供一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法。 0004 基于上述目的， 本发明以细菌中普遍存在的 GS 为目标基因， 通过同源基因保守性 分析设计种属特异性的兼并引物， 以巢式PCR为获取基因的主要技术， 克隆到了5个谷氨酰 合成酶。
11、基因， 它们在大肠杆菌 GS 基因缺陷型菌株 ET6017 中均实现了对宿主菌 GS 功能的恢 复， 证明这 5 个基因都具有谷氨酰胺合成酶的活性， 表明本发明方法用于克隆土壤中的 GS 基因是切实可行的。 0005 本发明是通过以下技术方案实现的 ： 一种快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法， 其特征在于该方法的具体步骤如下 ： a. 根据常见细菌类群的 GS 基因序列设计嵌套式兼并引物， 引物序列如下 ： a-1. 扩增假单胞菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Ps4-elF: 5 -GCATCACCCAAATTCAAGGG-3 内引物上游引物 Ps4F: 5 -ATGTCGAAGTCGGT。
12、TCAACT-3 内引物下游引物 Ps4R: 5 -TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3 ； a-2. 扩增蜡样芽胞杆菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Bc1-elF: 5 -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3 说 明 书 CN 102787127 A 3 2/4 页 4 内引物上游引物 Bc1F: 5 -ATGGCTAGGTACACAAAAGA-3 内引物下游引物 Bc1R: 5 -TTAGTAHAGAGACATATATT-3 ； a-3. 扩增根瘤菌 GS I 基因的引物 ： 外引物 Rz1-elF: 5 -CGCAAAGTCCGWTACCGTCA-3 内引物上游引物 R。
13、z1F: 5 -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3 内引物下游引物 Rz1R: 5 -TCAGGCCGAATARTACATGT-3 ； a-4. 扩增根瘤菌 GS II 基因的引物 ： 外引物 Rz2-elF: 5 -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3 内引物上游引物 Rz2F: 5 -ATGACAAAATATAAGCTCGA-3 内引物下游引物 Rz2R: 5 -TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3 ； b. 使用嵌套引物中的外引物和内引物下游引物对所抽提的环境样品总 DNA 进行第一 轮 PCR 扩增， 扩增产物纯化后作为模版， 用内引物上下游引物进行第二轮 P。
14、CR 扩增， 得到第 二轮扩增产物 ； c. 对步骤 b 所得第二轮扩增产物进行纯化， 连接 pMD18-T 载体， 转化大肠杆菌 Top10， 挑取正确的阳性克隆， 即得到细菌谷氨酰胺合成酶基因。 0006 上述的所抽提的环境样品的总 DNA 是指从土壤、 污泥或人畜胃肠道中抽提的样品 的总 DNA。 0007 上述的设计嵌套式兼并引物的具体步骤为 ： 先挑选一种细菌种属的所有 GS 基 因序列中数量较多的一组相似序列群的读码框区域为模版， 进行简并引物设计， 得到内引 物上游引物和内引物下游引物 ； 同时针对细菌种属的 GS 基因读码框的起始密码上游约 4065bp 位置区段再设计一条引物。
15、， 该引物即为外引物。 0008 上述的挑取正确的阳性克隆的方法为 ： 将第二轮扩增产物进行纯化后， 连接 pMD18-T 载体， 转化大肠杆菌 Top10 菌株， 获得一系列单克隆后， 再用内引物 PCR 验证， 挑取 正确的阳性克隆。 0009 与现有的土壤文库筛选克隆技术相比， 本发明所描述的方法具有快速简便的优 点， 尤其适用于克隆与已知基因有一定序列同源度的同类基因。本发明方法具有良好通用 性， 可以适用于克隆来自土壤， 污泥， 人畜胃肠道等各种复杂环境样品中的细菌谷氨酰胺合 成酶基因。 附图说明 0010 图 1 是实施例二的 PCR 产物电泳图。A 图中 16 泳道是以引物 Bc。
16、1-elF 和 Bc1R 扩增 6 份土样的结果， 712 泳道是以引物 Rz1-elF 和 Rz1R 扩增 6 份土样的结果， 1318 泳 道是以内引物Bc1F和Bc1R用6份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果， 1924泳 道是以内引物 Rz1F 和 Rz1R 用 6 份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果， M 是 100 bp DNA Ladder。B 图中 16 泳道是以引物 Ps4-elF 和 Ps4R 扩增 6 份土样的结果， 712 泳 道是以内引物 Ps4F 和 Ps4R 用 6 份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果， M 是 100 bp DNA Ladd。
17、er。C 图中 16 泳道是以引物 Rz2-elF 和 Rz2R 扩增 6 份土样的结果， 712 泳 道是以内引物 Rz2F 和 Rz2R 用 6 份第一轮扩增产物为模版进行第二轮扩增的结果， M 是 100 bp DNA Ladder。图中白箭头所指的是扩增出的 GS 基因特异条带。 说 明 书 CN 102787127 A 4 3/4 页 5 0011 图 2 是实施例三的 5 个 GS 基因重组质粒和空载 pMD18-T 的大肠杆菌 ET6017 转化 子细胞在 M9 液体培养基中的生长情况监测图。 具体实施方式 0012 本发明实施例以土壤为样品， 说明土壤中常见细菌类群的目标基因谷。
18、氨酰胺 合成酶 （GS） 基因的克隆方法 实施例一 ： 一、 土 壤 中 常 见 的 细 菌 种 类 有 蜡 样 芽 孢 杆 菌 （Bacillus cereus） 、 根 瘤 菌 属 （Rhizobiumspp） 、 假单胞菌属 （Pseudomonas spp） 等。根据 GenBank 中收录的这些种属细 菌的 GS 基因序列先设计了 4 套引物 （每套引物均为挑选该种属的所有 GS 基因序列中数量 多的一组相似序列群的读码框区域为模版， 进行简并引物设计） ， 作为巢氏PCR的内引物， 该 引物扩增的反应称为第二轮扩增， 可获得基因的读码框全序列 ； 同时针对读码框的起始密 码上游约 。
19、4065bp 区段再设计一条对应的外引物， 与相应的内引物下游引物组成一对新引 物， 这对引物扩增的反应称为第一轮扩增。 0013 本实施例中所设计的引物如下 ： 扩增假单胞菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Ps4-elF: 5 -GCATCACCCAAATTCAAGGG-3 内引物上游引物 Ps4F: 5 -ATGTCGAAGTCGGTTCAACT-3 内引物下游引物 Ps4R: 5 -TCAGCAGCTGTAGTAMAGCT-3 扩增蜡样芽胞杆菌 GS 基因的引物 ： 外引物 Bc1-elF: 5 -ACTGATTCTGAAGGTGTTTA-3 内引物上游引物 Bc1F: 5 -ATGGC。
20、TAGGTACACAAAAGA-3 内引物下游引物 Bc1R: 5 -TTAGTAHAGAGACATATATT-3 扩增根瘤菌 GS I 基因的引物 ： 外引物 Rz1-elF: 5 -CGCAAAGTCCGWTACCGTCA-3 内引物上游引物 Rz1F: 5 -ATGGCGACCGCAAGCGAAAT-3 内引物下游引物 Rz1R: 5 -TCAGGCCGAATARTACATGT-3 扩增根瘤菌 GS II 基因的引物 ： 外引物 Rz2-elF: 5 -CTCCGGRTTTGCTCACCTTC-3 内引物上游引物 Rz2F: 5 -ATGACAAAATATAAGCTCGA-3 内引物下游。
21、引物 Rz2R: 5 -TYARGCKGCAGCGGAAGCCG-3 二、 用设计的 4 套引物从土壤宏基因组中扩增 GS 基因 以 6 份土壤样品的宏基因组 DNA 为模板， 用 4 套引物中的外引物和内引物下游引物组 合进行第一轮 PCR， 扩增后的产物经过试剂盒液体回收纯化后， 作为模板， 再以 4 套引物中 的内引物上下游引物进行第二轮 PCR， 结果部分土样的宏基因组中扩增出了明显的 GS 基因 特异条带 （见图 1） ， 条带的大小与预期的大小一致。将获得的特异 DNA 条带经过割胶回收， 连接 pMD18-T 载体， 热激转化大肠杆菌 Top10 感受态， 挑取正确的阳性克隆， 。
22、获得 5 个相应 的细菌谷氨酰胺合成酶基因， 其核苷酸序列已经递交到美国 NCBI 的 GenBank 数据库， 序列 登录号依次为 JX017366JX017370。 说 明 书 CN 102787127 A 5 4/4 页 6 实 施 例 二 ： 经 PCR 验 证 正 确 的 转 化 子 抽 提 质 粒， 以 M13 引 物 对 （正 向 引 物 5 -CAGGAAACAGCTATGAC-3 ， 反向引物 5 -GTTTTCCCAGTCACGAC-3 ） ， 用 MegaBACE 4500 DNA 测序仪 （Amersham Biosciences） 进行双向测序。所获得的 5 个 GS。
23、 基因序列与已知的 同类基因进行序列分析后， 结果如表 1。 0014 表 1 本发明所克隆的来自土壤宏基因组的细菌谷氨酰胺合成酶基因同源性分析 从序列分析的结果可以看出， 所获得的 5 个基因分别属于 I 型和 II 型谷氨酰胺合成酶 基因家族， 它们和已知的同类基因氨基酸序列同源度在 94%99% 之间。 0015 实施例三 ： 所克隆的 5 个 GS 基因对大肠杆菌 GS 缺陷型 ET6017 的功能互补 大 肠 杆 菌 谷 氨 酰 胺 合 成 酶 基 因 缺 陷 型 ET6017 araD139B/r (argF-lac)169flhD5301 (fruK-yeiR)725(fruA2。
24、5) relA1 rpsL150(strR) (glnG-glnA)229 rha-10 deoC1 购自美国耶鲁大学大肠杆菌遗传保藏中心。由于缺乏 谷氨酰胺合成酶基因， 该菌株不能将环境中的无机氮转化成体内的有机氮供自身利用， 所 以在以铵离子为唯一氮源的无机盐培养基 M9 中是无法生长的。本发明通过测序分析， 筛选 出插入 pMD18-T 载体且读码框转录方向与载体的lac启动子转录方向一致的上述 5 个 GS 基因的重组克隆， 将这5个克隆的质粒连同空载pMD18-T作为负对照， 分别电激转化大肠杆 菌ET6017菌株， 从氨苄青霉素抗性平板上筛选出阳性转化子之后， 将转化子接种至M9培。
25、养 基 （培养基中预先添加氨苄青霉素和 IPTG 至终浓度分别为 100g/ml 和 1mM） ， 经过约 24h 的 37摇床培养， 期间分别在培养 0 分钟， 85 分钟， 180 分钟， 260 分钟， 320 分钟， 380 分钟， 440 分钟， 500 分钟， 640 分钟， 790 分钟， 1470 分钟时取转化子和空载的培养物， 用分光光度 计测定 600nm 波长下的吸光值 （OD600） 。该吸光值的大小直接反映了转化子细胞在 M9 培养 基中的生长情况。 从图2中可以看出， 5个转化子细胞在M9培养基中均可以较好的生长， 而 空载转化子细胞由于缺乏 GS 基因， 无法在 。
26、M9 培养基中生长。说明本发明所克隆的 5 个 GS 基因均可以在大肠杆菌细胞中表达其谷氨酰胺合成酶的催化功能， 验证了本发明方法用于 克隆 GS 基因的有效性。 说 明 书 CN 102787127 A 6 1/3 页 7 序列表 上海大学 快速克隆细菌谷氨酰胺合成酶基因的方法 12 1 20 DNA 人工引物 1 GCATC ACCCA AATTC AAGGG。 20 2 20 DNA 人工引物 1 ATGTC GAAGT CGGTT CAACT 20 3 20 DNA 人工序列 1 TCAGC AGCTG TAGTA MAGCT 20 4 20 DNA 人工引物 1 ACTGA TTCT。
27、G AAGGT GTTTA 20 5 20 DNA 人工引物 序 列 表 CN 102787127 A 7 2/3 页 8 1 ATGGC TAGGT ACACA AAAGA 20 6 31 DNA 人工引物 1 TTAGT AHAGA GACAT ATATT 20 7 20 DNA 人工引物 1 CGCAA AGTCC GWTAC CGTCA 20 8 20 DNA 人工引物 1 ATGGC GACCG CAAGC GAAAT 20 9 20 DNA 人工引物 1 TCAGG CCGAA TARTA CATGT 20 10 20 DNA 人工引物 1 CTCCG GRTTT GCTCA CCTTC 20 序 列 表 CN 102787127 A 8 3/3 页 9 11 20 DNA 人工引物 1 ATGAC AAAAT ATAAG CTCGA 20 12 20 DNA 人工引物 1 TYARG CKGCA GCGGA AGCCG 20。 序 列 表 CN 102787127 A 9 1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102787127 A 10 2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102787127 A 11 。