技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用。
背景技术
黄斑区视网膜后有异常的新生血管生长称为湿性老年性黄斑变性(AMD)；糖尿病性微血管病变中的特异性眼底病变，例如视网膜新生血管，称为糖尿病视网膜病变(DR)。2013年全球糖尿病视网膜病变(DR)患者9300万，其中增殖性DR(PDR)患者1700万，糖尿病性黄斑水肿患者2100万，威胁视力的DR患者2800万。糖尿病发病5年后糖尿病视网膜病变发生率为25％，10年后增至60％，15年后可高达75％～80％。如此可见，加快研制新型治疗眼底血管病变制剂，不仅具有社会效益，而且将会产生巨大的经济效益。
目前，对于AMD或DR缺乏理想的治疗措施，临床上主要采用对症治疗或辅助性治疗方法来控制或延缓疾病的发展，常用的治疗方法如下：降糖药物、抗炎药物、局部使用TNF-α拮抗剂、菲诺贝特、血管内皮生长因子(VEGF)拮抗剂、RAS系统抑制剂、非酶糖基化抑制剂、综合疗法和激光治疗。抗-VEGF治疗涉及到定期眼内注射抗-VEGF单抗(如Lucentis),不仅具有一定的伤害性，而且价格昂贵且只针对确诊病例，此外，尽管发生率很低，但每次注射均会带来眼内感染、视网膜出血和剥离的严重风险，而且这个治疗没有终点。
1995年IL-18作为IFNγ诱导因子被报道，随后证明给小鼠全身注射IL-18(50μg/kg)6天，对FGF诱导的角膜毛细血管生成具有抑制作用。也有报道表明IL-18对氧诱导的小鼠视网膜病变模型的视网膜病理性新生血管的生成具有调控作用。Doyle等最近报道，眼内或全身注射鼠源性的IL-18(SB-528775)可以防止实验诱导的CNV。因此IL-18的单独使用或为了降低抗新生血管药物眼内注射频率而与其合用都是可行的。此外该作者还证明鼠源性和人源性的重组IL-18对视网膜色素上皮细胞(RPE)都是非常安全的，RPE细胞是AMD中功能异常的关键细胞。Shen J.等证明房水中IL-18含量高的患者在接受Lucentis单抗治疗黄斑水肿及视网膜静脉栓塞时将显著改善视觉效果，他们同时证明VEGF以相互抑制的方式调控IL-18含量，并用多个视网膜/CNV模型证明重组IL-18能够调节病理模型的眼底渗出，他们提出IL-18可能成为调控眼睛病理性新生血管生成的新方法，这一结果与上述Doyle等报道一致。
2006年重组人IL-18(商品名：Iboktadekin)作为抗肿瘤制剂进入临床试验阶段，由GlaxoSmithKline公司研发。已有多篇文章报道了IL-18人体试验是安全的，而且未见有关眼部副作用的报道。此外，已经报道给啮齿类全身注射IL-18，在视网膜可检出较高含量的IL-18，这一结果提示IL-18在视网膜中的生物可用性。病人使用IL-18可能引起1～2级的短暂发热，但能快速缓解。用高达2000μg/kg剂量，病人的眼部也没出现明显副作用。综上所述重组IL-18在眼科学中的研究结果表明IL-18对眼部病理性新生血管性疾病可能具有应用价值。既然目前已证明IL-18临床试验试是安全的，那么IL-18就可用于CNV和湿性AMD的辅助治疗研究，它能否成为有效的药物，值得进一步深入研究。
目前，重组人IL-18的制备主要采用生物工程的方式，但由于IL-18序列的结构的特殊性，其在生物合成的过程中不易纯化，且合成后活性很低。因此，纯度低、复性率低和产量低等一些问题，导致了IL-18的制备成本增高，进而导致价格昂贵。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用。本发明提供的重组白细胞介素18具有较高的生物活性。
本发明提供了重组人白细胞介素18，其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基。
本发明实施例中，重组白细胞介素18的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供的重组白细胞介素18为重组人白细胞介素18，记为rhIL-18。其在野生型人IL-18的基础上，将第10位氨基酸有丝氨酸(Ser)突变为可羟基化的氨基酸残基。所述可羟基化的氨基酸残基包括Pro或Lys，翻译后蛋白质中的Pro发生羟基化，可提高蛋白质的溶解度，增加蛋白质的稳定性。本发明实施例中，将第10位氨基酸的丝氨酸(Ser)突变为脯胺酸(Pro)(如SEQ ID NO:1所示)。经实验表明，如SEQ ID NO:1所示的hrIL-18解决了野生型IL-18溶解度低、稳定性差、生物活性低等缺点，而且如SEQ ID NO:1所示的hrIL-18更易纯化，适合工业化生产，所制备的hrIL-18样品对新生血管的生成具有较强的抑制作用。
本发明还提供了编码本发明所述重组白细胞介素18的DNA分子。
由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的hrIL-18的核苷酸序列。
一些实施例中，编码本发明重组白细胞介素18的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明提供的编码hrIL-18的DNA分子可采用人工合成的方式获得，也可通过体外扩增的方法获得。本发明采用体外扩增的方式获得。作为优选，采用含有突变氨基酸对应密码子的引物对，以人体细胞mRNA为模板进行RT-PCR，从而获得编码hrIL-18的核苷酸序列。所述含有突变氨基酸对应密码子的引物对序列如SEQ ID NO:3～4所示。所述人体细胞为：外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、肝细胞、脾细胞、胸腺细胞、骨髓细胞和/或肾细胞。
本发明还提供了SEQ ID NO:3所示上游引物和SEQ ID NO:4所示下游引物组成的引物对。
本发明提供了一种表达载体，其包括骨架和编码本发明所述重组白细胞介素18的DNA分子。
一些实施例中，编码本发明重组白细胞介素18的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一些实施例中，骨架为pBV220质粒。
本发明所述表达载体的构建方法为，通过PCR在编码本发明所述重组白细胞介素18的DNA分子两端添加限制性酶切位点，然后对所获得片段进行酶切后，与经酶切的骨架进行连接。
一些实施例中，表达载体中，SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的插入位点为EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ。
本发明还提供了转染或转化本发明所述表达载体的宿主细胞。
一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌。
一些实施例中，宿主细胞为大肠杆菌DH5α。
本发明实施例中，宿主细胞由本发明提供的表达载体转化大肠杆菌获得。
本发明还提供了一种重组白细胞介素18的制备方法，其为发酵本发明所述的宿主细胞。
在发酵过程中诱导表达rhIL-18，诱导方式为温度诱导。
每升发酵的培养基中包括：
所述诱导表达启动时菌液浓度为OD600为2.0；调节诱导表达的温度为42℃，时间为4h，氨水调节pH值为7.0，启动表达。
以本发明提供的方法能够在短时间内迅速获得大量的rhIL-18，但其以包涵体形式存在。故而在发酵诱导表达后，还需经过复性和纯化。
作为优选，所述发酵后还包括复性和纯化的步骤。
所述纯化包括：
破碎发酵后的宿主细胞，收集沉淀；
以包涵体洗涤液洗涤沉淀后，加入包涵体溶解液，4℃搅拌4h以上，离心、收集上清液；
所述上清液与复性液混合，室温搅拌4h后，4℃复性20h以上，所得溶液上样至经平衡的羟基磷灰石层析柱，流速为10ml/min；
用平衡液充分流洗杂蛋白到基线后，含有0.1mol/L的NaCl的平衡液洗脱，收集洗脱液；
所述洗脱液经超滤浓缩后，上样至平衡好的Sephacryl S-200-HR凝胶层析柱，流速为2ml/min，紫外检测下，收集含有rhIL-18的蛋白峰，获得纯化后的rhIL-18。
实验表明，本发明提供的方法制备rhIL-18，rhIL-18(包涵体)质量为菌体总蛋白质量的25％，经复性、纯化后，rhIL-18的回收率可达5％，经鉴定收获rhIL-18的纯度在97％以上。
本发明提供的重组白细胞介素18在制备促进IFN-γ产生的制剂中的应用。
一些实施例中，rhIL-18促进人白血病细胞KG1中IFN-γ的产生。实验表明，将本发明提供的重组白细胞介素18添加入人白血病细胞KG1的培养液，结果显示，浓度为2.5ng/mL的rhIL-18能够刺激KG1细胞产生IFN-γ，表明rhIL-18能够促进IFN-γ的产生。
本发明提供的重组白细胞介素18在制备增强NK细胞活性的制剂中的应用。
一些实施例中，将rhIL-18添加入PBMCs细胞中，浓度分别为：0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/mL，结果显示，不同浓度的rhIL-18皆能够对NK细胞起到增强活性的作用，可将NK活性细胞增加到81.7％。其效果优于野生型IL-18。
本发明提供的重组白细胞介素18在制备抑制人内皮细胞微管产生的制剂中的应用。
一些实施例中，预先用不同浓度(0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml)的rhIL-18处理EA.hy926细胞48h，然后观察人内皮细胞微管形成，并对微管样结构进行计数。结果显示，不同浓度的IL-18皆能够抑制人内皮细胞微管的形成。其效果优于野生型IL-18。
本发明提供的重组白细胞介素18在制备治疗眼底新生血管性疾病和/或恶性肿瘤的药物中的应用。
用不同浓度rhIL-18(0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml和1000ng/ml)处理人视网膜色素上皮细胞，然后计算各组细胞的活性。结果显示，即便在1000ng/ml的高浓度下，rhIL-18对人视网膜色素上皮细胞的活性也未产生不利影响。基于本发明提供的rhIL-18能够抑制人内皮细胞微管的产生，且能够促进NK细胞的活性、促进IFN-γ的形成；而对于人视网膜色素上皮细胞的活性不会产生影响。说明该rhIL-18能够作为治疗眼底新生血管性疾病和/或恶性肿瘤的药物。
本发明中，眼底新生血管疾病为湿性老年性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和/或角膜血管增生。恶性肿瘤为白血病。
本发明还提供了一种药物其包括本发明提供的重组白细胞介素18。
本发明提供的药物中还包括药学上可接受的辅料，其剂型为冻干粉针剂、水针剂。
本发明提供了一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用，本发明提供的rhIL-18在其N端第10位由丝氨酸突变为可羟基化的氨基酸残基。以如SEQ ID NO:1所示的hrIL-18进行实验，其解决了野生型IL-18溶解度低、稳定性差、生物活性低等缺点，而且如SEQ ID NO:1所示的hrIL-18更易纯化，适合工业化生产。基于本发明提供的rhIL-18能够抑制人内皮细胞微管的产生，且能够促进NK细胞的活性、促进IFN-γ的形成；而对于人视网膜色素上皮细胞的活性不会产生影响。说明该rhIL-18能够作为治疗眼底新生血管性疾病和/或恶性肿瘤的药物。
附图说明
图1示pBV220-IL-18原核表达载体构建方案；
图2示表达载体的PCR，图中标示分别为：M：分子量标准，从大到小依次为10000、7000、4000、2000、1000、500、250bp；泳道1示载体pBV220对照，泳道2示表达载体pBV220-IL-18PCR结果；
图3示羟基磷灰石层析柱纯化后结果；图中标示分别为：M：分子量标准，从大到小依次为97.2kDa、66.7kDa、44.3kDa、29.8kDa；泳道1示0.1M NaCl洗脱峰；泳道2示0.2M NaCl洗脱峰；泳道3示0.5M NaCl洗脱峰；
图4示Sephacryl S-200-HR凝胶层析柱纯化结果，图中标示分别为：M：分子量标准，从大到小依次为97.2kDa、66.7kDa、44.3kDa、29.8kDa，20.0kDa,14.0kDa；泳道1-5示去除的杂蛋白，泳道6示纯化后样品，泳道8示纯化前样品；
图5示hrIL-18诱导KG1细胞产生INFγ；其中柱状图示IFNγ的含量，单位为pg/mL；折线图示hrIL-18的浓度，单位为ng/mL；
图6示hrIL-18诱导NK细胞增殖作用；其中，图6-a示未加hrIL-18诱导时NK细胞增殖的作用，图6-b示加本发明hrIL-18诱导NK细胞增殖作用；
图7示hrIL-18对RPE细胞的活性率的影响；
图8示hrIL-18对人内皮细胞微管形成的抑制；图8-a示未加hrIL-18时人内皮细胞微管形成，图8-b示本发明hrIL-18对人内皮细胞微管形成的抑制。
具体实施方式
本发明提供了一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明在野生型人IL-18的基础上，将第10位氨基酸有丝氨酸(Ser)突变为可羟基化的氨基酸残基获得rhIL-18。该rhIL-18的制备方法为采用基因工程的方法。
技术方案的具体步骤是：(1)获取目的基因：获取人体细胞，常规方法提取总RNA，以此RNA为模板，用上游引物1(TACTTTGGCAAGCTTGAATCTAAATTACCAGTC，SEQ ID NO:3)及下游引物(CGGGATCCCTAGTCTTCGTTTTG,SEQ ID NO:4)通过RT-PCR扩增获得本发明rhIL-18的cDNA。以上述cDNA为模板，用上游引物2(CGGAATTTCATGTACTTTGGCAAGCTT，SEQ ID NO:5)和下游引物(CGGGATCCCTAGTCTTCGTTTTG,SEQ ID NO:4)，通过PCR扩增cDNA片段，使其带有相应的核酸内切酶位点。(2)构建表达载体：用核酸内切酶酶切本发明rhIL-18的cDNA于相应的表达载体，用DNA连接酶连接目的基因与表达载体并转化或转染细胞，获得本发明rhIL-18的基因工程细胞株。(3)基因工程细胞株的发酵：取-70℃保存的工程菌株接种到含Amp的营养琼脂平板培养基上，37℃培养；挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养；将菌液按比例接种到含Amp的发酵培养基内，32℃摇床培养；将菌液按比例接种到发酵罐内，32℃条件下培养；待菌液浓度达到OD600约为2.0后，升温到42℃诱导培养4h，同时小量持续补加填料液1000ml，氨水自动调节pH7.0，离心收集菌体。(4)重组IL-18蛋白的纯化：基因工程细胞株菌体用TE缓冲液悬浮，冰浴条件下，高压匀浆破碎菌体，离心收集沉淀，即为包涵体；称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤后，加入包涵体溶解液，4℃条件下，磁力搅拌溶解12h以上；离心收集上清液；按照比例缓慢加入复性液，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性20h以上；通过用平衡液平衡的羟基磷灰石层析柱，收集rhIL-18蛋白峰；再将目的峰超滤浓缩后再上用平衡液平衡好的凝胶层析柱，收集rhIL-18蛋白峰，即为目的蛋白rhIL-18，蛋白回收率可达5％。将该纯化蛋白分装成水针制剂或冻干制剂。
本发明采用引物、试剂、试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中涉及的培养基或缓冲液配方范围及准备如下：
LB液体培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌。
胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
NaCl 10g
发酵培养基：以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌。
填料液:以1000ml为单位按下列比例配制，溶解后高压灭菌。
胰蛋白胨 100g
酵母提取物 50g
葡萄糖 100g(115℃，单独高压)
20mmol PB缓冲液(pH7.2)以1000ml为单位按下列比例配制：
磷酸二氢钠·2H2O 3.12g
磷酸氢二钠·12H2O 7.16g
EDTA 0.37g
包涵体洗涤液：即20mmol PB缓冲液
包涵体溶解液以1000ml为单位按下列比例配制：
8mol尿素 480g
10mM DTT 1.65g
用20mmol PB缓冲液(pH7.2)定容到1000mL
复性液以1000ml为单位按下列比例配制：
20mmol PB缓冲液(pH8.0) 1000ml
DTT(20mM) 3.1g
洗脱液1
20mmol PB缓冲液(pH7.2) 1000ml
0.1mol NaCl 5.8g
洗脱液2
20mmol PB缓冲液(pH7.2) 1000ml
0.2mol NaCl 11.6g
洗脱液3
20mmol PB缓冲液(pH7.2) 1000ml
0.5mol NaCl 29.0g
羟基磷灰石层析柱平衡液：即20mmol PB缓冲液
Sephacryl S-200-HR凝胶层析柱平衡液：即20mmol PB缓冲液
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1构建IL-18的原核表达载体pBV220-IL-18。
通过RT-PCR获得的含IL-18的基因(SEQ ID NO:2)用EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切，然后与用EcoRⅠ，BamHⅠ双酶切的载体pBV220连接；构建含IL-18基因的原核表达载体pBV220-IL-18，转化大肠杆菌DH5α，构建工程菌株DH5α-pBV220IL-18；(图1～2)。
实施例2hrIL-18的发酵及高效表达
工程菌的活化、发酵、诱导及包涵体的回收：取-70℃保存的工程菌株接种到含Amp的营养琼脂平板培养基上，37℃培养12h以上；挑取单个菌落接种到含Amp的LB液体培养基中，37℃摇床培养12h以上；将菌液按1:100比例接种到含Amp的发酵培养基内，32℃摇床培养12h以上；将菌液按1:10比例接种到发酵罐内，32℃条件下培养；待菌液浓度达到OD600约为2.0后，升温到42℃诱导培养4h，同时小量持续补加填料液，氨水自动调节pH7.0。培养结束后，离心收集菌体，菌体用TE缓冲液悬浮，冰浴条件下，高压匀浆破碎菌体，反复4次。离心破碎后的菌体，收集沉淀，即为包涵体。
实施例3hrIL-18的复性及纯化
3.1包涵体的洗涤、溶解和复性：称取适量包涵体，加入包涵体洗涤液洗涤2次后，按照2％的比例加入包涵体溶解液，4℃条件下，磁力搅拌溶解4h以上；4℃，9000rpm，离心10min，收集上清液；按照1:8的比例缓慢加入复性液，使蛋白浓度降到0.2％，室温磁力搅拌溶解4h；4℃复性20h以上；立即纯化。
3.2hrIL-18的纯化：用平衡液平衡羟基磷灰石层析柱，将上述稀释后的复性液全部上样，流速为10ml/min；用平衡液充分流洗杂蛋白到基线后，先后用含0.1、0.2、0.5和1.0M NaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰，经SDS蛋白电泳鉴定，目的蛋白存在于0.1NaCl洗脱峰中(图3)；将上述0.1M NaCl洗脱峰样品超滤浓缩后按床体积3％比例再上用平衡液平衡好的SephacrylS-200-HR凝胶层析柱，平衡液洗脱，流速为2ml/min；分步收集目的蛋白峰，-20℃保存待鉴定。
3.3纯化的尿激酶原鉴定采用SDS蛋白电泳法，IL-18表达量(包涵体)可达菌体总蛋白量的25％；包涵体纯化回收率可达5％；纯度在97％以上；采用紫外分光光度计测定蛋白含量，约为0.5mg/ml。
实施例4hrIL-18生物活性测定
4.1人白血病细胞KG1细胞传代培养：用含10％FCS的RPMI1640培养基，5％CO2，37℃培养U937细胞；当细胞密度达到2×106个细胞/ml时传代；传代细胞密度为4×105细胞/ml。
4.2将hrIL-18用不含血清的RPMI1640培养基配制成100ng/ml备用；取96孔细胞培养板，于前5列每孔加100ul 20％FCS 1640培养基配制的细胞密度为2×106细胞/ml，A、B、C、D排加ConA(刀豆蛋白A)，终浓度为0.5mg/L；E、F、G、H孔不加ConA。于第1-5列每孔内分别加入100ul 2倍稀释的hrIL-18,混匀,第1列终浓度为40ng/ml；(每个稀释度4孔)。混均后，将细胞培养板置37℃,5％CO2孵箱培养24h；
4.3收集培养上清，用ELISA法测IFN-γ含量(图5)；
表1不同浓度hrIL-18对细胞IFN-γ效价的影响
结果表明，rhIL-18能够促进细胞的IFN-γ的表达。
实施例5rhIL-B增强NK细胞活性性实验
采用直接荧光流式细胞仪法测定NK细胞活性性实验：
PBMCs的制备：取适量抗凝全血加等量的生理盐水混匀，等量加入含淋巴细胞分离液的50ml离心管(或10ml)，离心2000rpm(水平转子)，10min,取淋巴细胞层，用生理盐水洗涤2次，1500rpm,10min，调节细胞浓度为1×106/ml；将上述细胞悬液加入IL-2或IL-12(100u/ml)，加入25ml培养瓶，共8瓶；用1640-10％FCS稀释IL-18(市售野生型IL-18和本发明rhIL-18)浓度分别为：0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml。加入上述含PBMCs的PBMCs细胞中，每个滴度加1瓶。37℃5％CO2孵箱培养24h,收集细胞培养；用培养基洗后调整细胞浓度为2×106/ml。分别用荧光标记的抗CD56、CD69单抗标记；37℃孵育2h。用流式细胞仪测定CD56、CD69细胞的百分率。计算各组CD56、CD69细胞的百分率，可使NK活性细胞增加到81.7％(图6)；
表2NK活性细胞百分数
结果表明，本发明提供的rhIL-18能够更有效的促进NK细胞活性。
实施例6 rhIL-B对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)的影响(MTT法)
ARPE-19细胞：购买ARPE-19细胞(American Type Culture CollectionCRL2302,LGC Promochem)，DMEM培养基-10％FCS，37℃5％CO2孵箱培养，传代培养；将上述细胞制成细胞浓度为1×105/ml悬液，加入96孔培养板；用1640-10％FCS稀释IL-18(市售野生型IL-18和本发明rhIL-18)浓度分别为：0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml和1000ng/ml。以0.1％SDS作毒性对照，加入上述含细胞中，每个滴度加4孔。37℃5％CO2孵箱培养24h,用MTT法测定各组细胞的活力，计算各IL-18组细胞存活百分率，绘制比活性曲线。细胞存活百分率＝(实验组A值-本底)/(对照组A值-本底)×100％。计算各组ARPE-19细胞活性，结果显示IL-18对RPE细胞的活性率没有影响(图7)。
实施例7rhIL-18对人内皮细胞微管形成的抑制试验
预先用不同浓度(0.1ng/ml,1ng/ml,10ng/ml,100ng/ml)的IL-18处理EA.hy926细胞48h。将Matrigel人工基质胶与4℃预冷的无血清1640培养基按1：1比例混合，平铺于24孔板的孔底，每孔300μL，放于5％CO2、37℃恒温培养箱内30min使胶固化。取IL-18处理过的EA.hy926细胞，用无血清1640培养基调整浓度至1.2×105/mL后接种于上述铺好胶的24孔板，每孔1ml，常规培养16 h，每隔4 h观察微管样结构形成情况，光学显微镜下(100×)随机取5个视野拍照。采用Microvision Saisam软件分析图像，对每孔5个视野的微管样结构进行计数图8。
表3微管样结构数量
结果表明，本发明提供的rhIL-18能够抑制微管样结构的产生。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 何伟
<120> 一种重组白细胞介素18及其制备方法与应用
<130> MP1621783
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Pro Val Ile Arg Asn Leu Asn
1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30
Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
35 40 45
Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50 55 60
Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
100 105 110
Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Leu Pro Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130 135 140
Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp
145 150 155
<210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tactttggca agcttgaatc taaattacca gtcataagaa atttgaatga ccaagttctc 60
ttcattgacc aaggaaatcg gcctctattt gaagatatga ctgattctga ttgtagagat 120
aatgcacccc ggaccatatt tattataagt atgtataaag atagccagcc tagaggtatg 180
gctgtaacta tctctgtgaa gtgtgagaaa atttcaactc tctcctgtga gaacaaaatt 240
atttccttta aggaaatgaa tcctcctgat aacatcaagg atacaaaaag tgacatcata 300
ttctttcaga gaagtgtccc aggacatgat aataagatgc aatttcaatc ttcatcatac 360
gaaggatact ttctagcttg tgaaaaagag agagaccttt ttaaactcat tttgaaaaaa 420
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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