技术领域
本发明涉及利用核酸扩增及其检测体系，在临床检查中检测和/或鉴定分枝杆菌菌种的方 法和试剂盒，属于医学分子生物学诊断技术领域。
背景技术
结核病仍然是严重的公共卫生问题，尤其是在发展中国家。据WHO统计世界人口的1 /3有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第 一大杀手。我国是全世界22个结核病高负担国家之一，活动性肺结核病人数居世界第二位。 目前我国全年龄组结核菌感染率为44.5％，全国约5.5亿人受到结核菌感染。同时，非结核分 枝杆菌(NTM)病也呈逐年上升趋势，2000年，卫生部组织的调查数据显示，NTM菌株分 离率上升至11.1％，NTM病临床表现与结核病相似，在无菌种鉴定结果的情况下，经常被误 诊为结核病。大量研究及临床治疗病例表明非结核分枝杆菌对大多数一线抗结核药物具有天 然耐药性，采用目前标准的化疗方案治疗无效。目前，非结核分枝杆菌病通常依据传统的分 枝杆菌菌种鉴定来确诊，然而，传统的分枝杆菌菌种鉴定繁琐、费时，需1～2个月的时间， 不能满足临床开展早期有效治疗的需要，使非结核分枝杆菌病人通常被作为结核病人按常规 治疗，病人经长期常规治疗而疗效不佳，疗程延长，成为难治、复治病人，细菌在局部播散。 因此，分枝杆菌菌种的快速鉴定对结核病和非结核分枝杆菌病的早期诊断、鉴别诊断、有效 治疗和控制传播都有重要意义。
传统诊断临床标本的分枝杆菌感染是基于镜下抗酸染色，进而特殊培养及生化实验鉴定 菌种，最后检测药物敏感性。抗酸染色只能鉴别属与属外的特征，且只有在标本带菌量在104/ml以上时才能看见。由于多数分枝杆菌生长缓慢，鉴别到种的水平需要耗时4～8周，且影 响因素多，重复性差。近年来，一直在开发于基因水平鉴定分枝杆菌菌种的技术，主要是利 用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等核酸扩增技术的诊断技术。
目前利用PCR鉴定分枝杆菌菌种的方法主要是通过PCR扩增目标片段后，通过膜杂交 或基因芯片检测，但这些方法普遍存在一些问题，不适合在临床上开展。(1)PCR菌种鉴定 法。用各种分枝杆菌特异性引物对标本DNA进行一系列PCR扩增或多重PCR扩增，根据扩 增产物所产生的特异性片段进行鉴定；或先用分枝杆菌属特异的外部引物扩增，然后再用菌 种特异的内部引物进行巢氏扩增鉴定。该法灵敏、快速，但目前能够鉴定的菌种尚不多，主 要有结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌 和麻风分枝杆菌，而且鉴定未知的感染菌，需采用一系列种特异性引物进行扩增。(2)PCR- 直接测序鉴定法。用分枝杆菌属特异的引物对标本的16SrRNA或16S-23S rRNA间隔区序列 或65kD或32kD抗原基因进行PCR扩增，然后直接测定扩增产物的核苷酸序列，比较其核 苷酸的差异来鉴定菌种。但该方法无法鉴别少数分枝杆菌，而且技术要求高，需昂贵的特殊 仪器，而难以推广。(3)PCR-DNA探针鉴定法：用分枝杆菌属特异的引物对标本中分枝杆菌 16S或16S-23S rDNA进行扩增，然后与各种分枝杆菌特异的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交 或微孔板反向杂交鉴定菌种。该法较灵敏、快速，但目前只能鉴定部分菌种。(4)PCR-限制 性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定法。PCR-RFLP菌种鉴定法是以分枝杆菌属特异性引物对 标本中分枝杆菌65KD蛋白编码基因、16S或16-23S rDNA进行扩增，然后用不同的限制性 内切酶消化扩增片段，通过电泳分析酶切图谱来鉴定菌种。目前只能鉴定部分菌种，重复性 还不够理想。(5)PCR-基因芯片鉴定法。基因芯片技术是指将大量核酸分子以预先设计的方 式固定在载体上，检测带标记的待测样品DNA，是一种大规模分析遗传差异的新方法。但这 种方法操作复杂，易造成交叉污染，所需的点样系统和荧光分析系统昂贵，而难以推广应用。
近年来出现的实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到 定量的飞跃，它以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优 点成为了分子生物学研究中的重要工具。本发明利用荧光定量PCR技术平台结合双标记探针 熔解曲线技术进行分枝杆菌菌种鉴定，实现了快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌 种鉴定的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简单、灵敏、高效、廉价的分枝杆菌菌种鉴定的方法， 以及利用所述方法同时鉴定多种分枝杆菌菌种的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：本发明所述方法的基本原理为：基于 荧光定量PCR技术平台，结合多重不对称PCR技术和熔解曲线技术，并运用多个荧光检测 通道在一个PCR反应中检测多种不同荧光标记的探针与扩增产物所形成的熔解峰，利用熔解 峰所示的Tm值来鉴定分枝杆菌菌种。
一方面，本发明提供了一种用于鉴别临床常用分枝杆菌的鉴别试剂I，其中包括两对引物 和三条探针，所述两对引物包括引物TBleft1、TBleft2、TBright1和TBright2，其核苷酸序列 分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，所述三条探针 TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记，其 核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所示。
在本发明中，所述的“临床常见分枝杆菌”是指临床上常见的分枝杆菌，包括但不限于结 核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、 猿猴分枝杆菌(M.simiae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、海分枝杆菌(M.marmum)、溃疡分 枝杆菌(M.ulcerans)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、爱知分枝杆菌(M.aichiense)、 鸟分枝杆菌(M.avium)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、次要分枝杆菌(M.triviale)、 偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、 戈登分枝杆菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、龟分枝杆菌龟亚种(M.chelonae subsp.chelonae)、龟分枝杆菌脓肿亚种(M.chelonae subsp.abscessus)、耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、田野分枝杆菌(M.agri)、母牛分枝杆 菌(M.vaccae)、草分枝杆菌(M.phlei)。
在本发明的一个具体实施方案中，所述三条探针TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3的5’ 端分别用报告荧光染料FAM、HEX、ROX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQ1或BHQ2 标记。
另一方面，本发明提供了一种用于鉴别临床常用分枝杆菌的鉴别试剂II，其中包括四对引 物和三条探针，所述四对引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、 TBright5、TBright6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示，所述三条探 针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记， 其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示。
在本发明的一个具体实施方案中，所述三条探针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’ 端分别用报告荧光染料FAM、ROX、HEX标记，3’端分别用淬灭荧光染料BHQ1或BHQ2 标记。
用本发明所述鉴定试剂I进行多重不对称荧光定量PCR。实验证明，根据荧光颜色和熔 解曲线中Tm值的不同，本发明所述的鉴定试剂I能够鉴别分枝杆菌属中的结核分枝杆菌、 胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌、爱知分枝杆菌、田野分枝 杆菌、草分枝杆菌、母牛分枝杆菌、耻垢/抗热分枝杆菌。
在本发明中，表述菌种鉴定结果时使用的“/”表示“或”的意思，例如“耻垢/抗热分枝杆菌” 意指菌株可鉴定为耻垢分枝杆菌或抗热分枝杆菌，排除二者之外的其他分枝杆菌，可视需要 进一步鉴定获知所述菌株确切是耻垢分枝杆菌还是抗热分枝杆菌。
在使用本发明所述鉴定试剂I鉴定后，进一步用本发明所述的鉴定试剂II进行多重不对 称荧光定量PCR。根据荧光颜色和熔解曲线中Tm值的不同，本发明所述的鉴定试剂II能够 将分枝杆菌属中海分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、堪萨斯/胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿猴分枝 杆菌、鸟分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、次要分枝杆菌、偶然分枝杆菌、土地分枝杆菌、龟分枝 杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种区分开来。
因此，本发明提供了一种用于鉴定临床常见分枝杆菌的试剂盒，该试剂盒包括所述鉴别 试剂I，即包括两对引物和三条探针，所述两对引物包括引物TBleft1、TBleft2、TBright1和 TBright2，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4 所示，所述三条探针TBProbe1、TBProbe2、TBProbe3的5’端用报告荧光染料标记，3’端用 淬灭荧光染料标记，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15所 示。
所述试剂盒还可以进一步包括所述鉴定试剂II，即鉴别试剂II，其中包括四对引物和三 条探针，所述四对引物包括引物TBleft3、TBleft4、TBright3、TBright4、TBleft5、TBleft6、 TBright5、TBright6，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示，所述三条探 针TBProbe4、TBProbe5、TBProbe6的5’端用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记， 其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18所示。
本发明所述试剂盒，还可以进一步包括核酸序列扩增所需的其它各种试剂，包括但不限 于DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等，其中DNA聚合酶优选为热稳定的且不具有5’核酸 酶活性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整，其可以是但不限于是aTaq 酶。
另一方面，本发明还提供了一种鉴定临床常见分枝杆菌的方法，该方法包括：
(1)样本处理及DNA提取；
(2)配制PCR反应体系；
(3)在荧光定量PCR仪上PCR扩增靶序列；
(4)PCR扩增结束后，进行熔解曲线(Melting curve)分析。
本发明中，步骤(1)中所述的样本包括但不限于痰液、病理组织切片或细菌培养物。
在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为痰液，所述样本处理及DNA提取包括： 取痰液2ml，加入2.5倍体积4％NaOH，37℃温育30min。将液化后的痰液，离心，去上清， 向沉淀中加入裂解液100μl，沸水中煮10min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液进行检 测或-20℃储存备用。
在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为病变组织切片，所述样本处理及DNA提 取包括：取病变组织切片2-5片加入1.5ml离心管中，向管中滴加300μl提取液，100℃煮沸 10min，4℃下12000rpm离心10min，取上清液进行检测或-20℃储存备用。
在本发明的一个实施方案中，其中所述样本为细菌培养物，所述样本处理及DNA提取 包括：取经培养后临床样本分离株，高温灭活，用溶菌酶和蛋白酶K处理后，再用苯酚/氯仿 提取DNA。将获得的基因组DNA直接用于菌种鉴定检测或-20℃储存备用。
本发明中，步骤(2)配制的PCR反应体系优选使用一种热稳定的且不具有5’核酸酶活 性的DNA聚合酶，以便探针在反应全过程中能够保持完整。另外，所加各引物对的上游引 物和下游引物浓度不同。扩增探针互补链的引物的浓度高于与之配对的另一条引物浓度。一 对PCR引物浓度的比例为不超过2∶1，或者不超过3∶1，或者不超过4∶1，或者不超过5∶1，最 佳的PCR引物浓度比例取决于具体的实验。
在本发明的一个具体优选实施方案中，所配制的PCR反应体系为：
通常，首先使用本发明所述的鉴定试剂I代替上述反应体系中的引物和探针。另外可能 视情况需要在使用鉴定试剂I后，用本发明所述鉴定试剂II代替上述反应体系中的引物和探 针配制PCR反应体系。
本发明中，步骤(3)中PCR扩增所采用的程序为：95℃预变性1min；40～50个循环95℃ 变性6sec，58℃退火30sec，72℃延伸10sec，58℃退火15sec，72℃延伸5sec；95℃变性30sec； 40℃保温20sec；40～85℃做熔解曲线分析，每步升温1℃，保温5～30sec，选择FAM、HEX、 ROX通道检测荧光。
PCR反应开始后，在最初的10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制 性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的 单链DNA。在溶液中，双标记寡核苷酸探针未与靶序列杂交时通常呈“线团”状的单链构象， 此时由于报告基团和猝灭基团距离很近，猝灭基团能够猝灭报告基团所发出的荧光。当探针 与单链PCR产物退火形成双链时，由于报告基团的荧光不能够被猝灭，从而产生可以检测到 的荧光信号，可以实时监测PCR反应。
在本发明中，“报告基团”和“报告荧光染料”具有相同涵义，可交互使用，包括但不限于 FAM、ROX、HEX、JOE等。
“猝灭基团”和“淬灭荧光染料”具有相同涵义，可交互使用，包括但不限于BHQ1、BHQ2、 Eclipse、TAMRA等。
本发明中，步骤(4)中所述熔解曲线(Melting curve)分析是指，由于不同菌种的序列 间存在区别，探针与不同菌种的序列杂交产生不同Tm值的熔解峰，用实际获得的Tm值与 表1中Tm值比对，从而鉴定分枝杆菌菌种。表1中probe1、probe2和probe3是试剂I检测 后各分枝杆菌菌种在3个检测通道中的Tm值；probe4、probe5和probe6是试剂II检测后各 分枝杆菌菌种在3个检测通道中的Tm值。在实际应用中首先使用试剂I检测，将获得的Tm 值与表中probe1、probe2和probe3对应的Tm值比对，若为唯一分枝杆菌菌种，则完成鉴定， 否则需用试剂II进一步检测，并与probe4、probe5和probe6的Tm值比对，从而完成鉴定。
表1
本发明中，采用实施例部分中表5所列标准作为质控标准。
另一方面，本发明还提供了本发明所述鉴定试剂和鉴定试剂盒在制备用于鉴定分枝杆菌 的各类产品或试剂的用途。
附图说明
图1为探针TBProbe1在FAM检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图2为探针TBProbe2在HEX检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图3为探针TBProbe3在ROX检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图4为探针TBProbe4在FAM检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图5为探针TBProbe5在ROX检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图6为探针TBProbe6在HEX检测通道中所产生的熔解曲线分析图。
图7为结核分枝杆菌、阴性对照、空白对照在反应1FAM通道的熔解曲线分析图。
图8为结核分枝杆菌、阴性对照、空白对照在反应1HEX通道的熔解曲线分析图。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而绝不对本发明的保护范围构成任何限制。本发明所述试剂盒的制备和组成以及 所述分枝杆菌病鉴定方法在下列实施例中作进一步描述，特别是尽管实施例中制备的试剂盒 只是根据16S rRNA基因设计的引物和探针，但并不能理解为本发明就局限于16S rRNA基因 的检测。凡是利用本发明中的思路和方法对分枝杆菌进行检测和/或菌种鉴定的方法和试剂 盒，均属于本发明保护范围。
除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理 解相同的含义。本申请中引用的任一专利、专利申请和出版物在此引入作为参考。下列实施 例中未注明具体条件的实验方法，通常采用常规条件，或按照制造厂商所建议的方法。
实施例
实施例1：引物和探针的设计与合成
16S rRNA基因是细菌分类鉴定的传统的靶基因序列。本发明对已公开的分枝杆菌属各菌 种的16S rRNA基因序列进行分析，找到分枝杆菌属特异性核苷酸序列和种特异性可变区。 根据分枝杆菌16S rRNA基因序列的三个多变区，设计三组分枝杆菌属特异性巢式引物及分 枝杆菌种特异性探针，其中多变区1位于NCBI数据库中序列X55588.1的第55-251位碱基之间， 多变区2位于第1110-1314位碱基之间，多变区3位于第366-539位碱基之间。使用软件在分枝杆 菌属特异性区域设计引物对，在引物对扩增区域内针对种特异性可变区设计探针，探针5’端 用报告荧光染料标记，3’端用淬灭荧光染料标记。引物和探针均委托专业公司进行合成，其 中引物通过PAGE电泳纯化，探针通过HPLC纯化。引物和探针序列及荧光染料标记如下表 2所示：
表2
其中，第一组引物针对分枝杆菌16S rRNA基因多变区1设计，其中TBleft1和TBright2 分别为上游和下游外围引物，TBleft2和TBright1分别为内部上游和下游引物，探针TBProbe1、 TBProbe2和TBProbe3位于两条内部引物之间的多变区；第二组引物针对分枝杆菌16S rRNA 基因多变区2设计，其中TBleft3和TBright4分别为上游和下游外围引物，TBleft4和TBright3 分别为内部上游和下游引物，探针TBProbe4和TBProbe6位于两条内部引物之间的多变区； 第三组引物针对分枝杆菌16S rRNA基因多变区3设计，其中TBleft5和TBright6分别为上游 和下游外围引物，TBleft6和TBright5分别为内部上游和下游引物，探针TBProbe5位于两条 内部引物之间的多变区。
实施例2分枝杆菌菌种鉴定方法及标准曲线的建立
2.1样本DNA的提取
标准菌株：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分 枝杆菌(M.scrofulaceum)、猿猴分枝杆菌(M.simiae)、胃分枝杆菌(M.gastri)、海分枝 杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、不产色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、 爱知分枝杆菌(M.aichiense)、鸟分枝杆菌(M.avium)、迪氏分枝杆菌(M.diernhoferi)、 次要分枝杆菌(M.triviale)、偶然分枝杆菌(M.fortuitum)、土地分枝杆菌(M.terrae)、 胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、 龟分枝杆菌龟亚种(M.chelonae subsp.chelonae)、龟分枝杆菌脓肿亚种(M.chelonae subsp. abscessus)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、抗热分枝杆菌(M.thermoresistibile)、田野分 枝杆菌(M.agri)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、草分枝杆菌(M.phlei)标准菌株均购自中 国生物制品鉴定所。
分别提取上述每一标准菌株的基因组DNA用于菌种鉴定检测，或-20℃储存待用。
2.2PCR扩增
2.2.1PCR反应体系配制
配制PCR反应体系
其中所述的模板DNA为选自2.1中所提取基因组DNA中的一种或大肠杆菌基因组DNA (阴性对照)，同时设置用等体积ddH2O替代模板DNA的反应体系作为空白对照。
2.2.2PCR扩增
将2.2.1中的PCR反应体系混匀后，置于荧光定量PCR仪上，按下列程序进行PCR扩增
2.2.3结果判读
当荧光定量PCR仪运行结束后，使用其配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线分析， 熔解曲线见图1至图3，从图1至图3可知，所有阳性对照品均出现了明显的熔解峰，Tm均 大于10；阴性对照和空白对照无明显熔解峰出现，峰值均小于5(图中未能显示)。本实验中 各阳性样品的相应的Tm值见表3。
表3用含探针TBProbe1、TBProbe2和TBProbe3的鉴定试剂I检测时各菌种对应Tm值
从图1至图3结合表3可知，在本发明实验中，分枝杆菌属的Tm与阴性对照的Tm值 有明显差别，分枝杆菌属中各菌种之间的Tm值也有明显差别。本发明的鉴定试剂I能够明 确将分枝杆菌属与其它菌属区分开来。其中根据结核分枝杆菌序列设计的探针TBProbe1，与 结核分枝杆菌扩增产物杂交的熔解温度(Tm值)最高，而与其它分枝杆菌扩增产物杂交的 Tm值呈现不同程度的降低，能够鉴别结核分枝杆菌、鸟/偶然/迪氏/次要/土地分枝杆菌组、 胞内分枝杆菌、堪萨斯/胃/瘰疬/猿猴分枝杆菌群、海/溃疡分枝杆菌组、戈登/蟾蜍分枝杆菌组、 不产色/爱知分枝杆菌组。根据龟分枝杆菌龟亚种序列设计的探针TBProbe2，与龟分枝杆菌龟 亚种/龟分枝杆菌脓肿亚种扩增产物杂交的Tm值最高，而与其它分枝杆菌扩增产物杂交的Tm 值呈现不同程度的降低，综合探针TBProbe1的结果能够鉴别龟分枝杆菌龟/脓肿亚种、鸟/迪 氏/次要分枝杆菌组、偶然/土地分枝杆菌组、戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌、 爱知分枝杆菌；根据耻垢分枝杆菌序列设计的探针TBProbe3，与耻垢分枝杆菌扩增产物杂交 的Tm值最高，而与其它分枝杆菌扩增产物杂交的Tm值呈现不同程度的降低，能够鉴别耻 垢/抗热分枝杆菌、田野分枝杆菌、草分枝杆菌、母牛分枝杆菌。
因此，用本发明的鉴定试剂I能够鉴定出分枝杆菌属中的结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、 戈登分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌、爱知分枝杆菌、田野分枝杆菌、草分枝杆 菌、母牛分枝杆菌。但是，未能将鸟/迪氏/次要分枝杆菌、偶然/土地分枝杆菌、堪萨斯/胃/ 瘰疬/猿分枝杆菌、龟分枝杆菌龟/脓肿亚种、耻垢/抗热分枝杆菌、海/溃疡分枝杆菌这些复合 群中的菌种区分开来。
因此，本发明用不同的引物和探针进行新一轮的PCR扩增。
2.3第二轮PCR扩增
2.3.1第二轮PCR反应体系配制
配制PCR反应体系
其中所述的模板DNA为选自2.1中所提取基因组DNA中的一种或大肠杆菌基因组 DNA(阴性对照)，同时设置用等体积ddH2O替代模板DNA的反应体系作为空白对照。
2.3.2PCR扩增
将2.3.1中的PCR反应体系混匀后，置于荧光定量PCR仪上，按下列程序进行PCR扩增
2.3.3结果判读
当荧光定量PCR仪运行结束后，使用其配套软件对本次试验的结果进行熔解曲线分析， 熔解曲线见图4至图6，从图4至图6可知，所有阳性对照品均出现了明显的熔解峰，Tm均 大于10；阴性对照和空白对照无明显熔解峰出现，峰值均小于5(图中未能显示)。本实验中 各阳性样品的相应的Tm值见表4。
表4进一步用含探针TBProbe4、TBProbe5和TBProbe6的鉴定试剂II检测时各菌种对 应Tm值
从图4至图6结合表4可知，在本发明实验中，分枝杆菌属中各菌种间的Tm值有明显 差别。TBProbe4能够将鉴定试剂I未能区分的海/溃疡分枝杆菌进一步鉴别为海分枝杆菌、溃 疡分枝杆菌；探针TBProbe5能够将鉴定试剂I未能区分开的堪萨斯/胃/瘰疬/猿猴分枝杆菌进 一步鉴别为堪萨斯/胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿猴分枝杆菌，将鸟/迪氏/次要分枝杆菌进 一步鉴别为鸟分枝杆菌、迪氏分枝杆菌、次要分枝杆菌，将偶然/土地分枝杆菌进一步鉴别为 偶然分枝杆菌、土地分枝杆菌；探针TBProbe6能够将鉴定试剂I未能区分的龟分枝杆菌龟/ 脓肿亚种进一步鉴别龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝杆菌脓肿亚种。
由于本发明实验证实：分枝杆菌属中各菌种的Tm均大于10，而作为阴性对照的菌种的 无明显熔解峰出现，峰值均小于5，因此，本发明采用下列表5中的标准作为质量控制标准。
表5质控品标准检测结果(以Bio-rad IQ5为例)
质控品 标准检测结果 阴性对照 溶解曲线分析中无明显峰出现，峰值通常小于5。 阳性对照 熔解曲线分析中出现明显峰，峰值通常大于10。
实施例3临床鉴定试验
3.1鉴定试验I
收集分枝杆菌属临床分离株187株，按上述方法提取DNA后用ddH2O溶解。
在各检测管内加入10×PCR缓冲液(Mg2+Free)2μl，25mM MgCL2 1.6μl，10mM dNTPs 0.4μl，10μM TBleft1、TBleft2和TBright1各0.1μl，10μM TBright2 0.6μl，10μM TBProbe1、 TBProbe2和TBProbe3各0.4μl，5U/μl aTaq DNA聚合酶0.1μl，加入2μl上述提取的待检DNA， 然后用ddH2O补充反应体系至20μl。反应同时设置阴性对照和空白对照，以从其他14株非分枝 杆菌属菌株(包括鲍曼不动杆菌，嗜麦芽窄食单胞菌，阴沟肠杆菌，克雷白杆菌，金黄色葡 萄球菌，铜绿假单胞菌，人葡萄球菌人亚种，弗劳地枸橼酸盐杆菌，洛菲不动杆菌，大肠杆 菌，粪肠球菌，产气肠杆菌，产酸克雷伯氏菌和肺炎链球菌)提取的DNA2μl作为阴性对照 反应的模板，空白对照反应中用同样体积的ddH2O代替DNA。
将样品管放入荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性1min；95℃6s，58℃ 30s，72℃10s，58℃15s，72℃5s，40个循环；95℃30s；40℃20s，40～85℃，每步升高1℃， 停留30s，收集FAM、HEX、ROX荧光信号的荧光检测通道。反应结束后仪器自动给出Tm值。 分析Tm值发现，分枝杆菌属扩增曲线的Tm值大于10，阴性对照和空白对照Tm值小于5，表 明实验成立。结核分枝杆菌、阴性对照和空白对照熔解曲线见图7和图8。
鉴定结果为：在187株待检菌株中，有结核分枝杆菌11株，胞内分枝杆菌60株，戈登分枝 杆菌5株，偶然/土地分枝杆菌12株，鸟/迪氏分枝杆菌9株，海/溃疡分枝杆菌2株，龟/脓肿分枝 杆菌61株，堪萨斯/瘰疬/胃/猿猴分枝杆菌27株。
3.2鉴定试验II
将3.1鉴定结果中的偶然/土地分枝杆菌12株，鸟/迪氏分枝杆菌9株，海/溃疡分枝杆菌2株， 龟/脓肿分枝杆菌61株，堪萨斯/瘰疬/胃/猿猴分枝杆菌27株，用本发明的鉴定试剂II进行第二 步鉴定试验。
同样方法提取上述菌株DNA作为扩增模板，在各检测管内加入10×PCR缓冲液(Mg2+Free)2μl，25mM MgCL2 1.6μl，10mM dNTPs 0.4μl，10μM TBleft3、TBleft4、TBleft5、TBleft6、 TBright4和TBright6各0.2μl，10μM TBright3和TBright5各0.8μl，10μM TBProbe4、TBProbe5和 TBProbe6各0.4μl，5U/μl aTaq DNA聚合酶0.1μl，加入2μl上述提取的待检DNA，然后用ddH2O 补充反应体系至20μl。反应同时设置2μl ddH2O作为空白对照。
将样品管放入荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应：95℃预变性1min；95℃6s，58℃ 30s，72℃10s，58℃15s，72℃5s，40个循环；95℃30s；40℃20s，40～85℃，每步升高1℃， 停留30s，收集FAM、HEX、ROX荧光信号的荧光检测通道。反应结束后仪器自动给出Tm值。
分析Tm值发现，分枝杆菌属扩增曲线的Tm值大于10，试剂空白对照Tm值小于5，表明 实验成立；偶然/土地分枝杆菌12株中，有偶然分枝杆菌11株，土地分枝杆菌1株；鸟/迪氏分 枝杆菌9株均为鸟分枝杆菌；海/溃疡分枝杆菌2株均为海分枝杆菌2株；龟/脓肿分枝杆菌61株 中，有龟分枝杆菌龟亚种1株，龟分枝杆菌脓肿亚种60株；堪萨斯/瘰疬/胃/猿猴分枝杆菌27株 中，有堪萨斯/胃分枝杆菌11株、瘰疬分枝杆菌15株和猿猴分枝杆菌1株。
取上述鉴定为结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、偶然分枝杆菌、鸟分枝杆 菌、堪萨斯/胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种各5株，土地分枝杆菌1株，海 分枝杆菌2株，龟分枝杆菌龟亚种1株，猿猴分枝杆菌1株进行DNA测序，DNA测序菌种鉴定 结果与本发明荧光定量PCR菌种鉴定结果一致。
实验证明本发明提供的鉴定试剂能够方便准确地鉴定出临床常见分枝杆菌。其中使用本 发明提供的鉴定试剂I能够鉴定出分枝杆菌属中的结核分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆 菌、蟾蜍分枝杆菌、不产色分枝杆菌、爱知分枝杆菌、田野分枝杆菌、草分枝杆菌、母牛分 枝杆菌。在鉴定试剂I检测的基础上，再使用本发明提供的鉴定试剂II能够将分枝杆菌属中海 分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、堪萨斯/胃分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、猿猴分枝杆菌、鸟分枝杆菌、 迪氏分枝杆菌、次要分枝杆菌、偶然分枝杆菌、土地分枝杆菌、龟分枝杆菌龟亚种、龟分枝 杆菌脓肿亚种区分开来。
序列表
<110> 中国人民解放军第三O九医院
无锡锐奇基因生物科技有限公司
<120> 一种新的分枝杆菌菌种快速鉴定方法及试剂盒
<130>
<160> 18
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(26)
<400> 1
gagtggcgaa cgggtgagta acacgt 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(24)
<400> 2
gataagcctg ggaaactggg tcta 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(20)
<400> 3
cggctacccg tcgtcgcctt 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(22)
<400> 4
tcaccccacc aacaagctga ta 22
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
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<400> 5
ctgccggggt caactcggag gaa 23
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(28)
<400> 6
cgtcaagtca tcatgcccct tatgtcca 28
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(26)
<400> 7
gttgcagacc ccgatccgaa ctgaga 26
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(28)
<400> 8
gctgatctgc gattactagc gactccga 28
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(24)
<400> 9
ggggatgacg gccttcgggt tgta 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(26)
<400> 10
gggaggcagc agtggggaat attgca 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(23)
<400> 11
accgcggctg ctggcacgta gtt 23
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 引物
<222> (1)..(27)
<400> 12
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 13
tgtcttgtgg tggaaagcgc ttttgcggtg 30
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 探针
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<400> 14
taccggatag gaccgcacac ttcatg 26
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 探针
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<400> 15
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<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 探针
<222> (1)..(20)
<400> 16
atggccggtg caaagggctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 探针
<222> (1)..(30)
<400> 17
tcggagtgac ggtaggtgga gaagaagcac 30
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 探针
<222> (1)..(21)
<400> 18
ctgcgaagcc gcaaggtgga g 21