技术领域
本发明涉及脂肪组织源性成体干细胞迁移的能力，且尤其是涉及脂肪组 织源性成体干细胞及其特定分泌产物的新型用途，所述脂肪组织源性成体干 细胞及其特定分泌产物具有迁移至有趋化因子或生长因子在其中表达的疾病 部位的能力，以及本发明涉及能够更有效地增强趋化因子或生长因子受体功 能的方法。
背景技术
干细胞是指不仅具有自我复制能力，而且具有分化为至少两种类型细胞 的能力的细胞，并可分为全能干细胞、多能干细胞(pluripotent stem cell) 和多潜能干细胞(专能干细胞，multipotent stem cell)。
全能干细胞是具有能够发育为一个完整个体的全能特性的细胞，卵细胞 和精子受精后达8细胞阶段的细胞拥有这些特性。当将这些细胞分离并移植 至子宫时，它们能够发育成一个完整个体。多能干细胞源自受精后4-5天产 生的位于囊胚内侧的内细胞团，是能够发育为源自外胚层、中胚层和内胚层 的多种细胞及组织的细胞。这些细胞被称为“胚胎干细胞”并且能够分化为 其他各种组织细胞，但不形成新的生物体。专能干细胞是指能够分化为对含 有这些细胞的组织和器官特异的单一细胞，且不但涉及胎儿、新生儿及成人 时期多种组织和器官的生长与发育，还涉及保持成体组织的体内平衡以及在 组织损伤时诱导再生的功能。将组织特异的专能细胞(multipotent cell)共 同称为“成体干细胞”。
成体干细胞是通过从各种人体器官取出细胞并将细胞发育为干细胞而获 得，且其特征在于它们分化为单一特定组织。然而，最近，关于将成体干细 胞分化为包括肝细胞在内的多种组织的实验相当成功，这成为了焦点。
人们在再生医学领域已做出了努力，利用细胞来再生生物组织及器官， 并恢复它们由于疾病或事故及类似原因而丧失的功能。通常用于再生医学领 域的方法包括以下步骤：收集干细胞、来自患者的血源性单核细胞或骨髓源 性单核细胞；通过试管培养诱导细胞的增殖和/或分化；并通过移植将选定 的未分化(干细胞和/或祖细胞)和/或分化细胞引入患者的身体。因此，预 期现有的通过药物或外科手术治疗疾病的传统方法将被细胞/组织替代疗法 取代，该疗法采用健康的细胞、组织或器官来替代损伤的细胞、组织或器 官，因而干细胞的应用将进一步增加。
因此，人们目前正研究干细胞的多种功能。特别地，正在进行关于干细 胞的有效分离、未分化状态的干细胞的维持和增殖以及干细胞分化为组织细 胞的多种研究。已有一些关于通过趋化因子处理来诱导骨髓源性干细胞迁移 的报告(Adriana Lopez Ponte et al.，Stem Cells，25：1737-1745，2007；Marek Honczarenko et al.，Stem Cells，24：1031-1041，2006；Sordi V et al.，Blood， 106：419-427，2005；Fiedler J et al.，J Cell Biochem，87：305-312，2002；Forte G et al.，Stem Cells，24：23-33，2006；Wright DE et al.，Blood，87：4100-4108，1996； Son BR et al.，Stem Cells，24：1254-1264，2006)，但还没有关于脂肪干细胞迁 移的报道。
由此，本申请发明人已发现脂肪间充质干细胞具有迁移的能力，且当干 细胞以各种趋化因子或生长因子进行前处理时，显著诱导了通过特定趋化因 子或生长因子的脂肪间充质干细胞的迁移。基于此结果，本申请发明人发现 了能够增强脂肪源性间充质干细胞表达趋化因子或生长因子受体能力的方 法，由此完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于诱导脂肪干细胞迁移的组合物，该组合 物含有作为活性成分的一种或多种脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物。
本发明的另一目的在于提供一种用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移 至疾病部位的方法。
本发明涉及表达趋化因子或生长因子受体的脂肪组织源性成体干细胞或 来自该干细胞的分泌产物的用途及功能。为了实现上述目标，本发明提供了 一种用于诱导脂肪干细胞迁移的组合物，该组合物含有作为活性成分的脂肪 源性成体干细胞和/或其分泌产物。
本发明组合物中的脂肪源性成体干细胞分泌产物的实例包括Rantes MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、MIP-3β(单核细胞炎性蛋白-3β)、SDF- 1α(基质细胞衍生因子-1α)、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16 (趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成 纤维细胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子 β1)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、PDGF-AB(血小板源性生长因子 AB)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、脂联素、瘦素以及前胶原的受体。优选 地，分泌产物可为脂联素和/或瘦素。
脂肪组织源性成体干细胞和/或其分泌产物可用作人脂肪组织源性成体 干细胞的培养液，所述培养液通过在含有特定成分的培养基中培养人脂肪组 织源性成体干细胞，收获培养基，并从培养基中移除细胞碎片来获得。
此外，组合物可进一步含有FBS。优选地，组合物可含有大约30％的 FBS。
脂肪源性成体干细胞及其分泌产物表达一种或多种趋化因子或生长因子 的受体，并随所述趋化因子或生长因子迁移，所述趋化因子或生长因子选自 由Rantes、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、MIP-3β(单核细胞炎性蛋白- 3β)、SDF-1α(基质细胞衍生因子-1α)、BCA-1(B细胞吸引趋化因子- 1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、 b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β1 (转化生长因子β1)、IGF-1(胰岛素样生长因子1)、PDGF-AB(血小板 源性生长因子AB)以及TNF-α(肿瘤坏死因子-α)构成的组。
此外，本发明组合物中的脂肪源性成体干细胞可优选源自哺乳动物，更 优选源自人。例如，脂肪源性成体干细胞可为人脂肪组织源性间充质干细胞 (AdMSC)。
特别地，本发明中使用的脂肪组织源性成体干细胞优选以含有趋化因子 或生长因子的混合物(cocktail)进行前处理。
优选地，该混合物可含有选自由Rantes、MCP-1(单核细胞趋化蛋白- 1)、MIP-3β(单核细胞炎性蛋白-3β)、SDF-1α(基质细胞衍生因子- 1α)、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序 配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、 HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)、IGF-1(胰岛素样 生长因子1)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及TNF-α(肿瘤坏 死因子-α)构成的组中的一种或多种因子。特别地，该混合物更优选可含有 选自由Rantes、SDF-1α(基质细胞衍生因子-1α)、HGF(肝细胞生长因 子)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB) 以及TGF-β1(转化生长因子β1)构成的组中的一种或多种因子。
人成体干细胞优选含有总计约1×107至1×1010的细胞，且更优选为约 1×108至1×109的细胞。
本发明也提供了一种用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，该 方法包括以下步骤：
(a)以含有趋化因子或生长因子的混合物对脂肪组织源性成体干细胞 进行前处理；以及
(b)将含经前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物的组合物 施用于不与疾病部位直接接触的体内部位。在这一方法中，组合物最优选为 进行静脉给药。
附图说明
图1以图表显示了由多种趋化因子或生长因子诱导脂肪组织源性专能间 充质干细胞迁移的结果。
图2为在诱导细胞迁移后，脂肪组织源性专能间充质干细胞的一组显微 图片。
图3以图表显示了通过10％的FBS诱导以多种趋化因子或生长因子进 行前处理的脂肪组织源性专能间充质干细胞迁移的结果。
图4以图表显示了通过多种趋化因子或生长因子诱导以TNF-α进行前 处理的脂肪组织源性专能间充质干细胞迁移的结果。
图5以图表显示了以多种趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪组织源 性专能间充质干细胞，通过与用于前处理细胞相同的趋化因子或生长因子来 诱导迁移的结果。
图6是显示为确定各种趋化因子或生长因子受体是否在脂肪组织源性专 能间充质干细胞及A549细胞中表达而进行的FACS结果的一组图片。
图7为是显示为确定各种趋化因子或生长因子受体的mRNA是否在脂 肪组织源性专能间充质干细胞中表达而进行的RT-PCR结果的一组图片。在 图7A中，泳道1：CCR1(380bp)，泳道2：CCR2(474bp)，泳道3： CCR7(461bp)，泳道4：CXCR4(489bp)，泳道5：CXCR5(494 bp)，泳道6：CXCR6(517bp)以及泳道7：GAPDH(362bp)。在图 7B中，M：分子标记，泳道1：EGFR(419bp)，泳道2：TGFBR2(498 bp)，泳道3：PDGFRA(187bp)，泳道4：PDGFRB(508bp)，泳道 5：IGF1R(299bp)，泳道6：c-MET(201bp)，泳道7：TNFRSF1A (218bp)，泳道8：FGFR1(250bp)以及泳道9：GAPDH(362bp)。
图8描绘了图表及一组显微图片，其显示了通过1、10及100ng/ml的 脂联素诱导以脂联素进行前处理的脂肪组织源性多能间充质干细胞迁移的结 果。
图9是显示为确定脂联素受体1和2的mRNA是否在脂肪组织源性专 能间充质干细胞中表达而进行的RT-PCR结果的一组图片。在图9中，泳道 1：ADIPOR1(337bp)，泳道2：ADIPOR2(538bp)，泳道3：GAPDH (362bp)。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术及科学术语与本发明所属领 域的普通技术人员通常所理解的含义相同。一般地，本文中使用的命名及将 在下文描述的实验方法是本领域公知且通常采用的。
干细胞是指不仅具有自我复制能力，而且具有分化为至少两种类型细胞 的能力的细胞。
成体干细胞是出现在发育过程后胚胎中各器官已形成的阶段或成体阶段 的干细胞。已知成体干细胞是多潜能的，且能够分化为组织及器官特异性细 胞。这样的多潜能干细胞(专能干细胞)，是能够分化为对含有这些细胞的 组织及器官特异的细胞，且不但涉及胎儿、新生儿及成人时期中多种组织和 器官的生长与发育，还涉及保持成体组织的体内平衡，以及在组织损伤时诱 导再生的功能。
在本发明中，可采用源自脂肪组织或上皮组织如毛囊或羊膜的成体干细 胞。优选地，采用人脂肪组织源性成体干细胞。可采用间充质干细胞 (MSC)。特别地，可采用人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。
所述脂肪组织或上皮组织优选源自哺乳动物，更优选源自人。在本发明 的一个实例中，采用了人脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)。
本文中所使用的“脂肪组织源性成体干细胞”或“脂肪组织源性间充质 干细胞”是指从脂肪组织中分离的未分化成体干细胞，且在本文中也称作 “脂肪干细胞”。可根据本领域已知的任一常规方法来获得这些细胞。
可采用本领域已知的适于干细胞培养的任一常规培养基来获得脂肪干细 胞。例如，本发明中采用了DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)。
培养脂肪干细胞的培养基可补充添加剂，该添加剂促进脂肪干细胞未分 化表型增殖，同时抑制细胞分化。并且，培养基一般可含有等渗溶液的中性 缓冲液(如磷酸盐和/或高浓度碳酸氢盐)；蛋白营养物(例如，血清如 FBS、血清替代品、白蛋白或必需及非必需氨基酸如谷氨酰胺)。此外，培 养基可含有脂类(脂肪酸、胆固醇、血清HDL或LDL抽提物)以及在大部 分这类培养基中发现的其他成分(如胰岛素或转铁蛋白、核苷或核苷酸、丙 酮酸、糖源如葡萄糖、呈任何离子形式或盐的硒、糖皮质激素如氢化可的松 和/或还原剂如β-巯基乙醇)。
此外，为了防止细胞彼此附着，附着在容器壁上或形成过大的聚簇，在 培养基中包括抗凝剂如Invitrogen出售的抗凝剂(Cat#0010057AE)可能有 益处。
在这些中，采用下列一种或多种添加剂可能是有利的：
·干细胞因子(SCF、Steel因子)、二聚化c-kit的其他配体或抗体， 以及相同信号传导通路的其他活化剂
·其他酪氨酸激活酶相关受体的配体，例如血小板源性生长因子 (PDGF)、巨噬细胞集落刺激因子、Flt-3配体以及血管内皮生长因子 (VEGF)受体的配体
·提高环腺苷酸cAMP水平的因子，如弗斯可林(forskolin)
·诱导gp130的因子，如LIF或制瘤素-M
·造血生长因子，如血栓形成素(TPO)
·转化生长因子，如TGFβ1
·其他生长因子，如上皮生长因子(EGF)
·神经生长因子，如CNTF
·N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)
·氢化可的松
·抗坏血酸
特别地，本发明一个实施方式中用来培养脂肪干细胞的培养基优选含 有NAC、抗坏血酸、钙、胰岛素及氢化可的松。更优选地，培养基含有 FBS、NAC、抗坏血酸、钙、rEGF、胰岛素及氢化可的松。
本发明的组合物可含有作为活性成分的来自脂肪组织源性间充质干细胞 的分泌产物。
分泌产物的实例包括多种趋化因子、氨基酸、生长因子及类似物。本发 明组合物中可含有的分泌产物特定实例包括TGF、bFGF、IGF-1、KGF、 HGF、纤连蛋白、VEGF、脂联素、瘦素及前胶原，以及它们的受体。在来 自脂肪源性成体干细胞的这些分泌产物中，脂联素或瘦素特别源自脂肪组 织，且非常有助于诱导细胞迁移。
人成体干细胞和/或其分泌产物可用作人脂肪组织源性成体干细胞的培 养液，通过在含有特定成分的培养基中培养人脂肪组织源性成体干细胞，收 获培养基，并从培养基中移除细胞碎片来获得。可选地，培养液提取物可单 独或联合使用。
换言之，本发明的组合物可为含有脂肪源性成体干细胞及其分泌产物和 培养基成分的组合物，或者含有细胞分泌产物及培养基成分的组合物，或者 含有单独的的细胞分泌产物或的细胞分泌产物与成体干细胞结合的组合物， 或者仅含有在体内产生分泌产物的脂肪源性成体干细胞的组合物。
在一个方面，本发明涉及脂肪组织源性成体干细胞和/或其分泌产物用 于诱导干细胞迁移的用途。更特别地，本发明是基于发现了脂肪组织源性成 体干细胞及其特定分泌产物显示出趋化因子或生长因子受体的功能，它们在 疾病部位表达。
本文中所使用的短语“显示出趋化因子或生长因子受体的功能”是指脂 肪组织源性成体干细胞在细胞表面表达特异性结合特定趋化因子或生长因子 的受体，或来自这些细胞的分泌产物为该受体或包括该受体。换言之，这意 味着脂肪干细胞具有与特定趋化因子或生长因子反应的能力。
生长因子是指促进各种细胞分裂、生长及分化的多肽的集合，且已知它 们参与细胞信号。生长因子根据结构相似性被分类为家族，并通过如自分 泌、旁分泌、内分泌及类似机制作用于目标细胞。生长因子受体通常在胞内 区具有酪氨酸激酶活性，且当它们与配体受体结合时，生长因子受体本身或 胞内蛋白的酪氨酸残基磷酸化，并发生细胞增殖或分化。
趋化因子由在炎症中产生并调节白细胞募集的小细胞因子家族构成。这 些趋化因子能够选择性诱导血液有形成分(除了红血球)的趋化性，包括白 细胞如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、 肥大细胞及淋巴细胞，如T细胞和B细胞。除了刺激趋化性，可通过应答 细胞中与白细胞活化有关的趋化因子来选择性诱导其他变化，包括细胞形状 的变化、胞内游离钙离子(Ca2+)浓度的瞬时上升、颗粒胞吐、上调整合、 生物活性脂类(例如，白细胞三烯)的形成以及呼吸爆发。因此，趋化因子 是炎症反应的早期触发物，引发炎症介质释放、趋向及外渗至感染或炎症部 位。
总之，趋化因子/受体相互作用倾向于是混杂的，即一个趋化因子能结 合至许多趋化因子受体，并且相反地，单个趋化因子受体能与若干趋化因子 相互作用。先前还未了解趋化因子受体信号以及对配体选择性的许多方面。
基于脂肪源性成体干细胞及其分泌产物显示出趋化因子受体功能的新发 现，本申请旨在利用脂肪源性成体干细胞对在疾病部位表达的特定趋化因子 反应而迁移至感染或炎症部位(例如，疾病部位)的功能(这迁移也称作 “目标迁移”)。在本发明中，也考虑到了反应不仅是对趋化因子，而且也 对特定生长因子。特别地，脂肪源性成体干细胞对选自由Rantes、MCP-1 (单核细胞趋化蛋白-1)、MIP-3β(单核细胞炎性蛋白-3β)、SDF-1α(基 质细胞衍生因子-1α)、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16(趋化 因子C-X-C基序配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成纤维细 胞生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)、 IGF-1(胰岛素样生长因子1)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以 及TNF-α(肿瘤坏死因子-α)构成的组中的趋化因子或生长因子反应极佳。
为了通过趋化因子或生长因子与其受体相互作用来增强细胞迁移的能 力，本发明的组合物可进一步含有FBS。优选地，组合物含有大约30％的 FBS。应理解，即便组合物中不含FBS，施用至体内时也能够利用现存于体 内的FBS。
同时，为了提高脂肪组织源性成体干细胞和/或脂肪组织源性成体干细 胞的分泌产物受体的表达水平或反应，脂肪组织源性成体干细胞优选以含有 趋化因子或生长因子的混合物进行前处理。
特别地，混合物可优选含有选自由Rantes、MCP-1(单核细胞趋化蛋 白-1)、MIP-3β(单核细胞炎性蛋白-3β)、SDF-1α(基质细胞衍生因子- 1α)、BCA-1(B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序 配体16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、 HGF(肝细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)、IGF-1(胰岛素样 生长因子1)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及TNF-α(肿瘤坏 死因子-α)构成的组中的一种或多种因子。混合物可更优选含有选自由 Rantes、SDF-1α(基质细胞衍生因子-1α)、HGF(肝细胞生长因子)、 TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及 TGF-β1(转化生长因子β1)构成的组中的一种或多种因子。
如本发明的实施例5所示，在以特定趋化因子或生长因子和/或细胞的 分泌产物对脂肪组织源性成体干细胞进行前处理的情形下，对趋化因子或生 长因子反应的细胞迁移显著增加了。
因此，在另一方面，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移 的方法，该方法包括以下步骤：
(a)以含有趋化因子或生长因子的混合物对脂肪组织源性成体干细胞 进行前处理；以及
(b)将含经前处理的脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物的组合物 施用于体内部位，该部位不与疾病部位直接接触。
本发明的方法中，通过在含有趋化因子或生长因子的培养基中培养成体 干细胞来实施以含有趋化因子或生长因子的混合物对成体干细胞进行前处理 的步骤(a)。成体干细胞的前处理约进行20-60小时，优选约20-50小 时。本发明的一个实施方式中，成体干细胞的前处理进行24小时。此外， 在脂肪干细胞培养之前、期间或之后实施以混合物对脂肪干细胞进行前处 理。优选地，在脂肪干细胞培养之后实施前处理。
混合物可优选含有选自由Rantes、MCP-1(单核细胞趋化蛋白-1)、 MIP-3β(单核细胞炎性蛋白-3β)、SDF-1α(基质细胞衍生因子-1α)、 BCA-1(B细胞吸引趋化因子-1)、CXCL16(趋化因子C-X-C基序配体 16)、EGF(内皮生长因子)、b-FGF(碱性成纤维细胞生长因子)、HGF (肝细胞生长因子)、TGF-β1(转化生长因子β1)、IGF-1(胰岛素样生长 因子1)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及TNF-α(肿瘤坏死因 子-α)构成的组中的一种或多种因子。更优选地，混合物可含有选自由 Rantes、SDF-1α(基质细胞衍生因子-1α)、HGF(肝细胞生长因子)、 TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、PDGF-AB(血小板源性生长因子AB)以及 TGF-β1(转化生长因子β1)构成的组中的一种或多种因子。
此外，用于步骤(b)的含经前处理的脂肪源性成体干细胞和/或其分泌 产物的组合物可为含有所有经前处理的脂肪干细胞、分泌产物及培养基的组 合物，或者含有分泌产物和未经前处理的脂肪干细胞的培养基的组合物，或 者含有无分泌产物的经前处理的脂肪干细胞及培养基的组合物。因此，可以 各种方式使用经前处理的脂肪干细胞、分泌产物及培养基，但无特别限制。
进一步，本文中所使用的短语“将组合物施用于体内部位，该部位不与 疾病部位直接接触”意味着通过诱导干细胞的至少部分定位于疾病部位外的 部位的方法或途径，排除移植干细胞至疾病部位的方法，来在受试者中定位 干细胞。本发明的组合物能通过任一适合途径来施用于受试者，以便将其递 送至受试者的期望位置，在该位置中细胞的一些成分仍存活。本文中所使用 的术语“施用”可与“引入”、“递送”、“定位”或类似语互换使用。在 临床施用上，本发明的组合物可肠道外施用，例如，通过肌肉内或静脉注 射。最优选地，本发明的组合物通过静脉注射施用。
因此，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞迁移的方法，该方 法包括静脉内施用含有以趋化因子或生长因子和/或其分泌产物进行前处理 的脂肪组织源性成体干细胞的组合物。
再一方面，本发明涉及用于诱导脂肪组织源性成体干细胞目标迁移的方 法，使得细胞到达疾病部位，从而治疗该疾病部位。因此，本发明涉及含有 脂肪组织源性成体干细胞及其分泌产物作为活性成分的细胞治疗剂，以及利 用该细胞治疗剂治疗疾病部位的方法。
除非另有指示，否则本文中所使用的术语“治疗”意味着逆转、缓和、 抑制该术语所适用的失调或病症或者这种失调或病症的一种或多种症状的进 展，或防止它们。本文中所使用的术语“治疗(treatment)”是指如上述定 义的“进行治疗”这样的治疗行为。因此，本文中所使用的，对哺乳动物 “进行治疗”疾病或疾病“治疗”包括以下一种或多种：
(1)抑制疾病的生长，例如，阻止它的发展；
(2)防止疾病的扩散，例如，防止转移；
(3)减轻疾病，例如，使癌症消退；
(4)防止疾病复发；以及
(5)缓和疾病症状。
为了通过使干细胞迁移至疾病部位来治疗疾病部位，本发明的组合物以 药物有效量进行施用。
本文中所使用的术语“治疗有效量”意味着待施用化合物缓和所治疗疾 病的一种或多种症状至某种程度的剂量。因此，治疗有效量是指具有以下效 果的剂量：(1)逆转疾病进展的速度；(2)抑制疾病进展至某种程度；或 者(3)减轻(优选消除)与疾病相关的一种或多种症状至某种程度。
本发明的组合物(细胞治疗剂)在临床上可由肠胃外施用，如肌肉内或 静脉内。最优选地，本发明的组合物通过静脉注射施用。
为了注射，本发明的组合物优选地可用药学上可接受的缓冲液配制，如 Hank溶液，Ringer溶液或生理盐水缓冲液。为了穿过黏液(transmucous) 施用，制剂中采用适于穿过组合物待通过的屏障的非侵入试剂。这些非侵入 试剂是本领域中通常已知的。
肠道外施用的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳化剂。可 用于本发明的悬浮剂及乳化剂包括植物油，如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油， 以及可注射酯如油酸乙酯。
对于人，本发明的细胞治疗剂通常可以104-1010细胞/个体，且优选以 106-108细胞/个体的剂量施用一次或若干次。特别地，本发明的组合物优选 含有浓度为1×108细胞/100μl至1×109细胞/100μl的成体干细胞。
然而，应当理解组合物活性成分的实际剂量应根据多种相关因素来确 定，包括待治疗的疾病，施用途径，患者年龄、性别及体重，以及疾病的严 重程度。因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例
下文中，将参考实施例进一步详细描述本发明。本领域技术人员显而易 见，这些实例仅作为示意用途，且不构成对本发明保护范围的限制。
下表1显示了实施例中使用的培养基及试剂的来源。
表1
实施例1：源自人脂肪组织的间充质干细胞的分离
通过吸脂术从腹部脂肪中分离人脂肪组织，并用PBS洗涤。细致切割 分离的组织，且之后用补充了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM培养基在 37℃消化2小时。用PBS洗涤后，将消化的组织以1000rpm离心5分钟。 吸掉上清液，并用PBS洗涤残留在底部的沉淀，且之后以1000rpm离心5 分钟。留下的细胞通过100-μm网状过滤器过滤来移除碎片，然后用PBS洗 涤细胞且之后在DMEM(10％FBS、2mM NAC、0.2mM抗坏血酸)中培 养过夜。
随后，通过PBS洗涤来移除非附着细胞，且传代培养残留的细胞，同 时每隔两天以Keratinocyte-SFM培养基(含有5％FBS、2mM NAC、0.2 mM抗坏血酸、0.09mM钙、5ng/ml rEGF、5μg/ml胰岛素以及74ng/ml氢 化可的松)替代培养基，由此分离脂肪组织源性专能间充质干细胞。
实施例2：诱导脂肪干细胞的迁移
2-1：通过表2中示出的趋化因子或生长因子诱导细胞迁移
将实施例1中分离的脂肪组织源性多潜能间充质干细胞以2×104细胞 /200μl的浓度接种至各孔，并通过下表2中示出的趋化因子或生长因子诱导 迁移。以30％的FBS作为阳性对照组。
表2
FBS 30％ BCA-1 TGF-β1 Rantes CXCL16 IGF-1 MCP-1 EGF PDGF-AB MIP-3β b-FGF TNF-α SDF-1α HGF
图1显示了诱导细胞迁移的结果。以通过培养基诱导迁移的细胞作为阴 性对照组，并以通过30％的FBS诱导迁移的细胞作为阳性对照组。诱导细 胞迁移的结果以100％阴性对照组的相对百分比来计算，并在图1中图示了 计算结果。如图1所示，脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)对趋化因 子或生长因子刺激反应而活跃迁移，这与对30％的FBS刺激反应的方式一 样。特别地，细胞对Rantes、SDF-1α、HGF、TGF-β1、IGF-1、PDGF-AB 或TNF-α反应而活跃地诱导迁移。
2-2：通过其他趋化因子或生长因子诱导迁移的细胞成像
以无FBS培养基(图2A)、TNF-α(图2B和2C)或趋化性因子(图 2D)对实施例1中分离的脂肪组织源性专能间充质干细胞进行前处理24小 时并培养。随后，通过0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA处理来分离细胞，之后 用PBS洗涤，1500rpm离心5分钟收集细胞。
然后，用0.1％明胶(Sigma-Aldrich)覆盖Transwell小室(insert) (Costar，3422)2小时，且铺在含有培养基的24孔板上。将收集的脂肪干 细胞以2×104细胞/200μl的浓度接种至各小室，并在5％CO2的培养箱中于 37℃培养2小时。随后，将所接种的小室转移至含有各培养基的24孔板， 趋化因子及生长因子浓度为100ng/ml。之后，在5％CO2的培养箱中于 37℃培养细胞24小时。然后，用棉拭移除小室上部存在的非迁移脂肪干细 胞，并洗涤残留细胞，且之后用70％甲醇固定1小时。
随后，用0.5％结晶紫溶液对细胞染色1小时。然后，洗涤细胞后在显 微镜下以×100放大率成像。
结果，如图2A至2D所示，经前处理的脂肪干细胞(图2C和2D)的 迁移速度高于未经前处理的脂肪干细胞(图2A和2B)，指示经前处理的 细胞是致密的。
实施例3：以趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪干细胞的迁移
以下表3示出的趋化因子或生长因子对实施例1中分离的脂肪组织源性 专能间充质干细胞进行前处理24小时。将经前处理的细胞以2×104细胞 /200μl的浓度接种至各孔，并通过10％的FBS诱导迁移，以观察其与通过 30％的FBS诱导细胞迁移的区别。同时，以未经前处理的脂肪源性专能间 充质干细胞(未处理细胞)作为阴性对照组。
表3
Rantes TNF-α SDF-1α PDGF-AB HGF TGF-β1
图3显示了诱导细胞迁移的结果。从图3所示的迁移细胞数量可见，在 这些以不同趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪组织源性间充质干细胞 (AdMSC)中，通过10％的FBS活跃诱导了这些以PDGF-AB或TNF-α进 行前处理的细胞的迁移。特别地，显著活跃地诱导了以TNF-α进行前处理 的细胞的迁移。
实施例4：以TNF-α进行前处理的脂肪干细胞的迁移
参考实施例3中获得的测试结果，以TNF-α对实施例1中分离的脂肪 组织源性专能间充质干细胞进行前处理24小时。将经前处理的细胞以2× 104细胞/200μl的浓度接种至各孔，并通过下表4中所示的不同趋化因子或 生长因子诱导迁移。
表4
FBS(无) BCA-1 TGF-β1 Rantes CXCL16 IGF-1 MCP-1 EGF PDGF-AB MIP-3β b-FGF TNF-α SDF-1α HGF
图4显示了诱导细胞迁移的结果。如图4所示，通过Rantes、SDF- 1α、EGF、β-FGF、TGF-β1、PDGF-AB及类似物活跃诱导了以TNF-α前处 理的脂肪组织源性间充质干细胞(AdMSC)的迁移。特别地，当将图4的 结果与显示实施例1结果的图1的结果比较时，可表明以TNF-α进行前处 理的效果。特别地，可见当细胞以TNF-α进行前处理时，细胞的迁移变得 活跃。
实施例5：以不同趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪干细胞以及趋 化因子或生长因子诱导细胞迁移的能力
以下表5中所示的趋化因子或生长因子对实施例1中分离的脂肪组织源 性专能间充质干细胞进行前处理约24小时。将经前处理的细胞以2×104细 胞/200μl的浓度接种至各孔，并采用与前处理时相同的趋化因子或生长因子 诱导迁移。
表5
FBS 30％ BCA-1 TGF-β1 Rantes CXCL16 IGF-1 MCP-1 EGF PDGF-AB MIP-3β b-FGF TNF-α
SDF-1α HGF
图5显示了诱导细胞迁移的结果。在图5中，白色柱状图指示未经前处 理的细胞，且黑色柱状图指示由于以趋化因子或生长因子进行前处理而迁移 的细胞数量。如图5所示，以Rantes、MIP-3β、SDF-1α、BCA-1、 CXCL16、EGF、PDGF-AB或类似物进行前处理的脂肪干细胞的迁移相较 未经前处理的脂肪干细胞得以增加。特别地，当以Rantes、SDF-1α、BCA- 1、CXCL16或PDGF-AB进行前处理时，细胞迁移的能力显著提高。
实施例6：脂肪干细胞中的趋化因子或生长因子受体的表达
通过流式细胞仪(FACS)，采用相应受体的抗体检测了实施例1中获 得的脂肪组织源性专能间充质干细胞是否表达各趋化因子或生长因子受体。
同时，下表6示出了趋化因子或生长因子的受体及配体的名称。
表6
受体 趋化因子或生长因子 配体 CCR1 RANTES CCL5 CCR2 MCP-1 CCL2 CCR7 MIP-3β CCL19 CXCR4 SDF-1α CXCL12 CXCR5 BCA-1 CXCL13 CXCR6 CXCL16 CXCL16 EGF EGFR b-FGF FGFR1 HGF c-MET TGF-β1 TGFBR2 IGF-1 IGF1R PDGF-AB PDGFRA、PDGFRB TNF-α TNFRSF1A
在T75培养瓶中培养脂肪干细胞。当细胞生长铺至90％时，以0.25％ 胰蛋白酶/1mM EDTA处理来分离细胞，之后用PBS洗涤，1500rpm离心 5分钟收集细胞。在4℃冰箱中将收集的细胞用10％的FBS溶液固定1小 时或更长时间，随后洗涤。然后，用下表7中所示抗体孵育细胞，并通过 FACS分析。
表7
抗体 商标品牌 系列号 抗人CCR1 R&D Systems MAB145 抗人CCR2 R&D Systems MAB150 抗人CCR7 R&D Systems MAB197 抗人CXCR4 R&D Systems MAB170 抗人CXCR5 R&D Systems MAB190 抗人CXCR6 R&D Systems MAB699 抗人EGF受体 BD Pharmingen 555997 TGFβ RII(D-2) Santa Cruz Biotechnology sc-1779949 CD140a-PDGFRA BD Pharmingen 556002 CD140b-PDGFRB BD Pharmingen 558821 CD221-IGF1R BD Pharmingen 555999 抗人HGF R/c-MET R&D Systems FAB3582F CD120a-TNFRSF1A BD Pharmingen 550514 FGFR1抗体[M19B2] Abcam ab823
图6显示了分析结果。在图6中，深色区域指示了测试组，黑线指示了 对照组。没有确认IGF-1及HGF的受体，且因而为了确认抗体的功能，培 养从细胞系库中购买的肺癌A549细胞系，并通过流式细胞仪(FACS)分 析。
如图6所示的FACS分析结果可见，经前处理的脂肪组织源性专能间充 质干细胞表达了Rantes(CCR1)、MIP-3β(CCR7)、SDF-1α (CXCR1)、BCA-1(CXCR5)、CXCL16、EGF、TGF、PDGF-AB、IGF- 1、TNF-α以及FGF的受体。
上述结果确认了特定趋化因子或生长因子受体在脂肪组织源性专能间充 质干细胞中表达，且这些受体与相应的趋化因子或生长因子反应，也通过相 应的趋化因子或生长因子进行前处理来提高受体的表达水平。这表明能够利 用趋化因子或生长因子与其受体之间的相互作用来诱导脂肪组织源性专能间 充质干细胞目标迁移至体内的疾病部位，由此有效地治疗与疾病部位相应的 疾病。
实施例7：在脂肪干细胞中检测趋化因子或生长因子受体的mRNA
通过RT-PCR检测实施例1中获得的脂肪组织源性专能间充质干细胞是 否表达各趋化因子或生长因子受体的mRNA。
以0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA处理来分离T75培养瓶中培养的脂肪干 细胞，之后用PBS洗涤，随后1500rpm离心5分钟收集细胞。采用总RNA 提取试剂盒(iNtRON Biotechnology)从收集的细胞中提取总RNA。
采用Maxime RT Pre-mix试剂盒(iNtRON Biotechnology)将2μg RNA 合成cDNA。1μl cDNA用1×h-Taq缓冲液、0.2mM dNTP、0.4pM上游引 物、0.4pM下游引物以及0.25U/μl h-Taq DNA聚合酶(Solgent)在95℃变 性20秒，之后将引物在表8所示的各自退火温度下加热40秒，且PCR产 物在72℃延伸1分钟，由此扩增cDNA。PCR扩增进行40个循环。下表8 显示了PCR扩增中使用的受体引物的加热温度。
表8
采用2.0％的琼脂糖凝胶及1×TAE试剂将各PCR产物与分子标记 DNA-50(iNtRON)在110V下电泳1小时30分钟，之后用Fuji分子成像 软件成像。使用GAPDH作为对照基因。由Solgent Co.，Ltd.对所有PCR产 物测序，作为结果，确定PCR产物具有99％或更高的序列一致性。
如图7结果可示，趋化因子或生长因子受体的mRNA在脂肪干细胞中 表达。在图7A中，泳道1：CCR1(380bp)，泳道2：CCR2(474bp)， 泳道3：CCR7(461bp)，泳道4：CXCR4(489bp)，泳道5：CXCR5 (494bp)，泳道6：CXCR6(517bp)以及泳道7：GAPDH(362bp)。 在图7B中，泳道M：分子标记，泳道1：EGFR(419bp)，泳道2： TGFBR2(498bp)，泳道3：PDGFRA(187bp)，泳道4：PDGFRB (508bp)，泳道5：IGF1R(299bp)，泳道6：c-MET(201bp)，泳道 7：TNFRSF1A(218bp)，泳道8：FGFR1(250bp)以及泳道9：GAPDH (362bp)。在这一实施例中，以GAPDH作为阳性对照组。
上述结果确定了特定趋化因子或生长因子受体的mRNA在脂肪干细胞 中表达。这表明可利用趋化因子或生长因子与其受体的相互作用来诱导脂肪 干细胞目标迁移至体内的疾病部位，由此有效地治疗与疾病部位相应的疾 病。
实施例8：以脂联素对脂肪干细胞进行前处理，并检测脂联素在不同浓 度下诱导细胞迁移的能力
8-1：检测脂联素在不同浓度诱导细胞迁移的能力
以脂联素对实施例1中分离的脂肪组织源性专能间充质干细胞进行前处 理24小时。通过不同浓度(1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml)的脂联素处理 来诱导经前处理的细胞的迁移。
图8示出了诱导细胞迁移的结果。如其中所示，用100ng/ml脂联素处 理的细胞的迁移比用10ng/ml脂联素处理的细胞的迁移大约快2倍。这表明 了脂联素诱导细胞迁移的能力随着其浓度增加而提高。
8-2：脂肪干细胞中脂联素受体的表达
通过采用上面表8所示的引物和退火温度以及与实施例7相同的方式进 行RT-PCR，检测脂联素受体是否在脂肪干细胞中表达。
结果，如图9所示，在脂肪干细胞中表达了两种类型的脂联素受体 (1：ADIPOR1(337bp)和2：ADIPOR2(538bp))。因此，确定了以 脂联素前处理脂肪细胞导致细胞中脂联素受体表达水平提高，从而可利用脂 联素与脂联素受体之间的相互作用来治疗疾病。
虽然参考特定附图详细描述了本发明，但本领域技术人员显而易见这描 述仅为优选的实施方式，并不限制本发明的保护范围。因此，本发明的实质 保护范围将由附录的权利要求及其等效权利要求来限定。
工业实用性
本发明涉及脂肪源性成体干细胞及其分泌产物迁移的能力。根据本发 明，以特定趋化因子或生长因子进行前处理的脂肪源性成体干细胞或其分泌 产物可通过简单方式如静脉给药来施用，且能够靶向需要移植干细胞的疾病 部位，并迁移至疾病部位。因此，根据本发明的脂肪源性成体干细胞或其分 泌产物作为细胞治疗剂是有用的，且不需要复杂的外科手术即可安全迁移至 疾病部位，并在疾病部位上展现了治疗效果。
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