一种通过CD226基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102660643 A (43)申请公布日 2012.09.12 CN 102660643 A *CN102660643A* (21)申请号 201210124430.5 (22)申请日 2012.04.25 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 无锡市第三人民医院 地址 214041 江苏省无锡市北塘区兴源北路 585 号 (72)发明人 张淳 周萍 李建平 吕国强 李成万 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 殷红梅 (54) 发明名称 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂 盒及其用途 (57) 摘要 本发明。

2、涉及一种通过 CD226 基因检测胃癌易 感性的试剂盒， 包括盒体和装于盒体内的物质， 其 特征在于 ： 所述盒体内的物质包括检测 CD226 基 因上的rs57613010号SNP位点的特异性引物及特 异性荧光探针、 TaqDNA聚合酶、 dNTP混合液、 MgCl2 溶液、 荧光定量 PCR 反应缓冲液和去离子水。本 发明的试剂盒用于检测 DNA 的 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的基因型， 既适用于检测 个体胃癌的易感性， 又适用于对乳腺癌、 前列腺癌 及卵巢癌的预后检测， 更可广泛应用于医疗研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页。

3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 1/1 页 2 1. 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 包括盒体和装于盒体内的物质， 其 特征在于 ： 所述盒体内的物质包括检测CD226基因上的rs57613010号SNP位点的特异性引 物及特异性荧光探针、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 混合液、 MgCl2溶液、 荧光定量 PCR 反应缓冲液 和去离子水 ； 所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为 ： 正义引物 ： 5 - AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG -3 ， 反义引物 ： 5。

4、 - CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC -3 ； 所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针， 它们的序列为 ： 野生型探针 ： 5 - CCATGCATGAGTACATA -3 ， 突变型探针 ： 5 - CCATGCATCAGTACATA -3 。 2. 如权利要求 1 所述的通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 盒体中各物质的含量为 ： 浓度为 10M 的特异性引物共 0.45l， 其中正义引物和反义引 物各 0.225l ； 浓度为 5M 的特异性荧光探针共 0.2l， 其中野生型探针和突变型探针 各 0.1l ； 浓度为 5 单位 /l 。

5、的 Taq DNA 聚合酶 0.02l ； 浓度为 20mM 的 dNTP 混合液 0.1l ； 浓度为 25mM 的 MgCl2溶液 0.5l ； 5X 荧光定量 PCR 反应缓冲液 2l ； 去离子水 4.73l。 3. 如权利要求 1 所述的通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 特异性引物中， 正义引物的 Tm 值为 60 ， 反义引物的 Tm 值为 58 ； 所述特异性荧光探针 中， 野生型探针的 Tm 值为 66 ， 突变型探针的 Tm 值为 67 。 4. 如权利要求 1 所述的通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 其特征在于 ： 所述 试。

6、剂盒的保存温度为 -20。 5. 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒的用途， 其物征在于 ： 所述试剂盒用 于检测 DNA 的 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的基因型。 权 利 要 求 书 CN 102660643 A 2 1/5 页 3 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒， 具体地说是一种通过 CD226 基因检 测胃癌易感性的试剂盒及其用途， 其通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶 4(CD226) 的单核 苷酸多态性 (SNP) 位点来预测胃癌的易感性， 属于医疗研究技。

7、术领域。 背景技术 0002 胃癌发病率居消化道肿瘤的首位， 列全部恶性肿瘤的第三位。我国每年死于胃癌 者约为 16 万人。癌症的发生是一个多因素、 多阶段、 多基因变异的过程。肿瘤细胞和机体 免疫系统的相互作用一直贯穿于整个过程中。作为调节 T 细胞和 NK 细胞功能的关键分子， CD226参与了对机体免疫系统对肿瘤的调控。 大量的研究表明， 肿瘤免疫调控相关基因的单 核苷酸多态可以通过改变这些基因的表达水平的方式， 影响这些基因在肿瘤发生、 发展中 的作用。 0003 SNP(Single nucleotide polymorphism)， 即单核苷酸多态性， 是人类基因组作图 的第三代遗。

8、传标记， 主要是指一类基于单碱基变异引起的 DNA 序列多态性， 包括单碱基转 换、 颠换， 以及单碱基的插入 / 缺失等。它是基因组最广泛存在的一类多态性标记， 已成为 研究基因组多态性和识别、 定位疾病相关的一种工具。1996 年成功研制了 SNP 检测的实时 荧光定量 PCR 技术， 实现了 PCR 从定性到定量的飞跃， 还实现了判断结果的自动性。可利用 荧光定量 PCR 技术研发检测疾病易感性的试剂盒。 0004 CD226 是由 Shibuya 等人于 1996 克隆成功的， 并在 2000 年第七届人类白细胞分 化抗原协作组大会上获得了 CD226 的编号。人 CD226 基因定位。

9、于染色体 18q22-23 上， 成熟 的蛋白由 318 个氨基酸组成。该分子为一个 67kD 大小的 I 型跨膜糖蛋白， 属于免疫球蛋白 超家族成员， 胞膜外区由 232 个氨基酸组成， 含有 2 个 V 样结构域 ； 胞浆区有 61 个氨基酸， 胞浆区尾部含有一段 EIYVNY 基序， 可作为非受体型蛋白酪氨酸激酶的底物， 并可以和蛋白 酪氨酸激酶 2 氨基端的 SH2 结构域结合。另外， 在 CD226 胞浆区还存在着酪氨酸激酶 II 和 PKC 作用的底物 S/T 结构。CD226 主要表达于活化的 T 细胞、 NK 细胞、 巨核 / 血小板谱系以 及活化的血管内皮细胞。结合胞浆的上述。

10、结构和基序， 提示 CD226 分子可能参与 T 细胞、 NK 和血小板活化的信号转导过程。 0005 将 CD226 特异性单抗 Leo-A1mAb 或其 F(ab )2 片段加入 MCL 或 T 细胞培养体系中 能抑制 T 细胞向细胞毒 T 细胞分化， 且只能在 MLC 初期发挥作用。在杀伤阶段， 针对 CD226 另一功能表位的特异性单抗 DX11mAb 能在杀伤相抑制 CTL 对多种肿瘤细胞的杀伤。此外， 共聚焦显微镜观察发现 ： CD226 集中分布与 T 细胞与 APC 或靶细胞的接触面， 目前所发现的 能与 CD226 发生相互作用的分子都是与细胞骨架结构及免疫突触形成有关的分子。

11、， 这些都 提示 CD226 参与了 T 细胞免疫突触的形成。而且研究还发现， CD226 是一种 NK 细胞活化性 膜受体， 主要表达于活化的 NK 细胞。在重导向杀伤系统中， 加入 LeoA1-mAb， 能明显提高 NK 细胞对靶细胞的杀伤率。 0006 rs57613010 是位于第 18 号染色体 CD226 基因启动子区域的一个 T G 多态。其 说 明 书 CN 102660643 A 3 2/5 页 4 在世界人群的频率分布， T 占 0.62， G 占 0.38 左右。中国人群的分布 T 占 0.45， G 占 0.25 左右。分子生物学研究表明， T G 的替代可增加 CD2。

12、26 基因启动子与核蛋白的结合， 增加 CD226 基因的表达。通过大规模人群的胃癌病例对照研究， CD226 基因启动子区域的 T G 多态与胃癌发生相关， 并且呈基因剂量 - 反应关系。即使在调整年龄、 性别、 吸烟、 肿瘤家族 史等多种混杂因素后， 这种相关性仍然存在。发明人的研究还显示 rs57613010 与散发性肠 癌及鼻咽癌的发生相关， 均表现为 rs57613010 基因型为 G 时肿瘤发生率降低。这个 SNP 的 多态可用于评估个体胃癌的易感性。 发明内容 0007 本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述不足， 提供一种通过 CD226 基因检 测胃癌易感性的试剂盒及其用途。

13、， 其通过检测丝裂原活化蛋白激酶激酶 4(CD226) 的单核 苷酸多态性 (SNP) 位点来预测胃癌的易感性。 0008 按照本发明提供的技术方案 ： 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 包 括盒体和装于盒体内的物质， 其特征在于 ： 所述盒体内的物质包括检测 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的特异性引物及特异性荧光探针、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 混合液、 MgCl2溶液、 荧光定量 PCR 反应缓冲液和去离子水 ； 0009 所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为 ： 0010 正义引物 ： 5 -AACTAGTATCTAAGG。

14、TAGACCTTGGGTAGTG-3 ， 0011 反义引物 ： 5 -CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3 ； 0012 所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针， 它们的序列为 ： 0013 野生型探针 ： 5 -CCATGCATGAGTACATA-3 ， 0014 突变型探针 ： 5 -CCATGCATCAGTACATA-3 。 0015 作为本发明的进一步改进， 所述盒体中各物质的含量为 ： 浓度为 10M 的特异性 引物共 0.45l， 其中正义引物和反义引物各 0.225l ； 浓度为 5M 的特异性荧光探针共 0.2l， 其中野生型探针和突变型探针各 0.1l ；。

15、 浓度为 5 单位 /l 的 Taq DNA 聚合酶 0.02l ； 浓度为 20mM 的 dNTP 混合液 0.1l ； 浓度为 25mM 的 MgCl2溶液 0.5l ； 5X 荧光 定量 PCR 反应缓冲液 2l ； 去离子水 4.73l。 0016 作为本发明的进一步改进， 所述特异性引物中， 正义引物的 Tm 值为 60， 反义引 物的 Tm 值为 58 ； 所述特异性荧光探针中， 野生型探针的 Tm 值为 66， 突变型探针的 Tm 值为 67。 0017 作为本发明的进一步改进， 所述试剂盒的保存温度为 -20。 0018 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒的用途，。

16、 其物征在于 ： 所述试剂盒 用于检测 DNA 的 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的基因型。 0019 本发明与现有技术相比， 优点在于 ： 本发明的试剂盒用于检测 DNA 的 CD226 基因 上的 rs57613010 号 SNP 位点的基因型， 试剂盒盒体中的特异性引物是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而设计， 能特异性扩增出包含针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 引物 ； 试剂盒盒体中的特异性荧光探针是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而设计， 能特。

17、异性扩增出包含针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 探针 ； 本发明既适用于检测个体胃癌的易感性， 又适用于对乳腺癌、 前列腺癌及卵巢癌 说 明 书 CN 102660643 A 4 3/5 页 5 的预后检测， 更可广泛应用于医疗研究。 具体实施方式 0020 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 0021 本发明所述的通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒， 包括盒体和装于盒体内 的物质， 所述物质包括检测 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的特异性引物及特异性 荧光探针、 Taq DNA聚合酶、 dNTP混合液、。

18、 MgCl2溶液、 荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。 所述试剂盒的保存温度为 -20。 0022 所述特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为 ： 0023 正义引物 ： 5 -AACTAGTATCTAAGGTAGACCTTGGGTAGTG-3 ， 反义引物 ： 5 -CCTTCTCTCGCAGACCAAAGAC-3 ( 序列表 SEQ ID NO ： 2 所示 ) ； 所述特异性引物是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而设计， 能特异性扩增出包含针对 CD226 基因上 的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 引物 ； 其中正义引物的 Tm 。

19、值为 60， 反义引物的 Tm 值为 58。 0024 所述特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针， 它们的序列为 ： 0025 野生型探针 ： 5 -CCATGCATGAGTACATA-3 ( 序列表 SEQ ID NO ： 3 所示 )， 突变型探 针 ： 5 -CCATGCATCAGTACATA-3 ( 序列表 SEQ ID NO ： 4 所示 ) ； 所述特异性荧光探针是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而设计， 能特异性扩增出包含针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 探针 ； 其中野生型探针的 Tm 值为 66。

20、， 突变型探针的 Tm 值 为 67。 0026 所述 Taq DNA 聚合酶、 dNTP( 脱氧核糖核苷三磷酸 ) 混合液、 MgCl2溶液、 荧光定量 PCR 反应缓冲液和去离子水， 均采用外购的常规标注产品， 本发明实施例中， 上述药品及试 剂均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司。 0027 本发明中， 所述盒体(供一人份使用)中各物质的含量如下 ： 浓度为10M的特异 性引物共 0.45l， 其中正义引物和反义引物各 0.225l ； 浓度为 5M 的特异性荧光探针 共 0.2l， 其中野生型探针和突变型探针各 0.1l ； 浓度为 5 单位 /l 的 Taq DNA 聚合酶 0.。

21、02l ； 浓度为 20mM 的 dNTP 混合液 0.1l ； 浓度为 25mM 的 MgCl2溶液 0.5l ； 5X 荧光 定量 PCR 反应缓冲液 2l ； 去离子水 4.73l。 0028 本发明中所述的特异性引物是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而设 计， 能特异性扩增出包含针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 引物 ； 所述特 异性引物的设计与合成均采用常规的技术， 可以理解的是， 本发明的保护范围并不限于序 列表 SEQ ID NO ： 1 和 2 所示的引物。对于本领域的普通技术人员来说， 利用本发明所。

22、给予 的技术启示设计出来的所有可用于荧光定量 PCR 检测 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的引物均在本发明范围内。 0029 本发明所述的特异性荧光探针是针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点而 设计， 能特异性扩增出包含针对 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点的 DNA 探针。所述 特异性荧光探针的设计与合成均采用常规的技术， 可以理解的是， 本发明的保护范围并不 限于序列表SEQ ID NO ： 3和4所示的荧光探针。 对于本领域的普通技术人员来说， 利用本发 明所给予的技术启示设计出来的所有可用于荧光定量。

23、PCR检测CD226基因上的rs57613010 说 明 书 CN 102660643 A 5 4/5 页 6 号 SNP 位点的荧光探针均在本发明范围内。 0030 试剂盒使用说明 ： 0031 步骤 1 ： DNA 模板的提取 0032 用硅胶吸附法提取血液标本的基因组 DNA ； 0033 步骤 2 ： 荧光定量 PCR 反应 0034 荧光定量 PCR 反应体系总体积为 10l， 包括 ： 浓度为 20ng/l 的 DNA 模板 2l、 浓度为 10M 的特异性引物共 0.45l， 其中正义引物和反义引物各 0.225l ； 浓度为 5M 的特异性荧光探针共 0.2l， 其中野生型探针。

24、和突变型探针各 0.1l ； 浓度为 5 单位 /l的Taq DNA聚合酶0.02l ； 浓度为20mM的dNTP混合液0.1l ； 浓度为25mM的MgCl2 溶液 0.5l ； 5X 荧光定量 PCR 反应缓冲液 2l ； 去离子水 4.73l。 0035 在 ABI 7900HT 型荧光定量 PCR 仪上进行反应， 反应条件为 ： 50下 2min， 95下 10min， 再进行 40 55 个 PCR 循环 (92下 15s， 60下 1min)， 反应结束后在 ABI 7900HT 型荧光定量 PCR 仪读取荧光量。 0036 步骤 3 ： 基因型分析及确定基因型 0037 采用 A。

25、BI 7900HT 型荧光定量 PCR 仪自带软件 SDS(Sequence DetectionSystems) V2.3 判读基因型， 自动分析结果。被检测 DNA 的 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点携 带有 T 时， 为胃癌易感型。 0038 本发明可以指导人们主动预防胃癌， 先对被检测者进行服务前咨询， 由被检测者 签署知情同意书， 填写生活饮食习惯问卷表。常规方法抽取被检测者 EDTA 抗凝血 5ml。用 硅胶吸附法提取血液标本的基因组 DNA。再使用本发明提供的试剂盒， 对被检测者 DNA 的 CD226 基因上的 rs57613010 号 SNP 位点。

26、进行荧光定量 PCR 检测， 确定该位点的基因型。最 后通过对被检测者基因型的分析， 出具基因分型检测报告和对被检测者个体化健康指导报 告。基因分型检测报告详细说明了被检测者胃癌易感程度的高低以及患病概率大小。个体 化健康指导报告以被检测者的基因分型检测结果为基础， 结合其生活饮食习惯问卷调查结 果， 评估被检测这胃癌遗传易感的相对风险。同时制定出针对被检测者的个性化健康行动 方案， 包括在饮食习惯、 生活方式生活的改进建议等， 并为被检测者普及预防胃癌的健康知 识。 0039 序列表 0040 无锡市第三人民医院 0041 一种通过 CD226 基因检测胃癌易感性的试剂盒及其用途 0042 。

27、4 0043 SEQ ID NO ： 1 0044 31 0045 DNA 0046 人工序列 0047 正义引物 0048 1 0049 aactagtatc taaggtagac cttgggtagt g 31 0050 SEQ ID NO ： 2 说 明 书 CN 102660643 A 6 5/5 页 7 0051 22 0052 DNA 0053 人工序列 0054 正义引物 0055 2 0056 ccttctctcg cagaccaaag ac 22 0057 SEQ ID NO ： 3 0058 17 0059 DNA 0060 人工序列 0061 野生型探针 0062 3 0063 ccatgcatga gtacata 17 0064 SEQ ID NO ： 4 0065 17 0066 DNA 0067 人工序列 0068 突变型探针 0069 4 0070 ccatgcatca gtacata 17 说 明 书 CN 102660643 A 7 。