一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因PsIR1的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102533852 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533852 A *CN102533852A* (21)申请号 201210043456.7 (22)申请日 2012.02.24 C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗 1 号 (72)发明人 窦道龙 刘廷利 茹艳艳 刘莉 刘沛菡 (74)专利代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 (54) 发明名称 一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因 PsIR1 。

2、的应用 (57) 摘要 本发明属于生物技术领域， 公开了一个能诱 导植物抗病性的大豆疫霉基因 PsIR1 的应用。一 种大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植 物中的应用。本发明将大豆疫霉基因 PsIR1 插 入 PVX 表达载体， 并通过农杆菌介导的瞬时表达 在烟草上对 PsIR1 的功能进行了分析。结果发现 PsIR1 可显著提高烟草对疫霉的抗性， 并且 PsIR1 可诱导水杨酸通路防卫反应基因 PR1 和 PR2 的高 表达。因此， 可认为 PsIR1 可引起了水杨酸的积 累， 而水杨酸的增加可提高植物的广谱抗。

3、性， 可见 PsIR1 可增强烟草的抗病性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 3 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种大豆疫霉 PsIR1 基因 GenBank ： HQ231784.1 在构建具有抗植物病原菌的广谱抗 性的转基因植物中的应用。 2. 根据权利要求 1 所述的应用， 其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基 因 GenBank ： HQ231784.1 的烟草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。 3.。

4、 含有大豆疫霉 PsIR1 基因 GenBank ： HQ231784.1 的重组表达载体在构建具有抗植物 病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。 4. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基 因 GenBank ： HQ231784.1 的烟草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。 5. 根据权利要求 3 所述的应用， 其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为 PVX 载 体。 6. 一种大豆疫霉 PsIR1 基因 GenBank ： HQ231784.1 在构建具有烟草疫霉抗性的转基因 植物中的应用。 7. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在。

5、于所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基 因 GenBank ： HQ231784.1 的烟草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。 8. 含有大豆疫霉 PsIR1 基因 GenBank ： HQ231784.1 的重组表达载体在构建具有烟草疫 霉抗性的转基因植物中的应用。 9. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基 因 GenBank ： HQ231784.1 的烟草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特征在于所述的重组表达载体的出发载体为PVX载 体。 权 利 要 求 书 CN 102533852 A 2 。

6、1/4 页 3 一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因 PsIR1 的应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 公开了一个能诱导植物抗病性的大豆疫霉基因 PsIR1 的应用。 背景技术 0002 随着世界人口的急剧增长， 可耕地面积的减少， 世界粮食问题变得日趋严重， 在有 限的土地资源上耕作出更多的粮食， 是解决人类生存的头等大事。育种学家们不仅要提高 作物的产量， 还要减少作物的损失， 其中植物病害一直是阻碍优良品种增产的最大瓶颈， 因 此， 培育高产抗病的作物品质是近年来育种学家们追求的方向。 常规的育种方法费时费力， 而随着生物学的发展， 利用基因工程的方法来培育的品种， 不仅能。

7、缩短育种时间， 而且可以 让多个优良的性状集中到一个品种上， 是目前育种领域的应用热点。植物抗病基因工程是 指采用遗传转化技术， 将外缘的基因导入受体植株， 从而获得抗病的转基因植物的方法。 一 般用于导入受体植物的外缘基因包括植物的抗病基因(即R基因)， 病原菌无毒基因和抗病 基因共转形成的 “双组分系统” ， 植物的防卫反应基因以及一些生物的抗菌蛋白基因。通过 将这些基因构建到合适的载体上， 构成适于转化的重组质粒， 用不同的转化方法向具有优 良品质的受体植物中导入重组质粒， 利用合适的抗性筛选并鉴定出转基因植株， 通过抗病 性鉴定， 从而获得高抗优质的品种。生物体内基因众多， 例如人类基。

8、因组预测有 3 万个基因 以上， 大豆疫霉接近 2 万个基因， 大多数基因的功能未知， 而生物的生长、 发育、 遗传、 变异 乃至生理平衡， 无不与基因的表达和调控密切相关， 因此， 克隆并研究基因的功能对于基因 工程来说是研究基础。 0003 本专利所涉及到的基因是一类由病原菌分泌， 在侵染过程中可进入植物细胞并引 起植物生理生化活性改变的蛋白。已经在细菌中发现大量的这种效应蛋白， 而近年来随着 基因组的测序， 卵菌中也发现大量的效应蛋白， 除了大家广为熟悉的 RXLR 效应蛋白外， 还 有一类具有保守 FLAK 序列元件的 CRN 效应蛋白。迄今为止， 将 CRN 蛋白导入受体植物并能 提。

9、高植物抗性未见报道。 发明内容 0004 为了克服常规育种费时费力、 不能具有持久广谱抗性的缺点， 本发明提供一个大 豆疫霉效应因子PsIR1做为育种的候选材料， 该蛋白可以诱导植物PR1基因的高度表达， 引 起烟草的抗病性。该基因将为植物抗病基因工程提供具有应用潜力的功能基因， 进一步可 为生产上提供一种具有持久抗病潜力的育种材料。 0005 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 0006 一种大豆疫霉 PsIR1 基因在构建具有抗植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中 的应用， 该大豆疫霉 PsIR1 基因序列为 GenBank ： HQ231784.1。 0007 其中， 所述的转基因植物。

10、为转大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的烟 草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。 说 明 书 CN 102533852 A 3 2/4 页 4 0008 含有大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的重组表达载体在构建具有抗 植物病原菌的广谱抗性的转基因植物中的应用。 0009 其中， 所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的烟 草， 大豆， 水稻， 小麦或玉米。所述的重组表达载体的出发载体为 PVX 载体。 0010 一种大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank。

11、 ： HQ231784.1) 在构建具有烟草疫霉抗性的转 基因植物中的应用。 0011 所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的烟草， 大 豆， 水稻， 小麦或玉米。 0012 含有大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的重组表达载体在构建具有烟 草疫霉抗性的转基因植物中的应用。 0013 所述的转基因植物为转大豆疫霉 PsIR1 基因 (GenBank ： HQ231784.1) 的烟草， 大 豆， 水稻， 小麦或玉米。所述的重组表达载体的出发载体为 PVX 载体。 0014 有益效果 0015 本发。

12、明与现有的育种材料相比， 其优点和积极效果表现在 ： 0016 1. 可大大的增强植物抗性。卵菌是具有巨大破坏力的病原菌， 自然条件下抗 源材料较少。烟草疫霉侵染速度非常快， 在发明中， 提前在烟草上表达 PsIR1(GenBank ： HQ231784.1) 后接种烟草疫霉， 可让烟草疫霉的侵染速度减缓 25以上。 0017 2.PsIR1(GenBank ： HQ231784.1) 能够诱导 PR1 和 PR2 基因高表达， 可为生产上提 供具有持久抗性的育种材料。 PR1和PR2基因是水杨酸通路的基因， 而水杨酸的增加可提高 植物的广谱抗性， 因此， 虽然 PsIR1 是大豆疫霉的基因，。

13、 但是在植物上瞬时表达后， 能引起 PR1 基因的高表达， 这表明 PsIR1 可诱导水杨酸的积累， 因而可增强烟草的抗病性。 附图说明 0018 图 1PsIR1 可抑制烟草疫霉的侵染 0019 A. 叶片左边及右边均表达 GFP 后接种烟草疫霉菌的病斑酒精脱色后表型 B. 叶片 左边表达 GFP， 右边表达 PsIR1 后接种烟草疫霉菌的病斑酒精脱色后表型 C. 图 A 和图 B 中 叶片右边与左边病斑直径比值。* 代表在 1的水平上差异显著。 0020 图 2PsIR1 可引起水杨酸通路防卫反应基因 PR1 和 PR2 的高表达 0021 A.PsIR1 和 GFP 分别在烟草上表达 5。

14、 天后， 检测 SA 通路 PR1 基因相对于 0 天的表 达量， 设定 0d 的表达量为 10， 比值取 log10 ； 0022 B.PsIR1 和 GFP 分别在烟草上表达 5 天后， 检测 SA 通路 PR2 基因相对于 0 天的表 达量， 设定 0d 的表达量为 10， 比值取 log10 具体实施方式 0023 实施例 1PsIR1 可抑制烟草疫霉的侵染 0024 1. 载体构建 0025 根据 Liu， et al， Two host cytoplasmic effectors are required for pathogenesis of Phytophthora sojae。

15、 by suppression o f host defenses.Plant physiology， 2011， 155， 1 ： 490-501 文章中构建方法获得 PVX:PsIR1 和 PVX:GFP 质粒。 说 明 书 CN 102533852 A 4 3/4 页 5 0026 2. 农杆菌介导的瞬时表达 0027 将 PVX:PsIR1 和 PVX:GFP 质粒通过电转化技术转入 GV3101 农杆菌 (Biovector) 菌株中， 将农杆菌的阳性转化子于 3ml 添加 kanamycin(50g/ml) 的 LB 培养液中， 220rpm， 28-30培养 48h， 4000r。

16、pm 离心 4min， 收集菌体， 用 10mM MgCl2重悬， 重复三次后， 用 10mM MgCl2定容至 OD600 0.4-0.6。取生长 6-8 周的烟草， 从上数第三至第六片完全展开的真 叶被用于渗透接种农杆菌。用针头在烟草下表皮造成一小伤口， 用 1mL 无针头的注射器将 30-50l 农杆菌悬液渗透到本氏烟叶片中。 0028 3. 烟草疫霉接种和病斑长度测量 0029 农杆菌表达 5 天后取下注射的烟草叶片， 放在培养皿里面滤纸保湿， 然后用培养 3-5 天烟草疫霉菌丝块接种处理过的烟草叶片， 随时观察和记录烟草叶片的表型变化， 2 天 后， 用酒精脱色后测量病斑直径。与对照。

17、相比 GFP 相比， PsIR1 可以显著限制烟草疫霉的侵 染， 至少可使烟草疫霉的侵染速度减缓 25以上 ( 图 1)。 0030 实施例 2PsIR1 引起水杨酸通路防卫反应基因的高表达 0031 将实施例 1 中获得的 PVX:PSIR1 和 PVX:GFP 按照实施例 1 的方法在烟草上 瞬时表达， 分别在表达 0d 和 5d 时取样， 按照 Total RNA Purification System 试剂 盒 (Invitrogen) 提供的 Protocal 进行。荧光定量 PCR 操作按照 ABI 7300 Sequence Detection System(Applied Bi。

18、osystems， USA) 软件和指南进行。PCR 反应液 ： 使用 Real time PCR 试剂盒 (Premix Ex TaqTM， TaKaRa， DaLian， China) 来进行反应。以瞬 时表达烟草叶片所提取的 RNA 进行逆转录， 将获得的 cDNA 为模板进行相对定量 PCR 扩增。 将 50ng 的 cDNA 和 0.2M 引物， 0.4ul ROX Reference Dye 及 10ulPremix Ex TaqTM 混合于 20l 的 PCR 反应体系中。PCR 程序为 ： 95 30 秒预变性， 40 个循环 PCR 反 应 (95 5 秒， 65 31 秒 。

19、)， 引物的特异性通过融解曲线和电泳来判断。本研究中所用到的 引物见表 1。 0032 与 0d 未处理的烟草叶片相比， PsIR1 可显著提高 SA 通路基因 PR2b 和 PRb-1b 基 因的表达， 分别引起 PR2b 和 PRb-1b 的表达量提高约 10000 和 20000 倍， 而 GFP 对照仅提高 分别为 1000 倍和 100 多倍 ( 图 2)。由此可见， PsIR1 可以显著引起 SA 通路防卫反应基因 的表达。 0033 表 1 本研究中所用到的荧光定量引物 0034 说 明 书 CN 102533852 A 5 4/4 页 6 说 明 书 CN 102533852 A 6 1/3 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 102533852 A 7 2/3 页 8 0003 序 列 表 CN 102533852 A 8 3/3 页 9 序 列 表 CN 102533852 A 9 1/2 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102533852 A 10 2/2 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102533852 A 11 。