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1、(10)授权公告号 CN 102649950 B (45)授权公告日 2013.05.22 CN 102649950 B *CN102649950B* (21)申请号 201210108972.3 (22)申请日 2012.04.16 C12N 9/16(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/21(2006.01) A23K 1/165(2006.01) C12R 1/19(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (73)专利权人 盐城工学院 地址 224051 江苏省盐城市希望大道 9 号 (72)发明。
2、人 许伟 邵荣 路国伟 余晓红 (54) 发明名称 一种突变的中性植酸酶及其基因和用途 (57) 摘要 本发明涉及通过基因工程技术改造得到的一 种突变的中性植酸酶及其基因和用途， 该突变的 中性植酸酶氨基酸序列为 SEQ ID NO.2， 是以野 生型淀粉液化芽孢杆菌 DSM 1061 phyC 基因为基 础， 利用 PCR 技术对其基因进行点突变获得的。 本发明公开了改造的中性植酸酶及其相应的 DNA 序列， 还公开了所述中性植酸酶的生产方法。本 发明所述的突变中性植酸酶与野生酶相比， 在 pH 6.07.5下活性高出25-35。 该中性植酸酶可 作为一种饲料添加剂， 能有效提高动物对饲料中。
3、 植酸磷的利用率。本发明所提供的突变中性植酸 酶基因可用于构建表达该酶的重组菌。 (51)Int.Cl. 审查员 王志坤 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表3页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102649950 B CN 102649950 B *CN102649950B* 1/1 页 2 1. 一种突变的中性植酸酶， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2 所示的第 27-383 位。 2. 编码权利要求 1 所示的突变中性植酸酶的核苷酸序列。 3. 根据权利要求 。
4、2 所述的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO.1 所示的第 79-1152 位。 4. 含有权利要求 2 所述的核苷酸序列的表达载体。 5. 用权利要求 4 所述表达载体转化的大肠杆菌。 6. 权利要求 1 所述的突变中性植酸酶在饲料生产中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102649950 B 2 1/4 页 3 一种突变的中性植酸酶及其基因和用途 技术领域 0001 本发明属于酶的基因工程和酶生化工程领域。 本发明涉及活性提高的突变中性植 酸酶， 本发明还涉及编码该突变中性植酸酶的基因及用途。 背景技术 0002 磷是动物必需的一种常量矿物元素， 磷的添加对配合饲料生产成本及产品质 量。
5、有重要影响。植酸酶 (phytase) 即肌醇六磷酸酶 (myo-inositol hexaphosphate phosphohydrotase) 是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸 ( 或者磷酸盐 ) 这类酶的 总称。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率， 减少饲料中无机磷的添加量以 及动物粪便中无机磷的排出， 减轻环境的磷污染， 提高畜牧生产和生态效益。 0003 目前从微生物中获得植酸酶的报道有以下三种 ： (1) 来源于大肠杆菌的双功能酶 (appA)， 它具有植酸酶和磷酸酶的功能， 但只在酸性条件下表现出强的植酸酶活性 ； (2) 来 源于黑曲霉的酸性植酸酶 (phyA)。
6、 具有较高的活性， 其酶促反应的 pH 有效范围在 4.5-6.0 之间， 适用于胃呈酸性的单胃动物及少数鱼类 ； (3) 来源于芽孢杆菌的中性植酸酶 (phyC)， 最适酶促反应pH在7.0-7.5之间适用于消化道为中性的鲤科鱼类， 可有效弥补酸性植酸酶 的不足。 0004 国内外科研人员对中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构 建方面。姚斌等从枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 中克隆了中性植酸酶基因， 并在大 肠杆菌中进行了表达， 表达产物具有生物学功能但比活较原始酶下降了 30 ( 姚斌， 袁铁 铮， 王元火， 等 . 来源于 Bacillus subtil。
7、is 的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌的表 达 . 生物工程学报， 2001， 17(1) ： 11-15)。陈艳等 ( 陈艳， 孙健义， 赵学新， 等 .Bacillus amyloliquegaciens 中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质 . 食品与生物技术学 报， 2005， 24(2) ： 60-65.) 将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达， 结果发现基因工程菌的植酸酶活性仅为出发菌株的 1.27 倍， 表达重组酶活性偏低。近年 来， Rao 等 (Rao DE， Rao KV， Reddy VD.Cloning and expression of Bac。
8、illus phytase gene(phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusion bodies.Journal of Applied Microbiology.2008， 105(3) ： 1128-1137.) 在大肠杆菌中对 芽孢杆菌中性植酸酶进行了高效表达， 结果表明其最适 pH 为 7.0， 最适温度 55， 最大活 性 16U/mg。Tung 等 (Tung ET， Ma HW， Cheng C， et al.Stabilization of beta-propeller phyta。
9、se by introducing Xaa-Pro and Gly-Ala substitutions at consensus positions.Protein Pept.Lett.， 2008， 15， 297-299.) 运 用 定 点 突 变 方 法 对 Bacillus licheniformis 植酸酶的热稳定性进行了改善， 取得了较好的效果。定点突变结果表明， 突 变酶 G117A/G266A 与野生酶具有类似的米氏常数 Km， 催化效率 kcat和最适的 Ca2+浓度， 但是 热稳定性有大幅上升。 0005 定点突变是蛋白质工程广泛采用的技术， 它是根据酶的结构、 功能和作用。
10、机理等 信息， 在基因水平进行核苷酸突变， 以达到改造酶分子中特定氨基酸残基的目的， 使酶的性 说 明 书 CN 102649950 B 3 2/4 页 4 质最佳化。利用生物信息工具进行蛋白质分子设计， 并结合定点突变技术提高淀粉液化芽 孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中性植酸酶的活性， 尚未见有关文献报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种突变的中性植酸酶， 该突变的中性植酸酶与野生酶相 比， 在 pH6.0 7.5 下活性增加 25-35。 0007 本发明的另一个目的是提供编码上述突变中性植酸酶的基因 ( 核苷酸序列 )， 该 突变。
11、的中性植酸酶基因可用于构建重组菌。 0008 本发明的再一个目的是提供上述突变中性植酸酶的生产方法。 0009 上述突变中性植酸酶核苷酸序列与野生酶核苷酸序列 (GenBank 登录号为 HM747163) 相比， 第 148 位的编码天冬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。 0010 本发明的目的可以通过以下措施达到 ： 0011 编码权利要求1所述的突变中性植酸酶的核苷酸序列(即对应野生型中性植酸酶 氨基酸序列第 148 位的天冬氨酸密码子突变为表达谷氨酸的密码子 )， 如 SEQ ID NO.1 所 述。 0012 一种突变的中性植酸酶， 其氨基酸序列为 SEQ ID NO.2 所示。。
12、该序列表示原中性 植酸酶氨基酸序列 ( 即野生型淀粉液化芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 phyC 基因所表达的氨基酸序列 ) 的 148 位的天冬氨酸残基被谷氨酸残基所取代。 0013 含有上述核苷酸序列的表达载体。如质粒等。 0014 用上述表达载体转化的大肠杆菌。 0015 用 IPTG 诱导大肠杆菌表达目的蛋白， 表达产物利用 Ni-NTA 琼脂糖凝胶进行亲和 纯化。 0016 所述的突变中性植酸酶在饲料生产中的应用。 0017 本发明的有益效果 ： 0018 本发明所提供的中性植酸酶与野生酶相比， 活性显著提高。本发明还提供了该突 变中。
13、性植酸酶的基因序列， 这些序列可用于构建表达高活性中性植酸酶的重组菌。本发明 还提供了所述的突变中性植酸酶的生产方法。 本发明涉及的中性植酸酶可以作为一种饲料 添加剂， 能有效提高动物对饲料中磷元素的利用率。 附图说明 0019 图 1 表达重组质粒构建图。 0020 图 2 突变酶表达及纯化结果 SDS-PAGE 分析。 0021 图 3 不同温度下野生酶及突变酶活性比较。 0022 图 4 不同 pH 下野生酶及突变酶活性比较。 具体实施方式 0023 以下通过实施例对本发明做进一步的阐述， 但不限制本发明。 0024 实施例 1 ： 淀粉液化芽孢杆菌 Bacillus amyloliqu。
14、efaciens DSM 1061 phyC 基因 的获得及第 148 位氨基酸残基的突变 说 明 书 CN 102649950 B 4 3/4 页 5 0025 淀粉液化芽孢杆菌 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 从德国 DSMZ 购得。 0026 培养基的制备 ： 蛋白胨 10g/L， 酵母粉 5g/L， NaCl 10g/L， 121， 高压蒸汽灭菌 15min。 0027 菌体的收集 ： 将Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061接种到上述培养基中， 置 37摇床， 180rmin-1培养过夜， 8000rmin-1，。
15、 4， 离心 15min， 收集菌体。 0028 目 的 基 因 的 提 取 ： 采 用 改 良 的 的 酚 - 氯 仿 抽 提 法 获 取 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061的基因组， 以该基因组为模版， 使用如下PCR引物(由生工生 物工程 ( 上海 ) 公司合成 ) ： 0029 phyC-F ： 5 -GCGGATCC ATGAATCATTCAAAAACAC-3 (SEQ ID NO.3) 0030 phyC-R ： 5 -GTC AAGCTT TTATTTTCCGCTTCTGTC-3 (SEQ ID NO.4) 0031 运用 Bio basic 。
16、INC 公司的 PCR 试剂盒进行 PCR 反应扩增目的基因。PCR 循环参 数 ： 94， 3min ； 94， 1min ； 56， 1min ； 72， 1min ； 共进行 36 个循环。 0032 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 phyC 基因的也可以通过基因的全序列 合成获得， 如委托生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司按照 Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 phyC 基因序列 (GenBank 登录号为 HM747163) 进行合成， 合成的基因同样可用于重组 质粒的构建。 0033 采用生工生物工程 。
17、( 上海 ) 有限公司的胶回收试剂盒将目的基因片段进行纯化。 将纯化的基因或者全合成的基因与 pET22b(+)( 美国 Novagen 公司 ) 进行常规的连接反应， 将连接转化大肠杆菌DH5进行质粒扩增。 运用质粒提取试剂盒(Bio basic INC公司)， 提 取质粒。 运用上述的PCR引物进行扩增鉴定确定插入的phyC基因， 得到阳性重组pET-phyC 质粒。 0034 根据Stratagene公司的Quik-Change多重定点突变试剂盒的要求， 设计如下引物 5 -ACAGATCCAGAACATCCGATTGCA-3 ， 以 pET-phyC 质粒为模板进行 PCR， 将 As。
18、p148 突变为 Glu148， 用限制性内切酶消化原始质粒模板， 将 PCR 产物转化高效率的感受细胞， 培养后提 取质粒进行测序， 即可得到含有突变基因 (SEQ ID NO.1) 的质粒 pET-phyC-D148E。 0035 实施例 2 ： 表达重组质粒的构建、 筛选和鉴定 0036 为构建植酸酶基因的高效表达质粒， 设计引物删除了该酶N端的26位氨基酸残基 构成的信号肽部分。引物设计采用 Primer Premier 5.0 软件， 在引物中分别引入限制性内 切酶 BamHI 和 HindIII( 加粗下划线部分 )， 由生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司合成。引物 如下 ： 0。
19、037 phyC-F ： 5 -GCGAAGCATAAGCTGTCAGA-3 (SEQ ID NO.5) 0038 phyC-R ： 5 -GTCTTTTCCGCTTCTGTC-3 (SEQ ID NO.6) 0039 以获得的 phyC 全长基因为模板 PCR 的反应参数为 ： 94， 1min ； 56， 1min ； 72， 1min ； 共进行 36 个循环。扩增产物采用 0.8的琼脂糖凝胶电泳检测。 0040 将 PCR 产物和 pET22b(+) 载体分别用 BamH I 和 Hind III 消化并连接， 构建质粒 pET22b-phyC-D148E。连接液转化 E.coli D。
20、H5 细胞， 对阳性克隆进行 PCR 鉴定， 提取质粒 并送生工生物工程 ( 上海 ) 有限公司进行测序。 0041 实施例 3 ： 中性植酸酶的诱导表达 0042 将经鉴定后的 pET22b-phyC-D148E 重组质粒转化到表达宿主 E.coli BL21(DE3) 说 明 书 CN 102649950 B 5 4/4 页 6 中， 同时将空载体 pET22b(+) 转入相同宿主作为对照。各取 100L 转化液分别涂布于含 Amp(100g/mL)的LB平板， 置于37培养箱中培养至长成大小合适的菌落。 挑取含有重组 质粒和空质粒的转化子分别接种至含100g/mL Amp的LB液体培养液。
21、， 置摇床37， 180r/ min 振荡培养过夜。按 1接种量 (V/V) 转接至新鲜 LB 培养液中， 37， 180r/min 振荡培养 至对数生长期 (OD600 0.6-0.8) 分别加入诱导剂 IPTG 至终浓度 1.0mmol/L， 置 20摇床， 180r/min 诱导表达 6h。 0043 实施例 4 ： 中性植酸酶的纯化 0044 取适量按实施例3方法进行诱导表达的重组菌培养液， 8000r/min离心15min收集 菌体， 用无菌水洗涤两次后， 菌体重悬于 0.5mL(pH 7.5， 50mmol/L)Tris-HCl 缓冲液中， 冰 浴中超声破碎细胞。将超声破碎后的样品。
22、 12000r/min， 4离心 10min 取上清即为粗酶液。 0045 由于设计的pET22b-phyC-D148E表达质粒的表达产物中性植酸酶上带有6个连续 的组氨酸， 可以通过金属离子层析柱 (Ni-NTA 琼脂糖凝胶 ) 亲和纯化。超声波破碎诱导后 的菌体于 12000r/min 离心， 去除细胞碎片。上清液采用康为世纪 Ni-Agarose 6x His 标签 蛋白纯化试剂盒在 4下进行纯化。将粗酶液负载上柱， 流速为 1mL/min ； 采用 15 倍柱体积 平衡液 (pH7.0， 20mmol/L Tris-HCl， 10mmol/L 咪唑， 0.5mol/L NaCl) 进行。
23、洗脱的除去杂蛋 白， 流速为 1mL/min ； 然后用 8 倍柱体积洗脱液 (pH7.0， 20mmol/L Tris-HCl， 500mmol/L 咪 唑， 0.5mol/NaCl) 收集目的蛋白， 流速为 1mL/min ； 最后将目的蛋白置透析袋中除盐， 浓缩 保存。 0046 实施例 5 ： 中性植酸酶酶学性质测定 0047 中性植酸酶活性测定方法参考GB/T 18634-2009。 取适量酶液， 底物植酸钠浓度为 5.0mmol/L， 反应体系中 CaCl2 浓度为 1mmol/L， 缓冲体系为 0.25mol/L Tris-HCl(pH7.0)， 反应总体积为 6mL。将上述混合。
24、物置 37反应 30min， 加入 4mL 显色及终止液 ( 体积比 211的43的硝酸溶液， 100g/L钼酸铵， 2.35g/L偏钒酸铵溶液)， 置分光光度计波长 为 415nm 处测定无机磷含量。 0048 酶活性单位(U)定义为 ： 在一定条件下， 每分钟释放出1umol无机磷所需的酶量为 一个酶活性单位。 0049 (1) 中性植酸酶最适温度的测定 ： 将反应混合物分别置于 20、 30、 40、 50、 55、 60、 65、 70和 80下水浴反应 30min， 加入 4mL 显色及终止液终止反应， 检测酶 活。温度对野生植酸酶和突变植酸酶活性影响结果如图 3 所示。温度升高植酸。
25、酶的活性随 之增强， 到 60时酶活性最高， 说明该中性植酸酶最适反应温度为 60。相同温度下， 突变 酶的活性要比野生酶活性高出约 25。 0050 (2) 中性植酸酶最适 pH 的测定 ： 配制不同 pH 的含有底物植酸钠的溶液 (pH3.0 为 甘氨酸 -HCL 缓冲液， pH4.0-pH6.5 分别为 HAc-NaAc 缓冲液， pH7.0-pH9.0 为 Tris-HCl 缓 冲液 ； pH10.0 为甘氨酸 -NaOH 缓冲液 )。将反应混合物置于 60水浴反应 30min， 加入 4mL 显色及终止液终止反应， 检测酶活。pH 对野生植酸酶和突变植酸酶活力影响结果如图 4 所 示。
26、。结果表明酶最适 pH 为 7.0， 在此条件下， 突变植酸酶比活为 21U/mg。在 pH6.0 7.5 这一较宽的范围内， 酶活性均在最大活性的 70以上， pH 在 6.0 7.5 下， 突变酶的活性要 比野生酶活性高 25-35。 说 明 书 CN 102649950 B 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102649950 B 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 102649950 B 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 102649950 B 9 1/3 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102649950 B 10 2/3 页 11 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102649950 B 11 3/3 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102649950 B 12 。