技术领域
本发明涉及一种布舍瑞林的合成方法，尤其涉及一种纯度高、高收率的合成 布舍瑞林的方法。
背景技术
布舍瑞林（Buserelin）是一种水溶性多肽类药物，为下丘脑分泌的天然促 性腺激素释放激素（GnRH/LHRH）类似物，可促进黄体生成激素LH、促卵胞 生成激素FSH和性激素分泌增加，药理效应为LHRH的20-170倍，长期给予 布舍瑞林可以抑制绒促性素的生成，并抑制卵巢和睾丸类固醇的生成。布舍瑞林 的主要临床应用包括姑息治疗激素依赖的前列腺癌（D期）、乳腺癌、无需手术 治疗的子宫内膜异位症等疾病的治疗。
布舍瑞林结构为Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBU)-Leu-Arg-Pro-NH-Et，现有 的合成布舍瑞林的方法主要有两种：
第一种是片段缩合法，即将布舍瑞林拆分成几个片段（如两个）分别合成， 所合成的各个裸肽片段在液相条件下进行偶联，如CN101735308A公开的4+5 片段合成方法，先合成五片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-OH和四片段D-Ser(tBU)- Leu-Arg-Pro-NHEt，然后缩合得到布舍瑞林。这种片段缩合方法的缺陷非常明 显，工艺操作繁琐；更重要的是，片段偶联过程中，多肽发生消旋反应的现象比 较严重；另外且最终收率较低。
第二种是全序列部分保护合成方法，即在固相合成过程中，对部分氨基酸侧 链进行保护，并最终在液相中实现乙氨基化，此工艺虽然实现在固相载体上的全 序列合成，但是由于采用的是部分保护，所以合成过程中引入的杂质较多，出产 品的质量很差，纯化过程中较难分离，很难得到高质量的产品，且综合收率不高。
CN101935339A公开了一种全保护合成布舍瑞林的方法，固相合成布舍瑞 林后，裂解去除树脂，然后将全保护肽经过乙氨基化、裂解脱除保护基的步骤得 到布舍瑞林，该方法无论是乙氨基化过程，在冰水浴条件下进行，不适于工业化 操作。WO2008/044890公开了一种合成布舍瑞林的方法，分别合成Pro-NH-Et 和Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBU)-Leu-Arg-OH，然后偶联、去除保护基获得布 舍瑞林；该方法先通过氨基酸偶联获得肽链，之后先脱除树脂，然后再偶联氨基 酸Pro-NH-Et，实际操作过程中，工艺变化非常繁琐。
发明内容
针对现有技术中合成布舍瑞林的方法产率低、纯度低、和操作繁琐的问题， 本发明提供了一种新的合成布舍瑞林的方法。
本发明提供了一种固相合成布舍瑞林的方法，步骤包括：
步骤1，提供如结构式（I）乙胺基载体树脂EtNH-SupportingResin；
步骤2，以所述乙胺基载体树脂为固相合成多肽树脂，偶联Fmoc-Pro-OH，脱除 保护基，得到NH2-Pro-EtN-SupportingResin；
步骤3，NH2-Pro-EtN-SupportingResin与Fmoc-Arg(PG1)-OH偶联得到 NH2-Arg(PG1)-Pro-NEt-SupportingResin；其中，PG1为Arg侧链保护基团；
步骤4，依次偶联布舍瑞林肽链中的其它氨基酸，得到Pyr-His(PG6)-Trp(PG5)- Ser(PG4)-Tyr(PG3)-D-Ser(tBU)-Leu(PG2)-Arg(PG1)-Pro-NEt-Supporting Resin；其中，PG1至PG6分别独立的为氨基酸侧链保护基团，或者不存在；
步骤5，酸性条件下进行裂解脱除载体树脂，得到全保护肽：
Pyr-His(PG6)-Trp(PG5)-Ser(PG4)-Tyr(PG3)-D-Ser(tBU)-Leu(PG2)-Arg(PG1)- Pro-NHEt；
步骤6，所述全保护肽通过氢化反应脱除PG1至PG6，得到布舍瑞林。
在本发明所述的方法中，所述载体树脂中的polymer可以是任意用于固相合 成多肽的树脂聚合物中的一种或几种，并优选为聚苯乙烯、苯乙烯-苯二乙烯交 联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇树脂等，并优选为聚苯乙烯（PS）。
在本发明所述的方法中，步骤1中所述合成的载体树脂EtNH-Supporting Resin中，乙胺基取代度优选为0.8-1.0mmol/g，即可以含有部分未取代乙胺基 的载体树脂。
其中，所述EtNH-SupportingResin的合成方法优选为：
乙氨钠CH3-CH2-NH-Na+与结构式（II）所示载体树脂（SupportingResin）反应 制备，其中X为卤素，如Cl、Br、I。
其中，所述载体树脂（II）最优选为CTC树脂。
其中，CH3-CH2-NH-Na+与载体树脂反应优选为无水条件下进行。
其中，CH3-CH2-NH-Na+与载体树脂反应的步骤更优选为：将氨基钠NH2Na 溶液加入到溶胀的载体树脂中，5-40℃反应2-12h，反应后的树脂洗涤后与碘乙 烷5-30℃反应2-12h。
反应式如下：
其中，X、Y分别独立选自卤素，如Cl、Br、I。
其中，NH2Na溶液所用溶剂与反应溶剂均可以独立地是四氢呋喃、甲苯、乙 醚、二氯甲烷、乙氰中的任意一种或几种的混合溶剂。
其中，CH3-CH2-NH-Na+与载体树脂反应的反应温度优选为5-35℃，更优选 为10-30℃，更优选为10-20℃，更优选为10-15℃。
其中，CH3-CH2-NH-Na+与载体树脂反应的反应时间更优选为4-10h，更优 选为6-8h，更优选为6-7h。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，优选为在缩合 剂存在下进行，所述缩合剂可以是任意能够用于促进羧酸与胺缩合的缩合剂，如 碳二亚胺类缩合剂、鎓盐类缩合剂、有机磷类缩合剂、以及其它缩合剂等中的任 意一种或几种的组合。其中：
碳二亚胺类缩合剂如二环己基碳二亚胺（DCC）、二异丙基碳二亚胺（DIC）、 1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDCI）等；
鎓盐类缩合剂如O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐 （HATU）、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐（HBTU）、O-(5- 氯苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓六氟磷酸盐HCTU、O-(7-氮杂苯并三氮唑 -1-基)-二(四氢吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐（HAPyU）、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(四氢 吡咯基)碳鎓六氟磷酸盐（HBPyU）、O-(苯并三氮唑-1-基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟 硼酸盐（TBTU）、O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐（TSTU）、 O-(N-endo-5-降崁烯-2,3-二碳二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐 （TNTU）、苯并三氮唑-1-基氧-三(二甲胺基)鏻鎓六氟磷酸盐（BOP）、苯并三氮 唑-1-基氧-三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐（PyBOP）、7-氮杂苯并三氮唑-1-基氧 -三(四氢吡咯基)鏻鎓六氟磷酸盐PyAOP等；
有机磷类缩合剂如二苯基磷酰氯（DPP-Cl）、氰代磷酸二乙酯（DECP）、叠 氮化磷酸二苯酯（DPPA）、硫代二甲基磷酰基叠氮（MPTA）、二(2-氧-3-唑烷基) 磷酰氯（BOP-Cl）等；
其它缩合剂如三苯基磷-多卤代甲烷、三苯基磷-六氯丙酮、三苯基磷-NBS （NBS：N-溴代丁二酰亚胺）等。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，还可以加入活 化剂，可用于碳二亚胺类缩合剂的活化剂包括4-N,N-二甲基吡啶（DMAP）、4- 吡咯烷基吡啶（4-PPY）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt）、1-羟基-7-偶氮苯并三氮 唑（HOAt）、（N-羟基琥珀酰亚胺）HOSu、N-羟基邻苯二甲酰亚胺（NHPI）、 N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺NHNI、五氟苯酚（PFPOH）中的任意一种 或几种的组合。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，还可以加入碱 性物质，可以是有机碱和/或无机碱，更优选为有机碱，所述无机碱如NaHCO3、 Na2CO3、NaOH、K2CO3、KOH、KH2PO4等，所述有机碱优选为有机胺类物质， 如三乙胺、N-甲基吗啉（NMM）、二异丙基乙胺（DIEA）等。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，可以是在溶剂 中进行，所述溶剂可以优选为二氯乙烷、乙醚、四氯化碳、甲苯等中的任意一种 或几种的混合物。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，反应温度优选 为10-50℃，更优选为15-40℃，更优选为20-35℃，更优选为25-30℃。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，反应时间优选 为≥5h，更优选为5-24h，更优选为5-18h，更优选为6-12h，更优选为8-10h。
本发明所述的方法中，步骤2中偶联Fmoc-Pro-OH反应中，优选为 Fmoc-Pro-OH与乙胺基载体树脂摩尔比可以是1∶1，或者Fmoc-Pro-OH过量， 并优选为(1-10)∶1，更优选为(2-8)∶1，更优选为(3-6)∶1，如4∶1、5∶1。
本发明所述的方法中，步骤2得到的NH2-Pro-EtN-SupportingResin中，Pro 取代度优选为0.6-0.9mmol/g。
本发明上述的方法中，步骤5所述酸性条件优选为在三氟乙酸存在条件下， 更优选为体积百分比为1-5%三氟乙酸溶液，其中，三氟乙酸溶液体积百分比浓 度更优选为1.5-4%（v/v），更优选为2-3%（v/v）。
其中所述三氟乙酸溶液的溶剂优选为二氯甲烷。
本发明所述的方法中，步骤6的氢化反应中，优选为在加氢催化剂存在下进 行，所述加氢催化剂可以是选自铂、钯、镍、钴、钌、铑、铱、锇催化剂中的任 意一种或几种的混合物。
优选地，所述催化剂为Pt/C催化剂，其中，所述催化剂中，Pt质量含量优 选为5-20%，如8%、10%、15%等。
本发明所述的方法中，步骤6的氢化反应优选为在溶剂中进行，所述溶剂可 以是任意能够溶解Pyr-His(PG6)-Trp(PG5)-Ser(PG4)-Tyr(PG3)-D-Ser(tBU)- Leu(PG2)-Arg(PG1)-Pro-NEt-CTCResin、而不使催化剂丧失催化活性的溶剂， 如甲醇、乙醇、丙醇等。
本发明上述的方法中，His(PG6)、Trp(PG5)、Ser(PG4)、Tyr(PG3)、 Leu(PG2)、Arg(PG1)分别优选为His(Trt)、Trp、Ser(Bzl)、Tyr(Bzl)、Leu、Arg(NO2)。
本发明第二个方面是提供一种用于固相合成布舍瑞林的载体树脂，所述载体 树脂结构如下：
其中，polymer可以是任意用于固相合成多肽的树脂聚合物，并优选为聚苯 乙烯、苯乙烯-苯二乙烯交联树脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇树脂等，并优选 为聚苯乙烯。
其中，所述合成的载体树脂EtNH-SupportingResin中，取代度优选为 0.8-1.0mmol/g。
应当理解的是，本发明上述方法中，在没有特别说明的情况下，各个优选实 施例均可以由本领域技术人员不受限制的进行任意组合，并且其组合也包含在本 发明内容中。
本发明所述的固相合成布舍瑞林的方法，所有的合成过程都集中在固相载体 上完成，采用全保护合成，最终通过氢化的手段去除不必要的侧链保护基，这一 工艺可以将因活性侧链参与偶联反应而引入的杂质降至最少，且省略了乙胺化的 过程，大大降低了操作的繁琐性，提供了产品收率，大大降低了产品的生产成本。
因此，本发明提供了一种高收率、低成本、反应条件温和、环境污染小、有 利于实现产业化的布舍瑞林固相合成方法。
附图说明
图1为本发明一种实施例中固相合成布舍瑞林方法的合成路线图；
图2为本发明所述方法制备的布舍瑞林的MS谱图。
具体实施方式
实施例1
参照图1，本实施例固相合成布舍瑞林的方法如下：
步骤1，乙胺基CTC树脂的制备，合成路线如下：
CTC（I-1）树脂在二氯甲烷（DCM，20mlDCM/gCTC树脂）中溶胀3h 以上，然后用质量浓度1%的TEA的DCM溶液洗涤。
氨基钠、DCM按照1∶3重量比缓缓加入到置有溶胀CTC树脂的容器中， 密封，干冷处理20min，室温下反应6-4h。DCM、甲醇和乙氰（ACN）洗涤。
加入碘乙烷的乙腈（10mlACN/gCTC树脂）溶液，反应7-8h。
甲醇、DMF洗涤，得到乙氨基CTC树脂（II-1），记为EtNH-CTCResin。 步骤2，偶联氨基酸Pro
1eqEtNH-CTCResin与4eqFmoc-Pro-OH，在3.5eqBOP和8eqNMM 存在下，25-30℃反应10小时，得到Fmoc-Pro-EtN-CTCResin。
20%哌啶溶液中，DMF存在下，脱除保护基Fmoc，反应温度为20-25℃， 反应时间为30min。得到NH2-Pro-EtN-CTCResin。
步骤3，偶联氨基酸Arg(NO2)
加入3eqFmoc-Arg(NO2)-OH，在3eqDIC+1.5eqNMM+3eqHOBT存在 下进行偶联反应，具体操作可以参考现有固相合成多肽的技术。
然后采用步骤2中同样的方法脱除保护基Fmoc，得到NH2-Arg(NO2)-Pro- EtN-CTCResin。
步骤4，偶联其它氨基酸
采用与步骤3相同的方法，根据布舍瑞林的肽链结构，依次加入 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH、Fmoc-Ser(Bzl)-OH、 Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH、Fmoc-Trp–OH，依次偶联 第三至第九个氨基酸（3-9AA）：Leu、D-Ser(tBu)、Tyr(Bzl)、Ser(Bzl)、Trp、 His(Trt)、和Pyr。
得到全保护的9肽树脂Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu- Arg(NO2)-Pro-NEt-CTCResin。
步骤5，去除CTC树脂
2%（v/v）三氟乙酸（TFA）的DCM溶液中，搅拌30min，过滤，去除树 脂，滤液用10%（v/v）NMM/DCM溶液中和，减压浓缩。
得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg(NO2)- Pro-NHEt。
步骤6，氢化脱除保护基
全保护肽溶于甲醇中，通入H2，压力保持为2.5MPa，以10%（v/v）Pt/C 为催化剂，反应24h，脱除D-Ser(Bzl)之外的其它各氨基酸的侧链保护基，过滤， 滤液浓缩至干，得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt粗产品 粉末。
将粗产品粉末溶于甲醇中，加入冷乙醚沉淀，离心分离，真空干馏，得到布 舍瑞林粗产品，纯度88%，然后通过反相高效液相色谱纯化，得到高纯度布舍 瑞林，纯度99.5%，总体收率为39%。
所得布舍瑞林MS谱图见图2，与布舍瑞林肽链结构相符。
实施例2
本实施例固相合成布舍瑞林的方法如下：
步骤1，制备乙氨基CTC树脂，记为EtNH-CTCResin。
步骤2，偶联氨基酸Pro
1eqEtNH-CTCResin与3eqFmoc-Pro-OH，在3eqBOP和9eqNMM存 在下，25-30℃反应15小时，得到Fmoc-Pro-EtN-CTCResin。
脱除保护基Fmoc，得到NH2-Pro-EtN-CTCResin。
步骤3，偶联氨基酸Arg(NO2)
加入3eqFmoc-Arg(NO2)-OH，在3eqDIC+1eqNMM+2eqHOBT存在下 进行偶联反应，具体操作可以参考现有固相合成多肽的技术。
然后脱除保护基Fmoc，得到NH2-Arg(NO2)-Pro-EtN-CTCResin。
步骤4，偶联其它氨基酸
依次偶联第三至第九个氨基酸（3-9AA）：Leu、D-Ser(tBu)、Tyr(Bzl)、 Ser(Bzl)、Trp、His(Trt)、和Pyr。
得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NEt- CTCResin。
步骤5，去除CTC树脂
DCM存在下，2%三氟乙酸（TFA）溶液中，裂解反应去除CTC树脂。
脱除CTC树脂后，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu- Arg(NO2)-Pro-NHEt。
步骤6，氢化脱除保护基
甲醇溶液中，通入H2，压力保持为3.0MPa，以10%Pt/C为催化剂，反应 24h，脱除D-Ser(Bzl)之外的其它各氨基酸的侧链保护基，真空干馏得到Pyr-His- Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt粗产品粉末。
将粗产品粉末溶于甲醇中，加入冷乙醚沉淀，离心分离，真空干馏，得到布 舍瑞林粗产品，纯度86%，然后通过反相高效液相色谱纯化，得到高纯度布舍 瑞林，纯度98%，总体收率为39%。
实施例3
本实施例固相合成布舍瑞林的方法如下：
步骤1，制备乙氨基CTC树脂，记为EtNH-CTCResin。
步骤2，偶联氨基酸Pro
1eqEtNH-CTCResin与5eqFmoc-Pro-OH，在4eqBOP和8eqNMM存 在下，25-30℃反应15小时，得到Fmoc-Pro-EtN-CTCResin。
脱除保护基Fmoc，得到NH2-Pro-EtN-CTCResin。
步骤3，偶联氨基酸Arg(NO2)
加入3eqFmoc-Arg(NO2)-OH，在3eqDIC+2eqNMM+2eqHOBT存在下进 行偶联反应，具体操作可以参考现有固相合成多肽的技术。
然后脱除保护基Fmoc，得到NH2-Arg(NO2)-Pro-EtN-CTCResin。
步骤4，偶联其它氨基酸
依次偶联第三至第九个氨基酸（3-9AA）：Leu、D-Ser(tBu)、Tyr(Bzl)、 Ser(Bzl)、Trp、His(Trt)、和Pyr。
得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NEt- CTCResin。
步骤5，去除CTC树脂
DCM存在下，2%(v/v)三氟乙酸（TFA）溶液中，裂解反应去除CTC树脂。
脱除CTC树脂后，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bzl)-Leu- Arg(NO2)-Pro-NHEt。
步骤6，氢化脱除保护基
乙醇溶液中，通入H2，压力保持为2.0MPa，以Pd/C为催化剂，脱除D-Ser(Bzl) 之外的其它各氨基酸的侧链保护基，真空干馏得到Pyr-His-Trp-Ser- Tyr-D-Ser(Bzl)-Leu-Arg-Pro-NHEt粗产品粉末。
将粗产品粉末溶于甲醇中，加入冷乙醚沉淀，离心分离，真空干馏，得到布 舍瑞林粗产品，纯度87%，然后通过反相高效液相色谱纯化，得到高纯度布舍 瑞林，纯度98.5%，总体收率为38.5%。
本发明所提供的固相合成布舍瑞林的方法，固相载体树脂上形成乙胺基，脱 除树脂后乙胺基保留在肽链上，因此，省去了现有技术中合成肽链后的乙胺基化 反应，或者脱除载体树脂后重新偶联含乙胺基氨基酸Pro-NHEt的步骤。因此， 本发明在简化产品合成工艺的操作方面，提供工艺稳定性方面，提供产品总体收 率，降低成本方面都有较大突破。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并 不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行 的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范 围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。