技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种产油酵母脂肪酸合酶及其基因与应用。具体 地，所述产油酵母脂肪酸合酶以及编码其的核苷酸来源于禾本红酵母(Rhodotorula graminis)。本发明还提供一种构建油脂生产重组细胞的方法。
背景技术
油脂是一种氧含量低、能量密度高、碳链长度适中的可再生资源，可以代替化石资 源作为化学工业和可再生能源产业的基本加工原料，是人类从碳氢经济向碳氢氧经济过渡 的重要链接，其市场潜力巨大。自然界中一部分微生物在特定条件下(如氮源缺乏)能在胞 内贮存超过其细胞干重20％的油脂，其中以甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)为主，具有这 种表型的微生物称为产油微生物，包括细菌、酵母、霉菌、藻类等，其中产油酵母包括 Rhodotorula，Candida，Cryptococcus，Rhizopus，Trichosporon和Yarrowia属中的某些菌 株[RatledgeC，WynnJP.AdvApplMicrobiol2002，51，1-51]。利用微生物转化生物质资 源生产油脂，可发展成基本不依赖耕地、可连续生产、降低农业污染、资源综合利用的新技 术，形成化学品的石化资源替代品生产新途径[赵宗保.中国生物工程杂志2005，25(2)，8- 11]。
半个世纪以来，国内外微生物油脂研究的重点集中在菌株筛选、驯化和发酵工艺 优化等领域，取得了重大进展。随着生物技术的快速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优 化已不能满足产油微生物性状改良的需要。做为某一化学品的天然生产菌株，其特定的生 产性能往往并非最优。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物 基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。油 脂发酵研究需要油脂代谢途径的重构和强化，赋予重组菌株生产新型脂肪酸衍生物的性 能。由于优良土著生产菌株的遗传背景目前仍不清楚，油脂积累代谢调控相关基因克隆有 限，寻找更多的油脂积累代谢调控相关基因，是目前微生物油脂研究的重要方向之一。
研究人员发现，来源于产油微生物(圆红冬孢酵母和斯氏油脂酵母)的异柠檬酸脱 氢酶(IDH)和苹果酸酶(ME)的编码基因在土著菌油脂积累过程中有表达差异，酿酒酵母功 能互补分析也证明这些基因可增加重组菌株的油脂含量，但并没能将一个非产油菌株成功 改造成一个产油菌株[YangF，ZhangSF，ZhouYJ，ZhuZW，LinXP，Zhao ZK.Appl.Microbiol.Biotechnol.2012，94(4)，1095-1105]。实验结果暗示，微生物油脂积 累代谢调控可能涉及更多的基因及其间的相互调节和相互作用。
从乙酰CoA和丙二酸单酰CoA从头合成短链和中长链饱和脂肪酸，需要一系列的克 莱森缩合反应并脱羧，是由几种酶活介导催化的复杂过程。在大多数细菌和植物中，这些酶 活性是由离散的单功能多肽组成的酶系来完成(脂肪酸合酶类型II)；而在哺乳动物和真菌 中，这些酶活性则由一个或两个多功能多肽组成的寡聚酶来行使(脂肪酸合酶类型I)。在脂 肪酸合成过程中，底物和中间产物分子在各个功能结构域(可以位于同一酶分子，也可以位 于不同酶分子)中传递直到完成脂肪酸的整个合成过程[StoopsJK，ArslanianMJ，OhYH， AuneKC，VanamanTC，WakilSJ.ProcNatlAcadSciUSA.1975，72(5)，1940-1944]。
哺乳动物中的脂肪酸合酶(FattyAcidSynthase，FAS)是一个同源二聚体，含有 两个相同的多功能亚基(亚基分子量为272kDa)，每一个亚基的N端区域含有三个催化结构 域：酮酯-酰基ACP合酶(ketoacylsynthase，KS)、单酰/乙酰转移酶(acyltransferase，AT) 和脱水酶(dehydratase，DH)，C端区域则含有四个结构域：烯酰ACP还原酶(enoyl reductase，ER)、酮脂酰还原酶(ketoacylreductase，KR)、酰基载体蛋白(acylcarrier protein，ACP)和硫酯酶(thioesterase，TE)；这两个区域被中间600个氨基酸残基组成的核 心区域所分隔。在子囊菌门酵母中，ACP和其它6个酶活性结构域分别定位于两个不同亚基 上，其一具有ACP、KR、KS和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase，PPT)结构域，另一亚基则含有AT、ER、DH和丙二酰/棕榈酰转移酶(malonyl/ palmitoyltransferase，MPT)结构域。
最近，我们在禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)中发现一种新颖的脂肪酸合 酶，该酶与别的真菌中存在的脂肪酸合酶的不同在于，其beta亚基(FAS1)只含有AT(单酰/ 乙酰转移酶)结构域和ER(烯酰ACP还原酶)结构域，而其余的结构域均在alpha亚基(FAS2) 上；同时，该脂肪酸合酶上存在两个前后串联的ACP结构域。截止专利提交日，NCBI上未检索 到关于禾本红酵母(R.graminis)脂肪酸合酶的任何序列信息。
发明内容
本发明的目的是提供一种产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因与应用。
本发明提供的产油酵母脂肪酸合酶，名称缩写为RgrFAS(R.graminisFattyAcid Synthase)，来源于禾本红酵母(R.graminis)JCM8242，所述产油酵母脂肪酸合酶由RgrFAS1 亚基和RgrFAS2亚基组成，其中所述RgrFAS1亚基是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQIDNO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加 且与具有脂肪酸合酶亚基1功能的由SEQIDNO：1所衍生的蛋白质；
所述RgrFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质：
(c)由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)将SEQIDNO：2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加 且与具有脂肪酸合酶亚基2功能的由SEQIDNO：2所衍生的蛋白质。
其中所述“脂肪酸合酶亚基1功能”具体是指单酰/乙酰转移酶(AT)活性和烯酰ACP 还原酶(ER)活性的加合；其中所述“脂肪酸合酶亚基2功能”具体是指脱水酶(DH)活性、丙二 酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、 酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT) 活性的加合。
本发明还涉及产油酵母脂肪酸合酶(RgrFAS)的生物活性多肽片段(在本文中，也 称为结构域)，其氨基酸序列为选自如下片段中的任何一个或者任意两个或更多个片段的 组合：
SEQIDNO：1的位置191-600(其具有单酰/乙酰转移酶(AT)活性)，
SEQIDNO：1的位置612-1143(其具有烯酰ACP还原酶(ER)活性)，
SEQIDNO：2的位置58-488(其具有脱水酶(DH)活性)，
SEQIDNO：2的位置491-883(其具有丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性)，
SEQIDNO：2的位置1022-1187(其具有第一酰基载体蛋白(ACP)活性)，
SEQIDNO：2的位置1214-1380(其具有第二酰基载体蛋白(ACP)活性)，
SEQIDNO：2的位置1727-1985(其具有酮脂酰还原酶(KR)活性)，
SEQIDNO：2的位置2068-2714(其具有酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性)，和
SEQIDNO：2的位置2815-2926(其具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性)。
所述的RgrFAS的生物活性多肽片段(结构域)，其生物活性选自单酰/乙酰转移酶 (AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)活性、第 一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮脂酰还原酶(KR)活性、酮酯- 酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活性中的任一种或者任两种或 更多种的组合。
在基因工程生产该脂肪酸合酶用于体外合成脂肪酸及其衍生物方面，为了使所述 的RgrFAS1亚基和(/或)RgrFAS2亚基分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在所 述RgrFAS1亚基和(/或)RgrFAS2亚基的氨基端连接上信号肽序列；为了使RgrFAS蛋白或其 亚基或其生物活性多肽片段(结构域)便于纯化，可在RgrFAS1亚基或RgrFAS2亚基或其生物 活性多肽片段(结构域)的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签或GST标签(谷胱甘 肽S-转移酶标签)。
表1标签及其序列
标签 氨基酸残基个数 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR FLAG 8 DYKDDDDK
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH C-myc 10 EQKLISEEDL Strep-tag II 8 WSHPQFEK Poly-Phe 11 FFFFFFFFFFF
上述加标签重组RgrFAS蛋白或其生物活性多肽片段(结构域)可人工合成，也可先 合成其编码基因，再进行常规蛋白质表达得到。上述加标签重组RgrFAS蛋白或其生物活性 多肽片段(结构域)的编码基因可能通过将SEQIDNOs：3-13任何一项所示的DNA序列中缺 失1个或几个编码氨基酸的密码子，和/或进行1个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’ 端和3’端连上表1所示的标签的编码序列而获得。
所述产油酵母脂肪酸合酶两个亚基RgrFAS1和RgrFAS2的编码核苷酸序列(例如， RgrFAS1和RgrFAS2)也属于本发明的保护范围。
因此，本发明还提供一种编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
优选地，所述RgrFAS蛋白的编码核苷酸序列为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的 DNA分子。
此外，所述RgrFAS的生物活性多肽片段(结构域)的编码核苷酸序列也属于本发明 的保护范围。
优选地，所述RgrFAS的生物活性多肽片段(结构域)的编码核苷酸序列为SEQID NOs：5-13所示的DNA分子。
并且，含有本发明所述的核苷酸序列的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重 组菌株均属于本发明的保护范围。
因此，本发明还提供包含编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的表达 盒或重组载体，优选是重组表达载体；提供导入了(例如，通过转化或转染技术导入)所述重 组载体的重组细胞。
本领域技术人员应该理解，将编码产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或包含编码 产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列的重组载体导入宿主细胞可以按照本领域的常规技术 进行，例如，可以通过转化、转染(例如，农杆菌介导的转染)或电穿孔等常规技术进行。
可用现有的担子菌表达载体和酿酒酵母表达载体构建含有所述编码核苷酸序列 (例如，RgrFAS1和/或RgrFAS2，RgrFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列)的重组 表达载体。
所述的担子菌表达载体包括根瘤农杆菌介导的基因重组载体和可用于担子菌微 弹轰击的载体等。所述的担子菌表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚 腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可以引导 聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基 因)、禾本红酵母基因(如R.graminis的G3PDH基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。 所述的酿酒酵母表达载体包括酿酒酵母游离型表达载体(携带2μm复制子或自主复制序列 (ARS)，如pYX212、pYES2C/T等可自行购买的现有通用载体)和整合型表达载体(携带整合位 点基因重组臂)。
使用RgrFAS1和/或RgrFAS2或RgrFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列 构建重组酵母表达载体时，在其起始核苷酸前可以加上任何一种诱导型启动子或组成型启 动子，如三磷酸甘油醛脱氢酶启动子pG3PDH、半乳糖诱导启动子pGal10，启动子可单独使用 或与其它启动子结合使用。
本领域技术人员应该理解，为了便于编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸 序列在宿主细胞中的表达，取决于所选用的宿主细胞品系，可以适当地对所述核苷酸序列 进行密码子优化；为了便于对转基因细胞系或重组菌株进行鉴定及筛选，可对所用载体进 行修饰，如引入可以在酵母细胞中表达的编码产生颜色变化的酶(如绿色荧光蛋白)或发光 化合物的基因(如GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记基因(如卡那霉素标 记基因、博莱霉素标记基因、潮霉素标记基因)或抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)、 以及营养筛选标记基因(如LEU2、URA3)等；为了便于纯化，可以在所述核苷酸序列的5’端 和/或3’端连接纯化标签的编码序列。
本发明的另一个目的是提供一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将 编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段导入宿主细胞中，得到油脂 生产重组细胞，或者将包含编码本发明的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列或其活性片段 的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细胞。其中所述宿主细胞优 选酵母细胞。
利用任何一种可以启动外源基因在酿酒酵母中表达的载体，将本发明所提供的 RgrFAS1和/或RgrFAS2或RgrFAS生物活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列导入酵母细胞 中，得到油脂生产重组酵母细胞。在一个优选的实施方案中，利用任何一种可以启动外源基 因在禾本红酵母中表达的载体，增加本发明所提供的RgrFAS1和/或RgrFAS2或RgrFAS生物 活性多肽片段(结构域)编码核苷酸序列的拷贝数，得到重组禾本红酵母。
实验证明，本发明提供的产油酵母脂肪酸合酶及其编码基因可显著提高重组细胞 的油脂含量。
综上所述，本发明提供下述：
1.一种产油酵母脂肪酸合酶，其由RgrFAS1亚基和RgrFAS2亚基组成，其中所述 RgrFAS1亚基是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQIDNO：1的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加 且与具有脂肪酸合酶亚基1(RgrFAS1)功能的由SEQIDNO：1所衍生的蛋白质；
所述RgrFAS2亚基是如下(c)或(d)的蛋白质：
(c)由SEQIDNO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)将SEQIDNO：2的氨基酸经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加 且与具有脂肪酸合酶亚基2(RgrFAS2)功能的由SEQIDNO：2所衍生的蛋白质。
2.根据第1项所述的产油酵母脂肪酸合酶，其中所述RgrFAS1亚基的氨基酸序列为 SEQIDNO：1，所述RgrFAS2亚基的氨基酸序列为SEQIDNO：2。
3.一种来源于第1项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域， 所述多肽片段或结构域的氨基酸序列为选自如下片段中的任意一个或者任意两个或更多 个片段的组合：
SEQIDNO：1的位置191-600，
SEQIDNO：1的位置612-1143，
SEQIDNO：2的位置58-488，
SEQIDNO：2的位置491-883，
SEQIDNO：2的位置1022-1187，
SEQIDNO：2的位置1214-1380，
SEQIDNO：2的位置1727-1985，
SEQIDNO：2的位置2068-2714，和
SEQIDNO：2的位置2815-2926。
4.根据第3项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域，其生物 活性选自单酰/乙酰转移酶(AT)活性、烯酰ACP还原酶(ER)活性、脱水酶(DH)活性、丙二酰/ 棕榈酰转移酶(MPT)活性、第一酰基载体蛋白(ACP)活性、第二酰基载体蛋白(ACP)活性、酮 脂酰还原酶(KR)活性、酮酯-酰基ACP合酶(KS)活性或磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)活 性中的任一种或者任两种或更多种的组合。
5.编码第1项所述的产油酵母脂肪酸合酶的核苷酸序列。
6.根据第5项所述的核苷酸序列，其中编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RgrFAS1亚 基的核苷酸序列为SEQIDNO：3；编码所述产油酵母脂肪酸合酶的RgrFAS2亚基的核苷酸序 列为SEQIDNO：4。
7.编码第3项所述的产油酵母脂肪酸合酶的生物活性多肽片段或结构域的核苷酸 序列，其选自如下核苷酸序列中的任意一个或者任意两个或更多个序列的组合：
(a)如SEQIDNO：5所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS1亚基的AT结构域；
(b)如SEQIDNO：6所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS1亚基的ER结构域；
(c)如SEQIDNO：7所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的DH结构域；
(d)如SEQIDNO：8所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的MPT结构域；
(e)如SEQIDNO：9所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的第一ACP结构域；
(f)如SEQIDNO：10所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的第二ACP结构域；
(g)如SEQIDNO：11所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的KR结构域；
(h)如SEQIDNO：12所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的KS结构域；
(i)如SEQIDNO：13所示的核苷酸序列，其编码RgrFAS2亚基的PPT结构域。
8.含有第5-7项中任何一项所述的核苷酸序列的表达盒或重组表达载体。
9.含有第5-7项中任何一项所述的核苷酸序列的细胞。
10.一种构建油脂生产重组细胞的方法，所述方法包括将第3-7项中任何一项所述 的核苷酸序列或者第8项的表达盒或重组表达载体导入宿主细胞中，得到油脂生产重组细 胞。
附图说明
图1为RgrFAS与其它特种来源FAS的结构域组成比较分析图。
图2为RgrFAS1和RgrFAS2基因RT-PCR扩增结果，泳道1，RgrFAS2；泳道2，RgrFAS1。 扩增条带碱基长度分别为8.8kb和3.8kb。
图3为构建的RgrFAS原核表达质粒pACYC-RgrFAS1+2的图谱。
图4为RgrFAS原核表达产物的SDS-PAGE分析。M：蛋白分子量标准；C：诱导菌体全细 胞；S：诱导菌体裂解液上清；P：诱导菌体裂解液沉淀。
图5为RgrFAS的PPT结构域和ACP结构域原核表达产物Ni柱亲和纯化后的SDS-PAGE 分析。
图6为PPT结构域催化酰基载体蛋白(ACP)发生4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的 Tricine-SDS-PAGE分析。纯化的GST-PPT可以催化GST-ACP发生4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰， 由于ACP被修饰后分子量增加340Dalton，通过Tricine-SDS-PAGE可以在16％聚丙烯酰胺凝 胶上分离Apo-ACP和Holo-ACP。图6A为GST-ACP1，图6B为GST-ACP2。
图7是RgrFAS的酵母表达载体构建的模块组装策略示意图。
图8是RgrFAS酵母表达质粒图谱。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但并不限定并本明。本发明的范围由权利要 求及其等价体限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实 验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
禾本红酵母(R.graminis)ATCCMYA-4893：美国标准生物品收藏中心(ATCC)，分离 自美国华盛顿ThreeForksPark的毛果杨(Populustrichocarpa)茎部，由FGSC提交至 ATCC，等同于R.graminisWP1或FGSC10291。
禾本红酵母(R.graminis)ATCC28135：购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，分离 自法国六行大麦(Hordeumhexastichon)的大麦叶，由H.G.Diem提交至荷兰微生物菌种保 藏中心(CentraalbureauvoorSchimmelcultures，CBS)，后转存于ATCC。该菌株等同于 CBS6403或ATCC96593或CCY29-133-1或IFO10412或JCM3932或MUCL30689或NRRLY-17366或 VKMY-2420。
禾本红酵母(R.graminis)ATCC32768：购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，分离 自新西兰牧场的草株上，由M.E.diMenna提交至荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)，后转存于 ATCC。该菌株等同于CBS2826或IGC4842或JCM3775或MUCL30431或NCYC502或NRRLY-2474。
以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下：
(1)YEPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，葡萄糖20g/L，pH6.0，固体培养基则 再加入琼脂粉15g/L；用于菌种活化培养、种子液制备和菌种短期保藏。
(2)限氮培养基：葡萄糖70g/L，酵母粉0.75g/L，(NH4)2SO40.1g/L，KH2PO41.0g/L， MgSO4·7H2O1.5g/L，pH5.6，并补加1％(V/V)的痕量元素液体(4.0g/LCaCl2·2H2O，0.55g/ LFeSO4·7H2O，0.52g/Lcitricacid·H2O，0.10g/LZnSO4·7H2O，0.076g/LMnSO4·H2O 和100μl18MH2SO4)，用于菌株油脂积累和富含油脂菌体的培养。
(3)非限氮人工合成培养基(简写为MM)：葡萄糖25g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4· 7H2O0.5g/L，KH2PO43g/L)，用于禾本红酵母的富营养恒化培养以及差异转录组学分析菌体 样品的制备。
(4)限氮人工合培养基(简称MM-N)：葡萄糖25g/L，(NH4)2SO40.2g/L，MgSO4· 7H2O0.5g/L，KH2PO43g/L，K2SO46.3g/l，用于禾本红酵母的限氮恒化培养以及差异转录组学 分析菌体样品的制备。
实施例1：禾本红酵母脂肪酸合酶的发现
R.graminisATCCMYA-4893于YEPD固体培养基上复苏，30℃倒置培养48h，挑单菌 落接种于50mlYEPD液体培养基(装液于250ml容量的三角瓶)，30℃，200rpm培养28h。培养 液分别以1∶50(V/V)比例转接于自动补料的2L连续发酵罐(工作体积1.7L)，培养基分别为 MM和MM-N。恒化培养温度为30℃，pH通过滴加10.0MNaOH或2MHCl自动控制在5.6，转速保 持为600rpm，通气速率为100L/h(约0.98VVM)，溶氧保持为85％饱和，稀释率为0.085。约10 个工作体积后取样，样品经4℃，8000rpm离心5min收集，每45ml培养物能收集到约0.7g湿菌 体，MM和MM-N菌体样品均立即于液氮中速冻，-70℃保存。干冰低温保存运输至华大基因(全 名：北京六合华大基因科技股份有限公司深圳分公司)进行R.graminis在限氮和非限氮培 养条件下的转录组测序。留取同批菌体样品进行胞内油脂含量分析，培养上清用于残氮分 析[沈宏伟，靳国杰，胡翠敏，龚志伟，白凤武，赵宗保.生物工程学报2012，28(1)，57-65]。
采用液氮研磨-RNAiso法提取总RNA，使用Agilent2100Bioanalyzer检测样品完整 性合格后再进行下一步制作。RNA-seq样品制备使用mRNA-Seq8SamplePreparationKit (Illumina，SanDiego，CAUSA)，具体步骤参考产品使用说明。简单来说，至少10ug的总 RNA，经DNaseI(RNasefree)消化后经oligo(dT)磁珠纯化得到mRNA，mRNA使用二价阳离子 Buffer进行随机片段化处理后，随机六聚体引物逆转录合成第一链cDNA，使用RNaseH和 DNApolymeraseI合成第二链cDNA，末端修复和加A处理后连上接头序列，2％的Agarose gel回收300bp的片段，15个循环的PCR放大连接产物，PCR产物经Agilent2100Bioanalyzer 验证浓度大于0.34nM，总量大于3.23pmol，且文库插入片段长度范围在200±10％范围内。 样品经IlluminaHiSeq2000测序得到90bp的双末端序列。所获得的序列信息，使用SOAP denovo软件进行从头的拼装得到Unigene序列，再对这些Unigene进行功能的注释[LiR， ZhuH，RuanJ，QianW，FangX，ShiZ，LiY，LiS，ShanG，KristiansenK，LiS，YangH， WangJ，WangJ.GenomeRes.2010，20(2)，265-272.]。MM-N样品进行RNA-seq获得的序列信 息，使用SOAPdenovo软件进行从头拼装共得到280条完整的Unigene序列，其中大于3000bp 的Unigene序列有2条，根据所推测出的氨基酸序列信息进行Blastp分析，发现这两条 Unigene所编码的蛋白质分别与LaccariabicolorS238N-H82来源的脂肪酸合酶Beta亚基 和alpha亚基同源性为55％和62％。将这两条Unigene所编码的蛋白质分别命名为禾本红酵 母脂肪酸合酶亚基1(RgrFAS1)和禾本红酵母脂肪酸合酶亚基2(RgrFAS2)。
RgrFAS1由1268个氨基酸残基组成，分子量137kDa，理论等电点为6.09；没有信号 肽标识，为胞内酶；归属于酵母脂肪酸合酶[EC2.3.1.86]；RgrFAS1结构域组成和子囊酵母 脂肪酸合酶相差较大，仅含单酰/乙酰转移酶(AT)、烯酰ACP还原酶(ER)两个结构域，而子囊 酵母脂肪酸合酶还携带有脱水酶(DH)和丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)结构域(图1)。
RgrFAS2由2930个氨基酸残基组成，分子量317kDa；理论等电点为6.41；没有信号 肽标识，为胞内酶；归属于酵母脂肪酸合酶[EC2.3.1.86]；RgrFAS2结构域组成和子囊酵母 脂肪酸合酶相差较大，除含有酮脂酰还原酶(KR)、酮酯-酰基ACP合酶(KS)和磷酸泛酰巯基 乙胺基转移酶(PPT)等典型酵母脂肪酸合酶alpha亚基的共有结构域外，还携带有脱水酶 (DH)、丙二酰/棕榈酰转移酶(MPT)、以及前后串联的第一酰基载体蛋白(ACP)和第二酰基载 体蛋白(ACP)结构域，前两个结构域在其它酵母脂肪酸合酶的beta亚基上，前后串联的双 ACP结构域(2×ACP)则为RgrFAS2所特有的(图1)。
将RgrFAS1和RgrFAS2的编码基因分别命名为rgrfas1和rgrfas2，rgrfas1的mRNA 序列如SEQIDNO：3所示，rgrfas2的mRNA序列如SEQIDNO：4所示。
实施例2：禾本红酵母rgrfas1和rgrfas2基因的克隆
根据rgrfas1和rgrfas2的核苷酸序列设计基因特异性引物如下：
rgrfas1-Fw：atgaacggtcaccacacccgtgccggcacc
rgrfas1-Rv：tcactggatcgccgagaagacgtcgagctt
rgrfas2-Fw：atggcggccgaccttccgctcgcgctgagc
rgrfas2-Rv：ctacgagcgagcgatgacgacggcgacggc
利用液氮研磨加RNaiso方法[YangF，TanHD，ZhouYJ，LinXP， ZhangSF.Mol.Biotechnol.2010，47(2)：144-151]提取R.toruloidesCGMCC2.1389总RNA。 RNA进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫 外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD260/OD280＝1.9，表明总RNA质量很好。总RNA样品 冻存于-80℃备用。
利用HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit(购自Takara)合成cDNA第一链。20 μl反应体系，首先，将2μl总RNA(～1μg)，Oligo(dT)和Random6mer)各100nM，2.0μlDEPC处 理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连TaKaRa公司)，加入到PCR管中混匀，于65℃保温5min， 立即置于冰上冷却2min，加入酶Mix(HighFidelityPrimeScriptRT-PCRKit自带反转录 酶，购自Takara)，DEPC处理水补齐20μl，42℃30min进行反转录，70℃15min灭活酶。
以反转录合成的cDNA第一链为模板，进行rgrfas1和rgrfas2基因的PCR扩增，5× PCR缓冲液(TakaRa)10.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa)1.0μl，引物rgrfas1-Fw(/rgrfas2-Fw) (50mM)和rgrfas1-Rv(/rgrfas2-Rv)(50mM)各1.0μl，PrimeSTar(大连TakaRa)0.5μl，合成 的cDNA第一链模板1.0μl，ddH2O补齐至50μl，于94℃保温3min，然后于98℃10s，68℃5min (用于扩增rgrfas1)或9min(用于扩增rgrfas2)，30个循环，之后再加入TaqDNA聚合酶 (TakaRa)1.0μl进行扩增产物的3’末端加A，72℃20min，4℃结束反应。扩增产物进行0.8％ (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，可观察到3.8kb(rgrfas1)和8.8kb(rgrfas2)左右的两 条预期大小的条带(图2)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供 应商建议步骤(NEP013-2说明书)纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法(D102A 说明书)克隆到pMD19-T载体，转化入E.coliDH5α感受态细胞，挑选Amp抗性转化子进行增 菌培养、质粒提取(碧云天质粒小量提取试剂盒，货号：D0003)。重组质粒样品送至TaKaRa公 司测序，测序结果表明，所扩增到的核苷酸序列分别为SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，分别编 码氨基酸序列为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的蛋白质。将SEQIDNO：1所示的蛋白命名为 RgrFAS1，将克隆得到的SEQIDNO：3所示的核苷酸命名为rgrfas1；将SEQIDNO：2所示的 蛋白命名为RgrFAS2，将克隆得到的SEQIDNO：4所示的核苷酸命名为rgrfas2。阳性重组质 粒分别命名为pMD19T-RgrFAS1和pMD19T-RgrFAS2。
RgrFAS1结构域组成和子囊酵母脂肪酸合酶beta亚基相差较大，仅含AT和ER两个 结构域，而子囊酵母脂肪酸合酶还携带有DH和MPT结构域(图1)。RgrFAS2的结构域组成和子 囊酵母脂肪酸合酶alpha亚基相差较大，除含KR)、KS和PPT等典型酵母脂肪酸合酶alpha亚 基的共有结构域外，还携带有DH、MPT、以及前后串联的第一酰基载体蛋白(ACP)和第二酰基 载体蛋白(ACP)结构域，这种前后串联的双ACP结构域(2×ACP)为RgrFAS2所特有的(图1)。
实施例3：禾本红酵母脂肪酸合酶的原核表达、蛋白纯化以及重组菌株产油性能分 析
根据rgrfas1核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物rgrfas1-NcoI-F的下 划线部分为NcoI酶切位点，引物rgrfas1-HindIII-R的下划线部分为HindIII酶切位点)，序 列如下：
rgrfas1-NcoI-F：ctctccatggatgaacggtcaccacacccgtgccggcacc
rgrfas1-HindIII-R：tctaagctttcactggatcgccgagaagacgtcgagctt
根据rgrfas2核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物rgrfas2-NdeI-F的下 划线部分为NdeI酶切位点，引物rgrfas2-AvrII-R的下划线部分为AvrII酶切位点)，序列如 下：
rgrfas2-NdeI-F：ctctcatatggcggccgaccttccgctcgcgctgagc
rgrfas2-AvrII-R：tctcctaggctacgagcgagcgatgacgacggcgacggc
以先前构建的克隆载体pMD19T-RgrFAS1和pMD19T-RgrFAS2为模板，利用两对引物 rgrfas1-NcoI-F/rgrfas1-HindIII-R和rgrfas2-NdeI-F/rgrfas2-AvrII-R分别扩增 rgrfas1和rgrfas2编码区序列。rgrfas1的PCR扩增产物经NcoI/HindIII双酶切，连入同样 双酶切的pACYCDuet-1(双表达载体，购自Novagen)载体(回收酶切大片段用于连接)，转化 E.coliDH5a化学感受态细胞，经NcoI/HindIII双酶切和测序验证正确的重组质粒命名为 pACYC-RgrFAS1。rgrfas2的PCR扩增产物经NdeI/AvrII双酶切，连入同样NdeI/AvrII双酶切 的已构建的pACYC-RgrFAS1载体(回收酶切大片段用于连接)，转化E.coliDH5a化学感受态 细胞，经NcoI/HindIII和NdeI/AvrII酶切和测序双重验证正确的重组质粒命名为pACYC- RgrFAS1+2。(图3)。
将pACYC-RgrFAS1+2质粒转化E.coliB121(DE3)宿主，得到表达菌株BL21/pACYC- RgrFAS1+2。挑单菌落接种于10mlChl-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l， 并含氯霉素30μg/ml)，37℃培养4-6h至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG进行诱 导，30℃培养过夜。诱导表达结束后，取10ml菌液，于4℃，8000rpm离心5min收集菌体，菌体 沉淀用200μlNBP缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝8.0，0.5MNaCl，20mM咪唑，1mM beta-巯基乙醇，1mMPMSF)中，利用超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超细探头，功率为 60W，脉冲2s，间歇2s，总时间1min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心10min，取上清为可溶 性蛋白部分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(10％ 丙烯酰胺凝胶)。结果如图4所示，0.1mMIPTG诱导条件下，重组RgrFAS的两个亚基RgrFAS1 和RgrFAS2几乎完全可溶表达，重组RgrFAS1的分子量大约为138kDa(RgrFAS1理论分子量为 137kDa，加标签(Strep-tagII)后融合蛋白分子量为138kDa)；重组RgrFAS2的分子量大约 为319kDa(RgrFAS2理论分子量为318kDa，加标签(6×His)后融合蛋白分子量为319kDa)。
重组RgrFAS2亚基携带6×HisTag，由于RgrFAS2和RgrFAS1亚基间的蛋白相互作 用，可利用镍亲和层析一步纯化重组RgrFAS2和重组RgrFAS1两个亚基。蛋白纯化过程按照 InvitrogenNi-NTApurificationsystem指导说明进行，以镍离子做为亲和离子，依靠咪 唑浓度梯度(30-100mM咪唑)洗脱目的蛋白。BL21/pACYC-RgrFAS1+2进行1000ml体积诱导表 达(1000mlChl-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，NaCl10g/l，并含氯霉素30μg/ml)， 37℃培养4-6h至OD为0.5-0.8，加入终浓度为1mMIPTG进行诱导，30℃培养过夜)，离心收集 菌体，加入50mlNBP缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝8.0，0.5MNaCl，20mM咪唑，1mM beta-巯基乙醇，1mMPMSF)中，超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，功率为60W，脉冲2s，间歇 3s，总时间30min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22μ m低蛋白结合的滤膜过滤后，上样至镍亲和层析柱(体积10ml)，静置结合15min，然后依次用 20倍柱体积的含20mM、40mM、60mM和80mM咪唑的洗涤缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝ 8.0，0.5MNaCl，1mMbeta-巯基乙醇，相应浓度的咪唑)依次洗涤，最后用含250mM咪唑的洗 脱缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝8.0，0.5MNaCl，1mMbeta-巯基乙醇，250mM咪唑)洗 脱目的蛋白。所有纯化操作均在4℃进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白 保存于20％甘油中，分装后在-70℃保存。蛋白纯度由SDS-PAGE(10％丙烯酰胺凝胶)分析， 结果显示，洗脱组分中重组RgrFAS1亚基和RgrFAS2亚基纯度均大于90％。
将重组大肠杆菌BL21/pACYC-RgrFAS1+2接种M9-N培养基(M9限氮培养基：2％葡萄 糖，0.6％Na2HPO4，0.3％KH2PO4，0.05％NaCl，1mMMgSO4，0.1mMCaCl2，0.1％(v/v)1000×微 量元素混合液；1000×微量元素混合液成分：2.7％FeCl3·6H2O，0.2％ZnCl2·4H2O，0.2％ CaCl2·2H2O，0.2％Na2MoO4·2H2O，1.9％CuSO4·5H2O，0.5％H3BO3)，37℃，200rpm振荡培养 24h，每隔6h取样，留做油脂含量分析[RudeMA，SchirmerA.Curr.Opin.Microbiol.2009， 12，274-281]。结果发现，发酵终点时，与对照菌株BL21/pACYCDuet-1相比，BL21/pACYC- RgrFAS1+2胞内油脂含量由10％增加到19.8％，可见，胞内油脂含量提高了98％。证明 rgrfas1和rgrfas2基因共表达可促进重组大肠杆菌油脂积累，增加其胞内油脂含量。
实施例4：RgrFAS结构域PPT、ACP的原核表达和蛋白纯化
步骤一RgrFAS结构域PPT、ACP的原核表达和蛋白纯化
利用RF克隆[VandenEntF，LoweJ.J.Biochem.Biophys.Methods2006，67，67- 74；YangF，ZhangS，TangW，ZhaoZ.Yeast2008.25(9)：623-630]方法构建RgrFAS结构域 PPT、ACP的原核表达载体。根据RgrFAS的PPT结构域、ACPI结构域和ACPII结构域的编码基因 核苷酸序列设计以下RF克隆引物：
41-GST-ACPI-F：
TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGgtcgccgacgagccgctcaaggcc
41-GST-ACPI-R：
ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGgagagcgagatgccggcgaacgag
41-GST-ACPII-F：
TGGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGgtccccgacgagccgctcaaggc
41-GST-ACPII-R：
ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGgagcgacacgccggcctgcgagg
41-GST-PPT-F：
GGTGGCTCCGGTGATGACGACGACAAGacggacgtcgagctgatcagcgcc
41-GST-PPT-R：
ATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGgacgacggcgacggccgtgtcgtc
1、RFI反应：5×PrimeSTARBuffer(TakaRa)10.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa)1.0μl， ACPI引物41-GST-ACPI-F和41-GST-ACPI-R各1.0μl(或ACPII引物41-GST-ACPII-F和41- GST-ACPII-R，或PPT引物41-GST-PPT-F和41-GST-PPT-R，各1.0μl，均10mM)，PrimeSTAR (TakaRa)0.5μl，实施例3中构建的pMD19T-RgrFAS2载体作为模板(50ng/μl)2.0μl，ddH2O补 齐至50μl，于94℃保温3min，然后于98℃10s，62℃10s，72℃1min，30个循环，再72℃10min，4 ℃结束反应。扩增产物进行1.2％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到预期大小的目 的条带(ACPI和ACPII目的条带预期大小均为0.5kb左右，PPT目的条带预期大小0.33kb左 右)，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤 (NEP013-2说明书)纯化PCR产物。
2、RFII反应：模板pET41a质粒DNA(购自Novagen，100ng/μl)1μl，上述步骤1(RFI反 应)产物8μl(约600ng)，5×PrimeSTARBuffer(TaKaRa)10.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa)1.0μ l，PrimeSTAR(TakaRa)0.5μl，ddH2O补齐至50μl，于95℃预变性3min，95℃1min，55℃1min， 68℃7min，25个循环，4℃结束反应，得到约6.6kb左右的RFII产物(即，带缺口的插入目的基 因片段的重组质粒)。
3、上述步骤2(RFII反应)的PCR产物用DpnI(购自NewEnglandBiolabs)1μl于37℃ 消化1h，去除甲基化的模板质粒DNA，取5μl电击转化E.coliDH5α感受态细胞[分子克隆实 验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版]，电击转化参数：2200-2500V， 400Ω，25μF。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取和测序分析[VandenEntF， LoweJ.J.Biochem.Biophys.Methods2006，67，67-74]。正确构建的重组质粒分别命名为 pET41a-ACP1、pET41a-ACP2和pET41a-PPT。
4、将上述步骤3中构建的pET41a-ACP1、pET41a-ACP2和pET41a-PPT重组载体分别 转化E.coliBl21(DE3)感受态细胞，得到表达菌株BL21/pET41a-ACP1、BL21/pET41a-ACP2 和BL21/pET41a-PPT。分别挑单菌落接种于10mlKan-LB培养基(胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/ l，NaCl10g/l，并含卡那霉素50μg/ml)，37℃培养4-6h至OD600nm为0.6-0.8，加入终浓度为 0.1mMIPTG进行诱导，30℃培养过夜。诱导表达结束后，取1ml菌液，于4℃，8000rpm离心 5min收集菌体，菌体沉淀用200μl细菌裂解缓冲液(100mMTris-HCl，20％甘油，2mMEDTA， 1.5mMDTT，pH7.5)重悬，利用超声破碎法提取可溶性蛋白(冰浴，超细探头，功率为60W，脉 冲2s，间歇2s，总时间1min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心10min，取上清为可溶性蛋白 部分，利用等体积的裂解缓冲液重悬沉淀；利用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况(12％(M/V) 丙烯酰胺凝胶)。结果显示，0.1mMIPTG诱导条件下，携带GSTTag的RgrFAS-ACP1、RgrFAS- ACP2和RgrFAS-PPT三个重组蛋白(分别简写为GST-wACP1、GST-wACP2和GST-wPPT)几乎完全 可溶表达，分子量分别为50kDa、50kDa和45kDa(RgrFAS-ACP1、RgrFAS-ACP2和RgrFAS-PPT的 理论分子量分别为20kDa、20kDa、和15kDa，GST标签蛋白分子量为30kDa)。
5、蛋白纯化过程按照InvitrogenNi-NTApurificationsystem指导说明进行， 以镍离子做为亲和离子，依靠咪唑浓度梯度(30-100mM咪唑)洗脱目的蛋白。BL21/pET41a- ACP1、BL21/pET41a-ACP2和BL21/pET41a-PPT分别进行1000ml体积诱导表达(1000mlKan- LB培养基(含卡那霉素50μg/ml)，37℃培养4-6h至OD为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mMIPTG 进行诱导，30℃培养过夜)，离心收集菌体，加入50mlNBP缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH ＝8.0，0.5MNaCl，20mM咪唑，1mMbeta-巯基乙醇，1mMPMSF)中，超声破碎法提取可溶性蛋 白(冰浴，功率为60W，脉冲2s，间歇3s，总时间10min)，至菌液变澄清；16000×g，4℃离心 10min，取上清可溶性蛋白，利用0.22μm低蛋白结合的滤膜过滤后，上样至镍亲和层析柱(体 积5ml)，静置结合15min，然后依次用20倍柱体积的含20mM、40mM、60mM和80mM咪唑的洗涤缓 冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝8.0，0.5MNaCl，1mMbeta-巯基乙醇，相应浓度的咪唑)依 次洗涤，最后用含250mM咪唑的洗脱缓冲液(50mMNa2HPO4/NaH2PO4，pH＝8.0，0.5MNaCl，1mM beta-巯基乙醇，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。所有纯化操作均在4℃进行，并保证预冷所有的 相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20％甘油中，分装后在-70℃保存。所有纯化操作均在4 ℃进行，并保证预冷所有的相关缓冲液。纯化得到的蛋白保存于20％甘油中，分装后在-70 ℃保存。蛋白纯度由SDS-PAGE(12％(M/V)丙烯酰胺凝胶)分析，结果如图5所示，洗脱组分中 重组GST-wACP1、GST-wACP2和GST-wPPT蛋白纯度均大于90％。
6、镍亲和纯化后的重组蛋白GST-wACP1、GST-wACP2和GST-wPPT使用Millipore AmiconUltra-15超滤管(购自Millipore，截留分子量为10kD，货号：UFC201024PL)浓缩蛋 白，并将原洗脱缓冲液置换为酶反应缓冲液(20mMTris-HCl，100mMNaCl，100mMKCl，5mM MgCl2，10mMCaCl2，1mMbeta-巯基乙醇，0.5mMDTT，15％(w/v)甘油，pH7.5)。操作按 UFC201024PL说明书进行，首先将前面纯化的蛋白浓缩至体积约为1ml，加入1ml酶反应缓冲 液，再次离心浓缩至体积为1ml，如此重复3次，最后将蛋白定容于2-3ml酶反应缓冲液，此时 已经将镍亲和纯化时的洗脱缓冲液中的咪唑降低至10mM以下。测定蛋白浓度，蛋白-20℃保 存。
步骤二PPT结构域对ACP结构域的4-磷酸泛酰巯基乙胺修饰
禾本红酵母脂肪酸合酶PPT结构域具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性，可催化 新生的ACP(apo-ACP，无活性形式)与辅酶A反应，生成3’，5’-二磷酸腺苷(3’，5’-ADP)和活 化的ACP(holo-ACP，36位丝氨酸残基的羟基上通过磷脂键连接一个来自辅酶A的4’磷酸泛 酰基巯基乙胺)。
20μgGST-ACP、2μgGST-PPT和0.3mMCoA(辅酶A，购自上海生工生物)混合于20μl酶反应缓冲液(20mMTris-HCl，pH＝7.5，100mMNaCl，100mMKCl，5mMMgCl2，10mMCaCl2，1mMbeta-巯基乙醇，0.5mMDTT，15％(w/v)甘油)中，30℃温育3小时。10μl样品-20℃保存，用于质谱鉴定。剩余10μl样品中加入1μl(1U/μl)肠激酶(enterokinase，购自生工生物)，稀释体积至12.5μl，25℃反应16小时，加入48.5μlddH2O和20μl4×SDS-PAGE样品缓冲液(12％SDS(W/V)，6％巯基乙醇(V/V)，30％甘油(W/V)，0.05％考马斯蓝G-250(Serva)，150mMTris/HCl(pH7.0))，50℃温育15min。取8μl样品进行Trcine-SDS-PAGE，凝胶浓度为16％[H.NatProtoc.2006，1(1)，16-22.]。结果显示，纯化的GST-PPT可以催化GST-ACP发生4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，由于ACP被修饰后分子量增加340Dalton，通过Tricine-SDS-PAGE可以在16％聚丙烯酰胺凝胶上分离Apo-ACP和Holo-ACP(图6)
实施例5：禾本红酵母脂肪酸合酶的真核表达和重组菌株构建
步骤一、禾本红酵母脂肪酸合酶表达载体pYX212-RgrFAS1+2构建
利用酿酒酵母体内高效同源重组优势，基于模块组装策略[ZhouYJ，GaoW，Rong QX，JinGJ，ChuHY，LiuWJ，YangW，ZhuZW，LiGH，ZhuGF，HuangLQ，Zhao ZK.J.Am.Chem.Soc.2012，134，3234-3241]，进行RgrFAS重组酿酒酵母菌株的构建和RgrFAS 的功能互补分析。
根据rgrfas1和rgrfas2编码基因序列以及酿酒酵母组成型表达载体pYX212[购自 Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心]的DNA序列，设计以下用于模块组装的 引物。模块组装过程如图7所示，引物序列信息如表2所示。
表2.pYX212-RgrFAS1+2载体构建所需引物
引物名称 别称 序列 TPIp-F a-F GAATTGGGGATCTACGTATGGTC FAS1-TPIp a-R CGCGTCGCTCGGCCGTTCATTTTTAGTTTATGTATGTG TPIp-FAS1 b-F CACATACATAAACTAAAAatgaacggtcaccacacccgtgcc TDH2t-FAS1 b-R AGTAACTTAAGGAGTTAAATtcactggatcgccgagaagacgtc FAS1-TDH2t c-F ACGTCTTCGGCGGGCTCTGAATTTAACTCCTTAAGTTACT FAS2-ADH1t c-R CGCCGTCGTCATCGCCCAGAAGTAAGCGAATTTCTTATGATTTATG
ADH1t-FAS2 c-F’ CATAAATCATAAGAAATTCGCctacgagcgagcgatgacgacggcgac FAS2-4386 e-R CACGGCGAGGCGTACGTCCAGGGCATC FAS2-4515 f-F CGTGATGTCGCGGTCGACGGTCGTGAG FAS2-2580 f-R CCCGTACGAGGTCTCCAAGGAGTACGCC FAS2-3096 g-F GTCGACGGCCTTGAGCGGCTCGTC 13 --> TEF1p-FAS2 g-R CTAAGTTTTAATTACAAAatggcggccgaccttccgctcgcg FAS2-TEF1p h-F GGCAAGTCCTGCGCCGCGACCATTTTGTAATTAAAACTTAG Plasmid-TEF1p h-R GGATGTGCTGCAAGGCGATTAATAGCTTCAAAATGTTTCTA TEF1p-Plasmid i-F GTAGAAACATTTTGAAGCTATTAATCGCCTTGCAGCACATCC Plasmid i-R TGCCGTAAACCACTAAATCGGAACC
1、元件获取。利用TPIp-F和FAS1-TPIp引物，以pYX212载体为模板，PCR扩增磷酸丙 糖异构酶启动子TPI1p基因片段(a片段，图7，下同)；利用TPIp-FAS1和TDH2t-FAS1引物，以 实施例3中构建的pMD19T-RgrFAS1质粒为模板，PCR扩增RgrFAS1亚基基因片段(b片段)；利 用FAS1-TDH2t和FAS2-ADH1t引物，以pYJ35质粒[参见ZhouYJ，GaoW，RongQX，JinGJ，Chu HY，LiuWJ，YangW，ZhuZW，LiGH，ZhuGF，HuangLQ，ZhaoZK.J.Am.Chem.Soc.2012，134， 3234-3241]为模板，PCR扩增ADH1t+THD2t双终止子基因片段(c片段)；以利用FAS1-TDH2t’ 和FAS2-ADH1t’引物，以pYJ35质粒[参见ZhouYJ，GaoW，RongQX，JinGJ，ChuHY，LiuWJ， YangW，ZhuZW，LiGH，ZhuGF，HuangLQ，ZhaoZK.J.Am.Chem.Soc.2012，134，3234-3241] 为模板，PCR扩增ADH1t+THD2t双终止子基因片段(c’片段)；利用ADH1t-FAS2和FAS2-4304引 物，以实施例2中构建的pMD19T-RgrFAS2为模板，PCR扩增RgrFAS2的C末端序列(e片段， RgrFAS24386-8793)；利用FAS2-4529和FAS2-2660引物，以实施例3中构建的pMD19T- RgrFAS2为模板，PCR扩增含ACP结构域的RgrFAS2中间序列(f片段，RgrFAS2(2580-4515))； 利用FAS2-3021和TEF1p-FAS2引物，以实施例3中构建的pMD19T-RgrFAS2为模板，PCR扩增 RgrFAS2的N末端序列(g片段，RgrFAS21-3096)；利用FAS2-TEF1p和Plasmid-TEF1p引物，以 pYJ35质粒为模板，PCR扩增转录延伸因子1启动子TEF1p基因片段(h片段)；利用TEF1p- Plasmid(i-F)和Plasmid(i-R)引物，以pYX212载体为模板，PCR扩增载体同源重组臂片段(i 片段)。
PCR扩增条件如下：5×PrimeSTARBuffer(TakaRa)100.0μl，dNTPs(10mM，TaKaRa) 10.0μl，上游引物和下游引物(均10mM)10.0μl，PrimeSTAR(TakaRa)2.5μl，模板DNA(均 100ng/μl)5.0μl，ddH2O补齐至500μl，混合均匀后分装5个PCR管，100μl/管；于94℃保温 3min，然后于98℃10s，58℃10s，72℃3min，30个循环，再72℃10min，4℃结束反应。PCR产物 进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，DNA条带充分分离后切割下含有目的DNA的凝 胶，，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商建议步骤 (NEP013-2说明书)纯化上述PCR产物。
2、模块构建。纯化后的a、b和c片段通过OverlapextensionPCR[BryksinAV， MatsumuraI.Biotechniques.2010，48(6)，463-465.]得到d模块；c’和e片段通过Overlap extensionPCR得到k模块；f片段亦本身就是f模块；g、h和i通过OverlapextensionPCR得 到j模块。OverlapextensionPCR条件如下：5×PrimeSTARBuffer(TakaRa)50.0μl，dNTPs (10mM，TaKaRa)5.0μl，每个模块两端引物(均10mM)5.0μl，PrimeSTAR(TakaRa)2.0μl，各基 因片段(均100nmol/μl)2.0μl，ddH2O补齐至250μl，混合均匀后分装5个PCR管，50μl/管；于 94℃保温3min，72℃5min，然后于98℃10s，58℃10s，72℃5min，30个循环，再72℃10min，4℃ 结束反应。PCR产物进行1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，DNA条带充分分离后切割下 含有目的DNA的凝胶，利用DNA回收试剂盒(购自北京舟鼎国，货号：NEP013-2)，按照供应商 建议步骤(NEP013-2说明书)纯化上述OverlapextensionPCR产物。
3、模块组装。使用500ng经EcoRI/XhoI和BamHI/HindIII两次双酶切线性化后回收 的pYX212载体大片段，以及等摩尔的模块片段，共转化S.cerevisiaeBY4741(购自 EUROSCARF，基因型：MATahis3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)。转化方法如下：单个酵母 菌落接种于5mlYPD培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖，pH6.0)，过夜 培养；以1∶50接种于100ml新鲜的YPD培养基，培养8h左右，此时OD值约为1.0-1.2，冰浴 15min；4℃，2000×g离心10min收集菌体，悬浮于50ml冰冷的ddH2O，2000×g离心10min离心 收集菌体，然后悬浮于20ml冰冷的1M山梨醇，2000×g离心10min离心收集菌体，倒尽溶液， 菌体悬浮于0.5-1.0ml冰冷的山梨醇，此时OD值约为100-200。50μl电转感受态细胞中加入 等摩尔的d、k、f、j模块DNA和pYX212载体大片段(总共3μg)，冰上放置10min，转移至冰冷的 电转杯中，1500V电压转化，此条件下电击时间约为5ms，电击完加入1ml冰冷的山梨醇，于30 ℃摇床温浴2h，涂于SC-Ura平板(0.67％YNBW/Oaminoacidsbutwithammonium sulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖， 0.005％组氨酸，0.005％蛋氨酸，0.01％亮氨酸，2％琼脂粉)，30℃倒置培养2天，平板上出 现转化子。挑取转化子接种于10mlSC-Ura培养基(0.67％YNBW/Oaminoacidsbutwith ammoniumsulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％ 葡萄糖，0.005％组氨酸，0.005％蛋氨酸，0.01％亮氨酸)，30℃200rpm振荡培养2d，利用玻 璃珠破壁法快速提取酵母中的质粒，按常规方法转化E.coliDH5a，获得的AMP抗性转化子 培养后提取质粒[分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出 版]；质粒经酶切验证和测序分析后，证明是正确构建的RgrFAS酵母表达载体，命名为 pYX212-RgrFAS1+2。
步骤二、单亚基表达载体pYX212-RgrFAS1和pYX212-RgrFAS2的构建
根据RgrFAS1核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物RgrFAS1-EcoRI-F的下 划线部分为EcoRI酶切位点，引物RgrFAS1-HindIII-R的下划线部分为HindIII酶切位点)， 序列如下：
RgrFAS1-EcoRI-F：ctctgaattcatgaacggtcaccacacccgtgccggcacc
RgrFAS1-HindIII-R：tctaagctttcactggatcgccgagaagacgtcgagctt
根据RgrFAS2核苷酸序列设计加相应酶切位点的引物(引物RgrFAS2-EcoRI-F的下 划线部分为EcoRI酶切位点，引物RgrFAS2-HindIII-R的下划线部分为HindIII酶切位点)， 序列如下：
RgrFAS2-EcoRI-F：ctctgaattcatggcggccgaccttccgctcgcgctgagc
RgrFAS2-HindIII-R：tctaagcttctacgagcgagcgatgacgacggcgacggc
以先前构建的克隆载体pMD19T-RgrFAS1和pMD19T-RgrFAS2为模板，利用物 RgrFAS1-EcoRI-F/RgrFAS2-HindIII-R和RgrFAS2-EcoRI-F/RgrFAS1-HindIII-R两对引分 别扩增RgrFAS1和RgrFAS2编码区序列。RgrFAS1和RgrFAS2的PCR扩增产物经EcoRI/HindIII 双酶切，连入同样双酶切的pYX212(购自Biovector中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中 心)载体(回收酶切大片段用于连接)，转化E.coliDH5a化学感受态细胞，经EcoRI/HindIII 双酶切和测序验证正确的重组质粒，分别命名为pYX212-RgrFAS1和pYX212-RgrFAS2。
步骤三、RgrFAS重组酵母表达菌株的构建
将重组质粒pYX212-RgrFAS1转化至S.cerevisiaeIKY2(由德国格赖夫斯瓦尔德大学(Ernst-Moritz-Arndt-Greifswald)的Hans-JoachimSchüller教授惠赐，基因型：MATα，ura3，leu2，trp1，his3，can1，Δfas1::LEU2)[参见WenzP，SchwankS，HojaU，SchüllerHJ.NucleicAcidsRes.2001，29(22)，4625-4632.]，将pYX212-RgrFAS2转化至S.cerevisiaeIKY4(由德国格赖夫斯瓦尔德大学(Ernst-Moritz-Arndt-Greifswald)的Hans-JoachimSchüller教授惠赐，基因型：MATα，ura3，leu2，trp1，his3，can1，Δfas2::LEU2)[参见WenzP，SchwankS，HojaU，SchüllerHJ.NucleicAcidsRes.2001，29(22)，4625-4632.]，将pYX212-RgrFAS1+2转化至S.cerevisiaePWY12(由德国格赖夫斯瓦尔德大学(Ernst-Moritz-Arndt-Greifswald)的Hans-JoachimSchüller教授惠赐，基因型：MATα，ura3，leu2，trp1，his3，can1，Δfas2::LEU2，Δfas1::HIS3)中[参见WenzP，SchwankS，HojaU，SchüllerHJ.NucleicAcidsRes.2001，29(22)，4625-4632.]。
转化方法如下：S.cerevisiaeIKY2、S.cerevisiaeIKY4和S.cerevisiaePWY12分 别挑单个酵母菌落接种于5ml含脂肪酸的YPD培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和 20g/L葡萄糖，pH6.0，并含0.5mM棕榈酸、0.5mM硬脂酸，1％Tween20)，过夜培养；以1∶50接种 于100ml新鲜的YPD培养基(20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物和20g/L葡萄糖，pH6.0)，培养至 OD值约为0.8-1.0，冰浴15min；4℃，2000×g离心10min收集菌体，悬浮于50ml冰冷的ddH2O， 2000×g离心10min离心收集菌体，然后悬浮于20ml冰冷的1M山梨醇，2000×g离心10min离 心收集菌体，倒尽溶液，菌体悬浮于0.5-1.0ml冰冷的山梨醇，此时OD值约为100-200。50μl 电转感受态细胞中加入0.5-1μg质粒DNA(体积不超过5μl)，冰上放置10min，转移至冰冷的 电转杯中，1500V电压转化，此条件下电击时间约为5ms，电击完加入1ml冰冷的山梨醇，于30 ℃摇床温浴2h，涂于相应营养缺省成分的SC-Ura平板[参考WenzP，SchwankS，HojaU，Sch üllerHJ.NucleicAcidsRes.2001，29(22)，4625-4632.]，30℃培养3-4天至长出转化子。 转化子接种于相应营养缺省成分的SC-Ura液体培养基[参考WenzP，SchwankS，HojaU， SchüllerHJ.NucleicAcidsRes.2001，29(22)，4625-4632.]过夜，3-4ml菌液离心收集菌 体，玻璃珠破碎细胞，提取质粒DNA转化E.coliDH5a，转化子提取质粒，EcoRI/NotI酶切验 证正确的质粒来源重组菌则分别命名为S.cerevisiaeIKY2/pYX212-RgrFAS1、 S.cerevisiaeIKY4/pYX212-RgrFAS2和S.cerevisiaePWY12/pYX212-RgrFAS1+2。
步骤四、RgrFAS重组酵母表达菌株油脂生产分析
S.cerevisiaeIKY2/pYX212-RgrFAS1、S.cerevisiaeIKY4/pYX212-RgrFAS2和 S.cerevisiaePWY12/pYX212-RgrFAS1+2分别接种5mlSC-Ura液体培养基(0.67％yeast nitrogenbaseW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate(无氨基酸酵母基础氮源，含 硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％色氨酸，0.005％ 组氨酸)30℃，200rpm培养24h。按1∶30比例分别转接SC-Ura-NL限氮培养基(20％葡萄糖， 0.1％酵母浸粉，0.4％KH2PO4，0.15％MgSO4·7H2O，痕量元素溶液500μL/50mL培养基， NH4Cl0.025％，pH6.0，C/N比(mol/mol)＝300，痕量元素溶液配方：0.4％CaCl2·H2O， 0.055％FeSO4·7H2O，0.052％水合柠檬酸，0.01％ZnSO4·7H2O，0.0076％MnSO4·H2O，180mM 硫酸)，30℃，200rpm培养3d，每隔24h取样，留做油脂含量分析[LiYH，ZhaoZK，Bai FW.EnzymeMicrob.Technol.2007，41(3)，312-317]。3个重组菌株在发酵终点(3d)的胞内 油脂含量如表3所示。
pYX212空载体转化菌株S.cerevisiaeIKY2/pYX212、S.cerevisiaeIKY4/pYX212、 S.cerevisiaePWY12/pYX212则做为对照菌株，先分别接种5ml含脂肪酸的SC-Ura液体培养 基(0.67％yeastnitrogenbaseW/Oaminoacidsbutwithammoniumsulfate(无氨基酸 酵母基础氮源，含硫酸铵，购自BDDific，货号：291920)，2％葡萄糖，0.01％亮氨酸，0.01％ 色氨酸，0.005％组氨酸，以及0.5mM棕榈酸、0.5mM硬脂酸，1％Tween20)30℃，200rpm培养 24h。按1∶30比例分别转接SC-Ura-NL限氮培养基(20％葡萄糖，0.1％酵母浸粉，0.4％ KH2PO4，0.15％MgSO4·7H2O，痕量元素溶液500μL/50mL培养基，NH4Cl0.025％，pH6.0，C/N比 (mol/mol)＝300，痕量元素溶液配方：0.4％CaCl2·H2O，0.055％FeSO4·7H2O，0.052％水合 柠檬酸，0.01％ZnSO4·7H2O，0.0076％MnSO4·H2O，180mM硫酸)，30℃，200rpm培养3d，每隔 24h取样，留做油脂含量分析[LiYH，ZhaoZK，BaiFW.EnzymeMicrob.Technol.2007，41 (3)，312-317]。
结果显示，RgrFAS双亚基共表达的重组菌株S.cerevisiaePWY12/pYX212- RgrFAS1+2在发酵终点(3d)胞内油脂含量可超过30％，而单一亚基RgrFAS1、RgrFAS2重组菌 株的胞内油脂含量没明显增加。证明RgrFAS可显著增加非产油脂微生物胞内油脂含量，赋 予重组菌株油脂生产性状；并且，这个功能需要RgrFAS1、RgrFAS2两个亚基共同执行。
表3.重组酵母菌株在发酵终点(3d)的胞内油脂含量
注：/代表由于菌体量少，未能获得有效胞内油脂含量
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述， 但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范 围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。