防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102604869 B (45)授权公告日 2013.05.29 CN 102604869 B *CN102604869B* (21)申请号 201210079335.8 (22)申请日 2012.03.23 CGMCC NO.5731 2012.01.16 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/02(2006.01) A01P 1/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 211225 江苏省南京市溧水区白马镇国 家农业科技园南京农业大学基地 (72)发明人 郭坚华 蒋春号 武芳 (74)专利。

2、代理机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 代理人 徐冬涛 CN 101215543 A,2008.07.09, CN 101919414 A,2010.12.22, CN 102174431 A,2011.09.07, 吴艳 等 . 组合芽孢杆菌抑菌物质特性及其 抑菌效果研究 .西北农业学报 .2007, 第 16 卷 ( 第 5 期 ), (54) 发明名称 防治西瓜细菌性果斑病生防菌株 1JN2 及其 应用 (57) 摘要 本发明属于农作物防病治病技术领域， 公 开了防治西瓜细菌性果斑病生防菌株 1JN2 及 其应用。生防菌株 1JN2， 分类命名为 Bacillus axar。

3、quiensis， 2012 年 1 月 16 日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保 藏号为 CGMCC N0.5731。将该菌在 LB 培养液中 28 180rpm 振荡培养 12-16h， 然后 6000rpm 离 心 10min， 用灭菌水进行稀释制成菌剂， 菌剂成品 中活菌总浓度为 1109-11010CFU/mL。温室大 棚试验结果显示， 含 1JN2 的生防菌剂对西瓜的 促生作用效果显著， 生物量增加达到 55.92， 并 且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著， 高达 50.13。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王宽 。

4、权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 (10)授权公告号 CN 102604869 B CN 102604869 B *CN102604869B* 1/1 页 2 1.一种防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2 （Bacillus axarquiensis）， 于2012年 1 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌种保藏号为 CGMCC NO.5731。 2. 用权利要求 1 所述的生防菌株 1JN2 制备的生防菌剂。 3. 权利要求 1 所述的生防菌株 。

5、1JN2 在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。 4. 权利要求 1 所述的生防菌株 1JN2 用于制备生防菌剂的方法， 其特征在于将权利要 求 1 所述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株 1JN2 在 LB 培养液中 28 180 rpm 振荡培养 12-16 h， 然后 6000 rpm 离心 10 min， 用灭菌水进行稀释制成菌剂， 菌剂成品中活菌总浓度 为 1109 -11010 CFU/mL。 5. 权利要求 2 所述生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102604869 B 2 1/4 页 3 防治西瓜细菌性果斑病生防菌株 1JN2 及其应用 技术领域 00。

6、01 本发明属于农业生物技术领域， 涉及防治西瓜细菌性果斑病生防菌株 1JN2 及其 应用。 背景技术 0002 西瓜细菌性果斑病 (Bacterial fruit blotch of watermelon， BFB) 是西瓜上 的一种危险性检疫病害， 又称细菌性斑点病， 该病最早于 1969 年由 Crall 和 Schenck 在美 国佛罗里达州发现， 当时只是对果斑病症状进行了描述， 未做病原菌的鉴定 ； 目前为止， 在 我国许多省市， 像新疆， 陕西， 河北， 山西， 吉林， 福建， 甘肃等地都已有果斑病的报道。该病 害主要危害果实， 引起西瓜果实腐烂等， 可造成毁灭性损失， 一旦发病。

7、用药防治基本没有效 果。而且带菌种子将成为下一年重要的初侵染源。该病的发生严重影响了西瓜的产量和品 质， 成为西瓜生产上亟待解决的难题之一。 0003 该病害是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种 (Acidovorax avenae subsp.citrulli， Aac) 引 起的， 西瓜果斑目前在瓜类作物中无免疫品种。西瓜细菌性果斑病是一种毁灭性的细菌性 病害 , 大田生长期不易被发现 , 且发病突然、 发展迅速 , 由于目前还没有发现种子处理的 更好方法， 目前生产中所采用的化学药剂有农用链霉素， 可杀得， 新植霉素， 细菌杀， 叶双 青， 加瑞农， 琥胶肥酸铜等， 虽然化学药剂对该病有一定的防治效果。

8、， 但是防治效果不高， 而 且大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、 农药残留， 以及引起病原菌抗药性等问题。 生 物防治是一种安全有效的防治手段， 符合农业持续发展的方向。 发明内容 0004 本发明的目的针对西瓜产业潜在危害较大的西瓜细菌性果斑病， 提供开发一种防 治西瓜细菌性果斑病的单一生防菌菌株及其应用。 0005 本发明的目的可通过如下技术方案实现 ： 0006 一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株 1JN2， 分类命名为 Bacillus axarquiensis， 2012 年 1 月 16 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址北京市朝阳区北辰西路 1 号。

9、院 3 号， 中国科学院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.5731。 0007 用所述的保藏号为 CGMCC NO.5731 的生防菌株 1JN2 制备的生防菌剂。 0008 所述的保藏号为 CGMCC NO.5731 的生防菌株 1JN2 在防治西瓜细菌性果斑病中的 应用。 0009 所述保藏号为 CGMCC NO.5731 的生防菌株 1JN2 用于制备生防菌剂的方法 ： 将所 述的保藏号为 CGMCC NO.5731 的防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株 1JN2 在 LB 培养液中 28 180rpm 振荡培养 12-16h， 然后 6000rpm 离心 10min， 用灭菌。

10、水进行稀释制成菌剂， 菌剂 成品中活菌总浓度为 1109-11010CFU/mL。 0010 所述的保藏号为 CGMCC NO.5731 的生防菌株 1JN2 制备的生防菌剂在防治西瓜细 说 明 书 CN 102604869 B 3 2/4 页 4 菌性果斑病中的应用。 该菌剂可以兑水喷雾使用， 或做成堆肥使用， 也可稀释后在移栽时灌 根。 0011 有益效果 0012 本发明的优点和积极效果表现在 ： 本发明是专门针对西瓜细菌性果斑病病害开发 的生防制剂。 由于是生物制剂， 完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题， 因而有利 于西瓜的无公害生产， 农民可以不用或减少其他化学农药的用量， 。

11、这不仅可为农民节省开 支， 而且有利于西瓜的出口贸易。 0013 温室大棚试验结果显示， 含 1JN2（CGMCC NO.5731） 的生防菌剂对西瓜的促生作用 效果显著， 生物量增加达到 55.92%（表 1） ， 并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著， 高 达 50.13%（表 2） 。 0014 生物样品保藏信息 0015 生防菌株 1JN2， 分类命名为 Bacillus axarquiensis， 于 2012 年 1 月 16 日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院中 科院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.5。

12、731。 具体实施方式 0016 实施例 1 0017 一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2， 为Bacillus axarquiensis， 由 山东省莱芜市生姜茎内分离得到。其具体分离、 筛选、 鉴定方法如下 ： 0018 1 生防菌株 1JN2 的分离 0019 剪掉生姜茎部 3g, 用 1% 的次氯酸钠 1mL 浸 5min， 70% 酒精浸 2min， 无菌水清洗 3 次。 （取最后一次清洗的溶液 0.1mL 涂 R2A， 或取 0.1mL 最后一次清洗液加入 R2A 培养液， 30振荡培养， 若 48h 后无菌生长则认为表面消毒干净） 。用灭菌的研砵研碎表面消毒好的 茎，。

13、 加 3mL 无菌水， 无菌棉布过滤， 用无菌水稀释 10 倍， 取 0.1mL 涂 LB 平板， 每个点重复 3 次， 28培养 48h， 计数， 挑取平板上所有的菌落分离纯化， -70、 40% 甘油保存备用。 0020 2 生防菌株 1JN2 的筛选 0021 将西瓜细菌性果斑病病原菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种 (Acidovorax avenae)FC440 （JianjunFeng,Erin L.Schuenzel,Jianqiang Li,and Norman W.Schaad.2009.Multilocus SequenceTyping Reveals Two Evolutionary 。

14、Lineages of Acidovorax avenae subsp. Citrulli.Bacteriology.99(8):913-920）在 LB 培养液 （氯化钠 10g/L, 胰蛋白胨 10g/L, 酵母浸粉 5g/L， 调节 pH 值为 7.2） 中培养 16-24h 至 CFU 为 108/ml)， 加入熔化冷却至 40 左右的固体培养基中， 体积比 1:200， 将培养基每 20mL 倒入 9cm 直径的平板中。待冷却凝 固后， 牙签接种生防菌 1JN2。置于 28恒温培养箱培养， 24h 后记录抑菌圈环径， 挑取抑菌 圈最大的命名为 1JN2， 于 2012 年 1 月 1。

15、6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院中科院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.5731。 0022 3 生防菌株 1JN2 的鉴定 0023 3.1 生防菌株 1JN2 的形态特征 0024 菌落扁平、 灰白色， 边缘波纹状， 较粘稠， 菌体直杆状， 大小为 2.00.5m， 单生、 说 明 书 CN 102604869 B 4 3/4 页 5 对生或成短链状、 丝状， 周生多根鞭毛， 内生孢子为椭圆形， 在末端未膨大的孢子囊中， 好气 性， 革兰氏反应阳性。 0025 3.2 生防菌株 1JN2 的生理生化特征 00。

16、26 将生防菌1JN2活化在LB平板上 （氯化钠10g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L， 调节 pH 值为 7.2） ， 28培养 24h, 用牙签挑取单菌落分别接种到蛋白酶， 几丁质酶， 纤维素 酶， 以及嗜铁素酶活测定的平板上， 置于 28恒温培养箱培养， 培养 2-3d, 测量透明圈直径 的大小。 0027 表 1.Bacillus axarquiensis 1JN2 的生理生化特征 0028 0029 3.3 生防菌株 1JN2 的分子学鉴定 0030 细菌基因组试剂盒 （赛百盛公司） 提取细菌基因 DNA 后， 用 gyrB 通用引物 gyrB1 （SEQ IDNO.1） 。

17、； gyrB2R（SEQ ID NO.2） 从基因组 DNA 中扩增出 gyrB 基因片段。具体扩增 体系及程序 （25ul） 如下 ： 引物 gyrB1、 gyrB2R(10M) 各 1l ； Mix:12.5l ； Taq:0.5l。 ddH2O:10l ； 模板 :1l。94 C 预变性 5min， 94 C 变性 1min， 56 C 退火 2min， 72 C 延伸 2min， 35 个循环， 72 C 延伸 10min， 4 C 保存。PCR 扩增产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳 进行检测， 90V， 30min ； EB 染色 30min， 检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到 pMD。

18、19-T 载 体， 转化于Escherichia coli DH5， 提取阳性克隆质粒， 委托TaKaRa公司测序， 提交NCBI （National Center for Biotechnology Information） 进行比对。与登录号为 DQ903178.1 的Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比对， 相 似度为 99%， 因此鉴定 1JN2 为 Bacillus axarquiensis。 0031 实施例 21JN2 生防菌剂的制备 0032 将上述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株 。

19、1JN2（CGMCC NO.5731） 在 LB 培养液 28 180rpm 振荡培养 12-16h， 然后 6000rpm 离心 10min， 用灭菌水进行稀释制成菌剂， 菌剂 成品中活菌总浓度为 1109-11010CFU/mL， 以下称该生防菌剂为 1JN2 生防菌剂。 0033 实施例 31JN2 温室促生试验 0034 将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中， 每盆一粒， 16/8h 光周期。待 西瓜长到 6 叶期时， 将悬浮好的 1JN2 生防菌剂 （实施例 2 制备， 下同） 以 108CFU/ml 的浓度 用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面， 使叶片湿润而菌剂又恰好。

20、不流下来。置于 温室中培养， 28， 70% 相对湿度以上， 生防菌接种 30 天后， 分别取处理组和对照组植株， 小 心剔除根部土壤， 清洗干净后， 自然风干， 分别统计地上部长， 地下部长， 植株鲜重。60 C， 烘干 72h 后测量植株干重。 0035 生物量增加 （%） =（处理组植株干重 - 对照植株干重） / 对照植株干重 100% 0036 表 2.Bacillus axarquiensis 1JN2 对西瓜苗期的促生作用 0037 说 明 书 CN 102604869 B 5 4/4 页 6 0038 温室促生试验结果显示， 芽孢杆菌 1JN2 能够显著促进西瓜的生长， 表现在。

21、西瓜 的鲜根重， 鲜茎重， 干根重， 干茎重， 根长， 茎长， 与对照相比， 都有显著的增加， 结果计算得 1JN2 对西瓜的生物量增加能达 55.92%。 0039 实施例 41JN2 温室大棚防效试验 0040 将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中， 每盆一粒， 播种前保持土壤 较为干燥。待西瓜长到 6 叶期时， 将悬浮好的 1JN2 生防菌剂以 108CFU/ml 的浓度用手动式 喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面， 使叶片湿润而菌液又恰好不流下来， 随后置于温室 中培养， 28， 70% 相对湿度以上， 16/8h 光周期。待接种生防菌 5 天后， 进行病原菌的接种， 接种浓度为。

22、 107CFU/ml， 同样用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面， 使叶片湿润而 菌液又恰好不流下来， 接种前所有植株均未发病， 接种病原菌 3 天后， 开始发病并统计其发 病率， 并计算防效。西瓜细菌性果斑病叶片分级标准 :（Ofir Bahar(2009)） 0041 发病率统计 （病情统计） ： 分为 0、 1、 2、 3、 4、 5、 6 七个等级 0042 0 级 : 不发病 ; 0043 1 级 : 病叶上有零星病斑， 病斑占叶面积的 10% 以下 ; 0044 2 极 : 病叶上有少量病斑， 病斑占叶面积的 11%25%; 0045 3 级 : 病叶上病斑数量中等， 病斑占叶。

23、面积的 26%50%; 0046 4 级 : 病叶上病斑数量较多， 病斑占叶面积的 51%75%; 0047 5 级 : 病叶上有许多病斑， 病斑占叶面积的 76%90%; 0048 6 级 ： 病叶上有大量病斑， 病斑占叶面积 90% 以上 ; 0049 病 害 严 重 度 %=( 病 级 株 数 代 表 级 数 ) 植 株 总 数 最 高 代 表 级 值 100% ； 0050 防效 %=( 对照发病率处理防病率 ) 对照发病率 100% ； 0051 表 3.Bacillus axarquiensis 1JN2 对西瓜细菌性果斑病的防效 0052 0053 试验结果显示， 1JN2 能够显著降低西瓜细菌性果斑病的发病率， 其平均防效达 50.13%。 说 明 书 CN 102604869 B 6 1/2 页 7 0001 序 列 表 CN 102604869 B 7 2/2 页 8 0002 序 列 表 CN 102604869 B 8 。