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早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱及诊断模型.pdf

上传人：七月

文档编号：8877082

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1、(10)授权公告号 CN 103993093 B (45)授权公告日 2015.01.28 CN 103993093 B (21)申请号 201410245237.6 (22)申请日 2014.06.05 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人山东大学齐鲁医院地址 250014 山东省济南市历下区文化西路 107 号 (72)发明人王传新杜鲁涛蒋秀梅张欣杨咏梅 (74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司 37221 代理人彭成 (54) 发明名称早期膀胱癌血清 miRNAs 特异表达谱及诊断模型 (57) 摘。

2、要本发明公开了一种早期膀胱癌血清 miRNAs 特异表达谱，由表达上调的 miR-152， miR-148b-3p，以及表达下调的 miR-3187-3p,mi R-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p 构成。所述早期膀胱癌血清 miRNAs 特异表达谱中特异表达 miRNAs 的逆转录引物和检测引物，如 SEQIDNO ： 1 13 所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清 miRNAs 诊断模型，利用以下公式： logit(P BC) 0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767 *(miR-。

3、148b-3p) 0.475*(miR-3187-3p) 0.2395*(miR-15b-5p)0.625*(miR-27a-3p) 0.1693*(miR-30a-5p) 计算，用于膀胱癌的早期诊断，经 ROC 曲线分析，此血清 miRNAs 模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学 , 此模型能够诊断膀胱癌早期患者 (Ta 和 T1)。 (51)Int.Cl. 审查员袁实权利要求书 3 页说明书 7 页序列表 8 页附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书3页说明书7页序列表8页附图2页 (10)授权公告。

4、号 CN 103993093 B CN 103993093 B 1/3 页 2 1. 一种早期膀胱癌 miRNAs 检测试剂盒，其特征在于：包括：上调表达的 miR-152， miR-148b-3p，以及下调表达的 miR-3187-3p， miR-15b-5p， miR-27a-3p， miR-30a-5p 相应逆转录引物、检测引物。 2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒，其特征在于：所述miRNAs来自外周静脉血的血清。 3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于：包括以下。

5、引物： (1)miR-152 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 1 所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 2 所示： SEQ ID NO ： 1 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3 ； SEQ ID NO ： 2 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3 ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 3所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 4 所示： SE。

6、Q ID NO ： 3 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3 ； SEQ ID NO ： 4 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3 ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 5所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 6 所示： SEQ ID NO ： 5 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3 ； SEQ ID NO ： 6 ： 5 -ACACTC。

7、CAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3 ； (4)miR-15b-5p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 7 所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 8 所示： SEQ ID NO ： 7 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3 ； SEQ ID NO ： 8 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3 ； (5)miR-27a-3p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 9 所示，前向检。

8、测引物的序列如 SEQ ID NO ： 10 所示： SEQ ID NO ： 9 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3 ； SEQ ID NO ： 10 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3 ； (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 11所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 12 所示：权利要求书 CN 103993093 B 2 2/3 页 3 SEQ ID NO ： 11 ： 5 -CTCAAC。

9、TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3 ； SEQ ID NO ： 12 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3 ； (7) 六种 miRNAs 的通用反向检测引物如 SEQ ID NO ： 13 所示： SEQ ID NO ： 13 ： 5 -TGGTGTCGTGGAGTCG-3 。 4. 一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于：包括特异表达 miRNAs 的逆转录引物和检测引物，如下： (1)miR-152 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 1 。

10、所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 2 所示： SEQ ID NO ： 1 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3 ； SEQ ID NO ： 2 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3 ； (2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 3所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 4 所示： SEQ ID NO ： 3 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACA。

11、AAGTT-3 ； SEQ ID NO ： 4 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3 ； (3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 5所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 6 所示： SEQ ID NO ： 5 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3 ； SEQ ID NO ： 6 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3 ； (4)miR-15b-5p 的逆转录引物和前向检测引物：。

12、逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 7 所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 8 所示： SEQ ID NO ： 7 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3 ； SEQ ID NO ： 8 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3 ； (5)miR-27a-3p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQ ID NO ： 9 所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 10 所示： SEQ ID NO ： 9 ： 5 -CTCAACTGG。

13、TGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3 ； SEQ ID NO ： 10 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3 ；权利要求书 CN 103993093 B 3 3/3 页 4 (6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO ： 11所示，前向检测引物的序列如 SEQ ID NO ： 12 所示： SEQ ID NO ： 11 ： 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3 ； SEQ ID NO ： 1。

14、2 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3 ； (7) 六种 miRNAs 的通用反向检测引物如 SEQ ID NO ： 13 所示： SEQ ID NO ： 13 ： 5 -TGGTGTCGTGGAGTCG-3 。权利要求书 CN 103993093 B 4 1/7 页 5 早期膀胱癌血清 miRNAs 特异表达谱及诊断模型技术领域 0001 本发明涉及早期膀胱癌血清 miRNAs 特异表达谱，其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断技术领域。背景技术 0002 膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均。

15、居泌尿系统肿瘤的首位，且近年有逐渐上升的趋势。20 -30的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润，而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中，约 15的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此，早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前，用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用；尿液脱落细胞学检查虽特异性较高，但敏感性较低，尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为 20 40，且易受监测这主观因素的影响； CT 和超声检查不易发现膀胱内较小的病变，对。

16、膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。 0003 MicroRNA(miRNAs) 是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子 RNAs，通过对靶 mRNA 降解或翻译抑制，在转录后水平调节靶基因的表达，进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实， miRNAs 在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的 miRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中 miRNAs 表达谱，。

17、发现不同肿瘤具有其特定的 miRNAs 表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此，确定膀胱癌 miRNAs 特异表达谱，筛选差异表达的 miRNAs，建立膀胱癌血清 miRNAs 诊断模型，有助于实现对膀胱癌的早期诊断。发明内容 0004 针对上述现有技术的不足，本发明提供了膀胱癌患者血清 miRNA 特异表达谱，及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型，为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。 0005 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案： 0006 一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-152,miR-。

18、148b-3p以及下调表达的 miR-3187-3p， miR-15b-5p,miR-27a-3p， miR-30a-5p 构成。 0007 所述 miRNAs 来自外周静脉血的血清。 0008 所述膀胱癌 miRNAs 特异表达谱中特异表达 miRNAs 的逆转录引物和检测引物，如下： 0009 (1)miR-152 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 1 所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 2 所示：说明书 CN 103993093 B 5 2/7 页 6 0010 SEQIDNO ： 1 ： 0011 5 -CTCAAC。

19、TGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3 ； 0012 SEQIDNO ： 2 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3 ； 0013 (2)miR-148b-3p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 3 所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 4 所示： 0014 SEQIDNO ： 3 ： 0015 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3 ； 0016 SEQIDNO ： 4 ： 5 -ACACTCCAGCTGG。

20、GTCAGTGCATCACAGAA-3 ； 0017 (3)miR-3187-3p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 5 所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 6 所示： 0018 SEQIDNO ： 5 ： 0019 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3 ； 0020 SEQIDNO ： 6 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3 ； 0021 (4)miR-15b-5p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 7 。

21、所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 8 所示： 0022 SEQIDNO ： 7 ： 0023 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3 ； 0024 SEQIDNO ： 8 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3 ； 0025 (5)miR-27a-3p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 9 所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 10 所示： 0026 SEQIDNO ： 9 ： 0027 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGA。

22、GTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3 ； 0028 SEQIDNO ： 10 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3 ； 0029 (6)miR-30a-5p 的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如 SEQIDNO ： 11 所示，前向检测引物的序列如 SEQIDNO ： 12 所示： 0030 SEQIDNO ： 11 ： 0031 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3 ； 0032 SEQIDNO ： 12 ： 5 -ACACTCCAGCTGGGTGTAAA。

23、CATCCTCGAC-3 ； 0033 (7) 六种 miRNAs 的通用反向检测引物如 SEQIDNO ： 13 所示： 0034 SEQIDNO ： 13 ： 5 -TGGTGTCGTGGAGTCG-3 。 0035 一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达 miRNAs 的逆转录引物和检测引物。 0036 一种早期膀胱癌血清 miRNAs 诊断模型。具体如下：运用以下公式计算： 0037 logit(P BC) 0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p) 0.475*(miR-3187-3p) 0.2395*(mi。

24、R-15b-5p) 0.625*(miR-27a-3p) 0.1693*(miR-30a-5p) 0038 公式中的 “(miR-152)” 、“(miR-148b-3p)” 、“(miR-3187-3p)” 、“miR-15b-5p)” 、 “miR-27a-3p” 、“miR-30a-5p” 分别表示相对应的 miRNAs 的表达量。 0039 一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下：首先，利用上述特异表达 miRNAs 的说明书 CN 103993093 B 6 3/7 页 7 逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种 miRNAs 的表达量，包括 miR-15。

25、2， miR-148b-3p， miR-3187-3p， miR-15b-5p,miR-27a-3p 和 miR-30a-5p，然后，运用下述公式计算： 0040 logit(P BC) 0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p) 0.475*(miR-3187-3p) 0.2395*(miR-15b-5p) 0.625*(miR-27a-3p) 0.1693*(miR-30a-5p) 0041 将六种 miRNAs 的表达量分别输入 Matlab 软件 ( 该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件 )，若 logit(P BC。

26、) 为 1，可以判断为膀胱癌；若 logit(P BC) 为 0，判断为非膀胱癌。 0042 本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，采用 “miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq 深度测序” 的研究策略，对三组血清标本中 miRNAs 表达谱进行了比对分析，共筛查出 26 个差异表达 miRNAs，序列见表 1。然后采用 SYBRGreen 的逆转录 - 实时荧光定量 PCR 方法，对上述 26 个差异表达 miRNAs 在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证，最终确定了与膀。

27、胱癌相关的 6 个 miRNAs，包括表达上调的 miR-152,miR-148b-3p 以及下调表达的 miR-3187-3p， miR-15b-5p,miR-27a-3p， miR-30a-5p，且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表 2。进而，提供了一种诊断膀胱癌的血清 miRNAs 表达模型：利用多元 logistic 回归方法提供了一种膀胱癌血清 miRNAs 诊断模型的计算公式： 0043 logit(P BC) 0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p) 0.475*(miR-3187-3p) 0.2395。

28、*(miR-15b-5p) 0.625*(miR-27a-3p) 0.1693*(miR-30a-5p) 0044 ROC 曲线分析显示，此血清 miRNAs 模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学，此模型能够诊断膀胱癌早期患者 (Ta 和 T1)。附图说明 0045 图 1 ：六种 miRNAs 在膀胱癌组和对照组中的表达，其中， A ： miR-152 ； B ： miR-148b-3p ； C ： miR-3187-3p ； D ： miR-15b-5p ； E ： miR-27a-3p ； F ： miR-30a-5p。 00。

29、46 图 2 ：六种 miRNAs 对膀胱癌的诊断 ROC 曲线，其中， A ： miR-152 ； B ： miR-148b-3p ； C ： miR-3187-3p ； D ： miR-15b-5p ； E ： miR-27a-3p ； F ： miR-30a-5p。 0047 图 3 ：建立的诊断模型 (panel) 及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断 ROC 曲线。 0048 图 4 ：建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断 ROC 曲线，其中， A ： Ta ； B ： T1 ； C ： T2-T4。 0049 图 2、 3、 4 中，横坐标：特异性；纵坐标：敏感性。

30、。具体实施方式 0050 以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。 0051 实施例一 0052 1、研究对象 0053 血清标本共来自经受试者同意的 175 例膀胱癌患者 (BC) 和 165 例排除泌尿系肿说明书 CN 103993093 B 7 4/7 页 8 瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院 ( 以下称本院 ) 泌尿外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者， 25名尿路结石患者， 19 名膀胱炎患者和 84 名健康者。其中，。

31、获取 75 名膀胱癌患者、 16 名前列腺良性增生患者、 13 名尿路结石患者、 8 名膀胱炎患者和 38 名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。 0054 2、标本采集 0055 采集血清3ml，立即1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于 -80待测。取 3l 分离上清液与 3lRNA 分离液混合， 16000g 离心 10 分钟，分离上清，将上清 1:10 稀释用于逆转录模板。留取中段尿 15ml，立即 1300g 离心 10min，取沉渣瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。 0056 4、文库构。

32、建和 Miseq 测序 0057 取冻存样本于常温下解冻，按 miRNeasyMiniKit 试剂盒 (Qiagen 公司 ) 操作者说明提取血清总 RNA，总 RNA 浓缩后经 T4RNA 连接酶作用，分别连接 3 -linker 和 5 -linker，然后通过 RT-PCR 技术扩增建库。使用 KAPAqPCR 试剂盒检测文库，若 qPCR 浓度大于 1nM 且无 dimer 污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后，通过 Miseq 测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和 miRNA 数据库 (miRBase17.0) 中人 miRNA 序列，获取三组。

33、样本已知 miRNA 的表达丰度。 0058 5、 RT-qPCR 0059 使用 One StepmiRNA cDNA SynthesisKit 逆转录试剂盒 (Takara 公司 ) 反转录上述 mRNA 成 cDNA，再进行 PCR 反应，运行于 ABI7500 实时荧光定量 PCR 分析仪 (ABI 公司 )。 0060 PCR 反应体系 (25l) ： 0061 模板 DNA ： 2ul 0062 SYBRPremixExTaq ： 12.5l 0063 Dye ： 0.5l 0064 上游引物 (10M) ： 1l 0065 下游引物 (10M) ： 1l 0066 无菌水。

34、： 8l 0067 反应条件为： 95 30 秒 1 个循环； (95 5 秒， 57 34 秒 ) 45 个循环；添加溶解曲线。 0068 每个标本均重复测定三次， miRNA 表达量采用 2- Ct 进行分析。 0069 6、数据处理与统计学分析 0070 通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间 miRNAs 的浓度差异， P0.05 被认为具有统计学差异。经多元 logistic 回归分析建立 miRNAs 诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断效能采用 ROC 曲线及曲线下面积 AUC 分析。 0071 7、。

35、检测结果 0072 1)经Miseq测序分析，膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs(入说明书 CN 103993093 B 8 5/7 页 9 选标准：在任一组中拷贝数大于 50 ；在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于 2 倍 )，其中上调的包括 miR-24-3p,miR-128,miR-98,miR-148b-3p,miR-152,miR-30d-5p,miR-1294 和 let-7c，下调的包括 miR-484,let-7b-5p,let-7a-5p,miR-30a-5p,miR-181b-5p,miR-1228- 5p,miR-181a-5p,m。

36、iR-27a-3p,miR-3135b,miR-3187-3p,miR-185-5p,miR-15a-5p,miR-15b -5p,miR-92b-5p,miR-342-3p,miR-148a-3p,miR-501-3p, 和 let-7i-5p。序列如表 1 所示 ( 如 SEQIDNO ： 14 39 所示 )。 0073 表 1 测序筛出的差异 miRNAs 序列 0074 说明书 CN 103993093 B 9 6/7 页 10 0075 2) 上述 26 个 miRNAs 经 RT-qPCR 验证，以平均 Cq 值小于 35 且检测率大于 75 ；在膀胱癌组和对照组表达差异。

37、具有统计学意义，即 P0.05 为入选标准，共确定出 6 个差异表达的 miRNAs，包括 miR-152， miR-148b-3p， miR-3187-3p， miR-15b-5p， miR-27a-3p 和说明书 CN 103993093 B 10 7/7 页 11 miR-30a-5p。检测引物为自主设计，其序列及Tm值如表2所示(如SEQIDNO ： 113所示)。 0076 表 2 引物序列 0077 0078 3) 如图 1 所示， miR-152 和 miR-148b-3p 在膀胱癌组表达显著增高， miR-3187-3p， miR-15b-5p， miR-27。

38、a-3p 和 miR-30a-5p 表达显著降低。建立上述 6 个 miRNAs 各自诊断膀胱癌的 ROC 曲线，如图 2 所示。 0079 4) 将上述 6 个 miRNAs 带入多元 logistic 回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为： logit(P BC) 0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b -3p) 0.475*(miR-3187-3p) 0.2395*(miR-15b-5p) 0.625*(miR-27a-3p) 0.1693*(miR-30a-5p)。经ROC曲线分析，此模型对膀。

39、胱癌的诊断效能AUC为0.919，敏感性和特异性分别为94.67和82.67，高于传统的尿液脱落细胞学(AUC为0.653， P0.001)，如图 3 所示。 0080 5)利用该诊断模型对膀胱癌分期为Ta， T1， T2-T4的患者进行分析，其诊断Ta， T1， T2-T4 患者的 AUC 分别为 0.879， 0.908 和 0.952，如图 4 所示。说明该模型能够实现对膀胱癌的早期诊断。说明书 CN 103993093 B 11 1/8 页 12 0001 0002 序列表 CN 103993093 B 12 2/8 页 13 0003 序列表 CN 103。

40、993093 B 13 3/8 页 14 0004 序列表 CN 103993093 B 14 4/8 页 15 0005 序列表 CN 103993093 B 15 5/8 页 16 0006 序列表 CN 103993093 B 16 6/8 页 17 0007 序列表 CN 103993093 B 17 7/8 页 18 0008 序列表 CN 103993093 B 18 8/8 页 19 序列表 CN 103993093 B 19 1/2 页 20 图 1 图 2 说明书附图 CN 103993093 B 20 2/2 页 21 图 3 图 4 说明书附图 CN 103993093 B 21 。

摘要
申请专利号：	CN201410245237.6	申请日：	20140605
公开号：	CN103993093B	公开日：	20150128
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/68,C12N15/11	主分类号：	C12Q1/68,C12N15/11
申请人：	山东大学齐鲁医院
发明人：	王传新,杜鲁涛,蒋秀梅,张欣,杨咏梅
地址：	250014 山东省济南市历下区文化西路107号
优先权：	CN201410245237A
专利代理机构：	济南圣达知识产权代理有限公司	代理人：	彭成
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内容摘要

本发明公开了一种早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，由表达上调的miR-152，miR-148b-3p，以及表达下调的miR-3187-3p,miR-15b-5p,miR-27a-3p,miR-30a-5p构成。所述早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如SEQIDNO：1～13所示。本发明还提供了一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型，利用以下公式：logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)计算，用于膀胱癌的早期诊断，经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学,此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。

权利要求书

1.一种早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒，其特征在于：包括：上调表达的miR-152，miR-148b-3p，以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p，miR-30a-5p相应逆转录引物、检测引物。 2.根据权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒，其特征在于：所述miRNAs来自外周静脉血的血清。 3.权利要求1所述的早期膀胱癌miRNAs检测试剂盒中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于：包括以下引物：(1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：SEQ ID NO：1：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；SEQ ID NO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：SEQ ID NO：3：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；SEQ ID NO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：SEQ ID NO：5：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；SEQ ID NO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：SEQ ID NO：7：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；SEQ ID NO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：9所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：10所示：SEQ ID NO：9：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；SEQ ID NO：10：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：11所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：12所示：SEQ ID NO：11：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；SEQ ID NO：12：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：13所示：SEQ ID NO：13：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。 4.一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于：包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：(1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：SEQ ID NO：1：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；SEQ ID NO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：SEQ ID NO：3：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；SEQ ID NO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：SEQ ID NO：5：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；SEQ ID NO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：SEQ ID NO：7：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；SEQ ID NO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：9所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：10所示：SEQ ID NO：9：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；SEQ ID NO：10：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：11所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：12所示：SEQ ID NO：11：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；SEQ ID NO：12：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：13所示：SEQ ID NO：13：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。

说明书

技术领域

本发明涉及早期膀胱癌血清miRNAs特异表达谱，其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断技术领域。

背景技术

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，在我国其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤的首位，且近年有逐渐上升的趋势。20％-30％的膀胱癌病人初诊时已发生肌层浸润，而在最初诊断为非侵袭性膀胱癌的病人中，约15％的膀胱癌病人五年内发展为侵袭性膀胱癌。因此，早期诊断和早期治疗是改善膀胱癌预后、降低死亡率的关键。目前，用于膀胱癌的诊断方法主要包括膀胱镜、尿脱落细胞学及影像学检查等。膀胱镜检查虽然具有较高的诊断效能，但该检查方法的有创性限制了其在膀胱癌筛查中的广泛应用；尿液脱落细胞学检查虽特异性较高，但敏感性较低，尤其对低分级肿瘤的敏感性仅为20％～40％，且易受监测这主观因素的影响； CT和超声检查不易发现膀胱内较小的病变，对膀胱癌分期预测具有一定的有限性。寻找临敏感性高和特异性高的早期肿瘤标志物，建立一种安全有效的血清学膀胱癌诊断方法是临床亟待解决的难题。

MicroRNA(miRNAs)是一类广泛分布于真核生物的高度保守的、非蛋白编码的单链小分子 RNAs，通过对靶mRNA降解或翻译抑制，在转录后水平调节靶基因的表达，进而调控细胞分化、生长、代谢和凋亡等功能。以往研究证实，miRNAs在肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展、转移和预后存在密切的联系。近年来研究发现，血清中存在丰富且稳定的miRNAs，通过对比分析肿瘤患者和对照组血清中miRNAs表达谱，发现不同肿瘤具有其特定的miRNAs表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了新的依据。因此，确定膀胱癌miRNAs特异表达谱，筛选差异表达的miRNAs，建立膀胱癌血清miRNAs诊断模型，有助于实现对膀胱癌的早期诊断。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供了膀胱癌患者血清miRNA特异表达谱，及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型，为临床上膀胱癌的早期发现和早期治疗提供支持。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种早期膀胱癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-152,miR-148b-3p以及下调表达的miR-3187-3p，miR-15b-5p,miR-27a-3p，miR-30a-5p构成。

所述miRNAs来自外周静脉血的血清。

所述膀胱癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：

((1)miR-152的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：1所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：2所示：

SEQIDNO：1：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCAAGTTC-3’；

SEQIDNO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATGACAGA-3’；

(2)miR-148b-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：3 所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：4所示：

SEQIDNO：3：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAAAGTT-3’；

SEQIDNO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCAGTGCATCACAGAA-3’；

(3)miR-3187-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：5 所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：6所示：

SEQIDNO：5：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCGCGCAG-3’；

SEQIDNO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTTGGCCATGGGGCT-3’；

(4)miR-15b-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：7所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：8所示：

SEQIDNO：7：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTAAACC-3’；

SEQIDNO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACATCATGG-3’；

(5)miR-27a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：9所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：10所示：

SEQIDNO：9：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGAACT-3’；

SEQIDNO：10：5’-ACACTCCAGCTGGGTTCACAGTGGCTAAGT-3’；

(6)miR-30a-5p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQIDNO：11 所示，前向检测引物的序列如SEQIDNO：12所示：

SEQIDNO：11：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTTCCAGT-3’；

SEQIDNO：12：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTCGAC-3’；

(7)六种miRNAs的通用反向检测引物如SEQIDNO：13所示：

SEQIDNO：13：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。

一种用于早期膀胱癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。

一种早期膀胱癌血清miRNAs诊断模型。具体如下：运用以下公式计算：

logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475* (miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)

公式中的“(miR-152)”、“(miR-148b-3p)”、“(miR-3187-3p)”、“miR-15b-5p)”、 “miR-27a-3p”、“miR-30a-5p”分别表示相对应的miRNAs的表达量。

一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下：首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物测定待诊断患者的血清中六种miRNAs的表达量，包括miR-152，miR-148b-3p， miR-3187-3p，miR-15b-5p,miR-27a-3p和miR-30a-5p，然后，运用下述公式计算：

logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475* (miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)

将六种miRNAs的表达量分别输入Matlab软件(该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件)，若logit(P＝BC)为1，可以判断为膀胱癌；若logit(P＝BC)为0，判断为非膀胱癌。

本发明首先基于临床常规收集的非侵袭性膀胱癌患者、侵袭性膀胱癌患者及对照者血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，采用“miRNAscDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略，对三组血清标本中miRNAs表达谱进行了比对分析，共筛查出26个差异表达miRNAs，序列见表1。然后采用SYBRGreen的逆转录-实时荧光定量PCR方法，对上述26 个差异表达miRNAs在膀胱癌患者及对照血清中的表达丰度进行验证，最终确定了与膀胱癌相关的6个miRNAs，包括表达上调的miR-152,miR-148b-3p以及下调表达的miR-3187-3p， miR-15b-5p,miR-27a-3p，miR-30a-5p，且自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表2。进而，提供了一种诊断膀胱癌的血清miRNAs表达模型：利用多元logistic回归方法提供了一种膀胱癌血清miRNAs诊断模型的计算公式：

logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475* (miR-3187-3p)－0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)

ROC曲线分析显示，此血清miRNAs模型对膀胱癌具有较高的诊断效率，高于传统的尿液脱落细胞学，此模型能够诊断膀胱癌早期患者(Ta和T1)。

附图说明

图1：六种miRNAs在膀胱癌组和对照组中的表达，其中，A：miR-152；B：miR-148b-3p； C：miR-3187-3p；D：miR-15b-5p；E：miR-27a-3p；F：miR-30a-5p。

图2：六种miRNAs对膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A：miR-152；B：miR-148b-3p；C： miR-3187-3p；D：miR-15b-5p；E：miR-27a-3p；F：miR-30a-5p。

图3：建立的诊断模型(panel)及尿液脱落细胞学对膀胱癌的诊断ROC曲线。

图4：建立的诊断模型对不同分期膀胱癌的诊断ROC曲线，其中，A：Ta；B：T1；C：T2-T4。

图2、3、4中，横坐标：特异性；纵坐标：敏感性。

具体实施方式

以下结合实施例和实验对本发明作详细的说明。

实施例一

1、研究对象

血清标本共来自经受试者同意的175例膀胱癌患者(BC)和165例排除泌尿系肿瘤的对照者。所有膀胱癌患者均来自山东大学齐鲁医院(以下称本院)泌尿外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经膀胱镜检查或术后病理检查确认。对照者包括37名前列腺良性增生患者，25名尿路结石患者， 19名膀胱炎患者和84名健康者。其中，获取75名膀胱癌患者、16名前列腺良性增生患者、 13名尿路结石患者、8名膀胱炎患者和38名健康者的尿液标本。所有血清和尿液标本均在患者接受任何药物或手术治疗前取得。

2、标本采集

采集血清3ml，立即1600g离心5分钟，然后16000g离心10分钟，将分离上清液保存于-80℃待测。取3μl分离上清液与3μlRNA分离液混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。留取中段尿15ml，立即1300g离心10min，取沉渣瑞氏染色进行尿液脱落细胞学检查。

4、文库构建和Miseq测序

取冻存样本于常温下解冻，按miRNeasyMiniKit试剂盒(Qiagen公司)操作者说明提取血清总RNA，总RNA浓缩后经T4RNA连接酶作用，分别连接3’-linker和5’-linker，然后通过RT-PCR技术扩增建库。使用KAPAqPCR试剂盒检测文库，若qPCR浓度大于1nM且无dimer污染则确定为检测合格。文库检测符合要求后，通过Miseq测序仪进行深度测序分析。比对分析测序后获得的序列和miRNA数据库(miRBase17.0)中人miRNA序列，获取三组样本已知miRNA的表达丰度。

5、RT-qPCR

使用One StepmiRNA cDNA SynthesisKit逆转录试剂盒(Takara公司) 反转录上述mRNA成cDNA，再进行PCR反应，运行于ABI7500实时荧光定量PCR分析仪(ABI 公司)。

PCR反应体系(25μl)：

模板DNA：2ul

SYBRPremixExTaqⅡ：12.5μl

DyeⅡ：0.5μl

上游引物(10μM)：1μl

下游引物(10μM)：1μl

无菌水：8μl

反应条件为：95℃30秒→1个循环；(95℃5秒，57℃34秒)→45个循环；添加溶解曲线。

每个标本均重复测定三次，miRNA表达量采用2-△△Ct进行分析。

6、数据处理与统计学分析

通过SPSS17.0软件对数据进行统计学分析，使用Mann-WhitneyU非参数检验比较两组样本间miRNAs的浓度差异，P<0.05被认为具有统计学差异。经多元logistic回归分析建立 miRNAs诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断效能采用ROC曲线及曲线下面积AUC分析。

7、检测结果

1)经Miseq测序分析，膀胱癌组与对照组对比共得到26个差异表达的miRNAs(入选标准：在任一组中拷贝数大于50；在膀胱癌组与对照组的表达量差异大于2倍)，其中上调的包括miR-24-3p,miR-128,miR-98,miR-148b-3p,miR-152,miR-30d-5p,miR-1294和let-7c，下调的包括miR-484,let-7b-5p,let-7a-5p,miR-30a-5p,miR-181b-5p,miR-1228-5p, miR-181a-5p,miR-27a-3p,miR-3135b,miR-3187-3p,miR-185-5p,miR-15a-5p,miR-15b-5p, miR-92b-5p,miR-342-3p,miR-148a-3p,miR-501-3p,和let-7i-5p。序列如表1所示(如SEQ IDNO：14～39所示)。

表1 测序筛出的差异miRNAs序列

2)上述26个miRNAs经RT-qPCR验证，以平均Cq值小于35且检测率大于75％；在膀胱癌组和对照组表达差异具有统计学意义，即P<0.05为入选标准，共确定出6个差异表达的 miRNAs，包括miR-152，miR-148b-3p，miR-3187-3p，miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p。检测引物为自主设计，其序列及Tm值如表2所示(如SEQIDNO：1～13所示)。

表2 引物序列

3)如图1所示，miR-152和miR-148b-3p在膀胱癌组表达显著增高，miR-3187-3p， miR-15b-5p，miR-27a-3p和miR-30a-5p表达显著降低。建立上述6个miRNAs各自诊断膀胱癌的ROC曲线，如图2所示。

4)将上述6个miRNAs带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为： logit(P＝BC)＝0.439+0.1775*(miR-152)+0.0767*(miR-148b-3p)－0.475*(miR-3187-3p) －0.2395*(miR-15b-5p)－0.625*(miR-27a-3p)－0.1693*(miR-30a-5p)。经ROC曲线分析，此模型对膀胱癌的诊断效能AUC为0.919，敏感性和特异性分别为94.67％和82.67％，高于传统的尿液脱落细胞学(AUC为0.653，P<0.001)，如图3所示。

5)利用该诊断模型对膀胱癌分期为Ta，T1，T2-T4的患者进行分析，其诊断Ta，T1， T2-T4患者的AUC分别为0.879，0.908和0.952，如图4所示。说明该模型能够实现对膀胱癌的早期诊断。