一种检测肺炎支原体的LAMP试剂盒.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102618655 B (45)授权公告日 2013.08.14 CN 102618655 B *CN102618655B* (21)申请号 201210112439.4 (22)申请日 2012.04.16 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) C12R 1/35(2006.01) (73)专利权人 中国疾病预防控制中心传染病预 防控制所 地址 102206 北京市昌平区昌百路 155 号 (72)发明人 赵飞 张建中 顾一心 陶晓霞 何利华 孟凡亮 肖迪 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理。

2、人 王朋飞 王加岭 (54) 发明名称 一种检测肺炎支原体的 LAMP 试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及生物技术领域， 特别是涉及一种 检测肺炎支原体的 LAMP 试剂盒， 所述试剂盒包含 有4条LAMP引物， 与LAMP反应液一起构成检测体 系， 本发明的 4 条 LAMP 引物的核苷酸序列如 SEQ ID No.1-4 所示。本发明的试剂盒可快速、 灵敏地 检测肺炎支原体， 最低检测限为100个拷贝。 本发 明试剂盒使用方法简单、 成本低廉， 反应结果易于 观察， 特异性好， 非常适用于疾病监测、 现场应急 以及临床标本的检测， 易于大范围推广应用。 (51)Int.Cl. 审查员 徐俊。

3、 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102618655 B CN 102618655 B *CN102618655B* 1/1 页 2 1. 一种用于检测肺炎支原体 （Mycoplasma pneumoniae） 的特异性引物组合， 由以下 4 条引物组成 ： F3 ： 5 -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3 ； B3 ： 5 -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3 ； FIP ： 5 -ACGGCAACACGT。

4、AATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3 ； BIP ： 5 -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3 。 2. 权利要求 1 所述的引物组合在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。 3. 一种含有权利要求 1 所述引物组合的检测试剂。 4. 一种含有权利要求 1 所述引物组合的肺炎支原体的 LAMP 检测试剂盒。 5. 如权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于， 还包含变色指示剂羟基萘酚蓝。 6. 如权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于， 其 25L LAMP 检测体系的具体配置为 ： 10mM dNTP 混合溶。

5、液 2.5l， 3mM 羟基萘酚蓝 1l， 4M 甜菜碱 1l， 8U/l Bst 酶 1l， 10Bst buffer2.5l， 10M F3 引物 0.5l， 10M B3 引物 0.5l， 100M FIP 引物 0.4l， 100M BIP 引物 0.4l， 150mM 硫酸镁 1l， 去核酸水 13.2l， 模板 1l。 7. 如权利要求 4 所述的试剂盒， 其特征在于， 反应条件为 ： 63恒温 1h， 85 3min， 然 后终止反应。 权 利 要 求 书 CN 102618655 B 2 1/8 页 3 一种检测肺炎支原体的 LAMP 试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及生物。

6、技术领域， 具体的说涉及一种检测肺炎支原体的环介导等温扩增 技术 (LAMP) 试剂盒。 背景技术 0002 肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae， Mp)是引起人类呼吸道感染的重要病原菌， 约 10 40的社区获得性肺炎 (CAP) 是由 Mp 感染引起的。婴幼儿由于免疫功能相对低 下， 更容易引起重症 Mp 感染， 甚至引起肺炎支原体脑炎等严重感染。近几年国内报道的 Mp 感染引起的肺炎发病率比重不断升高， 给社会造成的疾病负担日趋明显。鉴于肺炎支原体 分离培养困难， 目前其检测方法主要依靠血清学检测和核酸检测。由于血清学技术主要针 对抗体进行检测， 有明显的滞后性， 且。

7、受个体免疫差异影响大， 所以检测灵敏度和特异度较 差。 0003 随着分子生物学的发展， 目前已有多种 PCR 方法用于肺炎支原体的检测， 包括 ： 普 通 PCR， 巢式 PCR， 荧光 PCR 等， 这些虽在灵敏度方面有所改进， 但由于核酸检测需要较严格 的检测环境， 需要精密仪器的配套使用， 检测费用较高， 同样也无法满足基层和现场检测的 需求。 0004 环介导等温核酸扩增技术(loop-mediated isotherm amplification， LAMP)是由 Notomi于2000年开发的一种新型的恒温核酸扩增方法， 其原理是利用一种链置换DNA聚合 酶(BstDNA pol。

8、ymerase)和两对特殊的引物， 特异地识别靶序列上的6个独立区域， 在等温 条件下 (65左右 ) 保温几十分钟， 即可完成核酸扩增反应。近年来， 国外已将该技术广泛 应用于病原体检测。Hong TC 等人 (2004) 根据 LAMP 的原理设计了实时定量 LAMP 方法， 以 快速检测 SARS-CoV， 结果 LAMP 的灵敏度是 RT-PCR 的 100 倍 ； Masaki Imai 等人 (2007) 建 立了快速诊断 H5N1 禽流感病毒的 LAMP 检测体系。 0005 LAMP还可以检测细菌、 真菌等病原微生物， 其灵敏度和特异性都有很好的体验。 但 目前尚未见基于颜色判。

9、定的 LAMP 方法在肺炎支原体检测中的应用。 发明内容 0006 本发明的目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性 LAMP 引物组。 0007 本发明另一目的在于提供一种具有高灵敏度、 高特异性、 可视化的、 操作简单的 LAMP 检测试剂盒。 0008 本发明提供了一种用于检测肺炎支原体 (Mycoplasma pneumoniae) 的靶序列， 其 具有 SEQ ID NO.5 所示的序列或其特异性片段。 0009 本发明提供了用于扩增 SEQ ID NO.5 所示靶序列的特异性引物组合。 0010 本发明提供了一种用于检测肺炎支原体的特异性LAMP引物组合， 包括以下4条引 物 ： 00。

10、11 F3 ： 5 -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3 ； 说 明 书 CN 102618655 B 3 2/8 页 4 0012 B3 ： 5 -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3 ； 0013 FIP ： 5 -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTCAAGGTCCCCAA-3 ； 0014 BIP ： 5 -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3 。 0015 本发明提供了上述引物组在制备肺炎支原体的检测试剂盒或检测试剂中的应用。 0016 本发明提供了一种含有上述 4 条引物的检测试剂。 0017 本。

11、发明提供了一种含有上述 4 条引物的肺炎支原体的 LAMP 检测试剂盒。 0018 本发明的试剂盒还包含变色指示剂羟基萘酚蓝 (HNB)。 0019 本发明还提供了上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用。 0020 上述试剂盒在检测肺炎支原体中的应用中， 25L LAMP 检测体系的具体配置为 ： 10mM dNTP 混合溶液 2.5l， 3mM 羟基萘酚蓝 1l， 4M 甜菜碱 1l， 8U/l Bst 酶 1l， 10Bst buffer2.5l， 10M F3 引物 0.5l， 10M B3 引物 0.5l， 100M FIP 引物 0.4l， 100M BIP 引物 0.4l， 150mM。

12、 硫酸镁 1l， 去核酸水 13.2l， 模板 1l。 0021 进一步地， 检测反应条件为 ： 63恒温 1h， 85 3min， 然后终止反应。 0022 本发明试剂盒还包含阴性对照和阳性对照， 所述阴性对照为去核酸水， 所述阳性 对照为肺炎支原体基因组 DNA。每次检测标本时必须设立 NEG 对照 ( 阴性对照 ) 和 POS 对 照 ( 阳性对照 )， 两种对照对于结果判读起决定性作用 ： 0023 有效扩增 ： NEG(-) 和 POS(+) 0024 无效扩增 ： NEG(+) 和 POS(+) 提示体系污染 0025 无效扩增 ： NEG(-) 和 POS(-) 提示体系错误或者。

13、试剂失效。 0026 只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信， 否则试验需要重复。 0027 结果判定方法为 ： 反应结束后， 肉眼直接观测反应管， 深蓝色体系为阴性结果 ( 图 1 右 )， 天蓝色体系为阳性结果 ( 图 1 左 )。 0028 本发明的肺炎支原体LAMP检测试剂盒对20种呼吸道常见菌株进行检测用于评价 该试剂盒的特异性， 同时对肺炎支原体进行检测下限的确定。 结果显示， 利用该方法检测59 株肺炎支原体均阳性， 其余 20 种非肺炎支原体和人类染色体均扩增阴性， 说明该方法的灵 敏度、 特异性良好， 达 100。在对纯菌检测中， 本发明 LAMP 试剂盒的最低检测限为 。

14、100 个 拷贝， 说明本发明的检测试剂盒具有很高的灵敏度。 0029 本发明提供的试剂盒使用颜色变化代替浊度变化判定结果， 易于观察 ； 使用的变 色指示剂为羟基萘酚蓝 (HNB) 价格便宜， 比使用荧光指示剂的 LAMP 反应更加经济实惠 ； 且 变色指示剂 HNB 性质稳定， 在反应前添加， 避免了荧光指示剂在检测后打开反应管添加， 增 加了污染的可能性。 本发明LAMP检测试剂盒检测肺炎支原体整个试验只需要1h左右即可， 相对于常规 PCR 反应要 2 4h 才能完成检测， 大大缩短了检测时间， 本发明试剂盒可快速、 灵敏地检测出肺炎支原体， 其操作简单、 成本低廉， 反应结果易于观察。

15、， 特异性好， 非常适用 于疾病监测、 现场应急以及临床标本的检测， 易于大范围推广应用。 附图说明 0030 图 1 为体系检测结果判定 ； 体系检测结果判定。反应结束后肉眼根据体系颜色直 接判定实验结果， 天蓝色 ( 左图 ) 为阳性， 深蓝色 ( 右图 ) 为阴性。 0031 图 2 为体系检测限评价， 以肺炎支原体标准菌株 ATCC15531 模板系列浓度梯度 1 说 明 书 CN 102618655 B 4 3/8 页 5 拷贝 /l-105拷贝 /l 为模板， 每个浓度梯度取 1l 检测， 其中 0-2 为深蓝色， 3-7 为天 蓝色。 0 ： 阴性对照 ； 1 ： 1拷贝 ； 2。

16、 ： 10拷贝 ； 3 ： 102拷贝 ； 4 ： 103拷贝 ； 5 ： 104拷贝 ； 6 ： 105拷贝 ； 7 ： 阳性对照。 具体实施方式 0032 以下实施例进一步说明本发明的内容， 但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明 的范围。 0033 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0034 实施例 1 引物的设计 0035 本发明首先在国内分离到 60 株肺炎支原体临床株， 并将这 60 株肺炎支原体的 p1 基因全长进行扩增测序。通过对 60 株国内肺炎支原体。

17、 p1 基因和 NCBI 数据库已报道的 p1 基因序列比对， 选取 p1 基因中最为保守的区域使用 Primer Explorer V3 软件设计特异性 引物。该保守区域的特异性靶序列如 SEQ ID No.5 所示的核苷酸序列。 0036 设计 4 条引物， 包括两条内引物 (FIP 和 BIP) 和两条外引物 (F3 和 B3)， 其核酸序 列如下 ： 0037 F3 ： 5 -TCTTACCACTGTTAACGGCC-3 ； 0038 B3 ： 5 -CCGCTTTGGTCAACACATCA-3 ； 0039 FIP ： 5 -ACGGCAACACGTAATCAGGTCATCCAGTC。

18、AAGGTCCCCAA-3 ； 0040 BIP ： 5 -AGGACTTGCCATTGGAATCCCAGATAGCGCAAACCCAGCC-3 。 0041 实施例 2 肺炎支原体 LAMP 检测方法的建立 0042 通过设置不同浓度的 MgSO4(150mM) ： 0l， 0.5l， 1l， 1.5l， 2l ； 不同浓 度的甜菜碱 (4M) ： 0l， 1l， 2l， 4l， 8l， 16l ； 以及实施例 1 得到的 4 个引物浓 度， FIP/BIP 引物 (100uM) ： 0.2l， 0.4l， 0.8l， 1.6l ； F3/B3 引物 (10M) ： 0.5l， 1.0l， 。

19、1.5l， 2.0l。其它条件选择实验过程的优选试验条件。 0043 分别在不同的温度(61至65)反应1h， 853min， 终止反应， 由于在65反应 1h 的条件下扩增最快， 优选在此条件下进行反应。 0044 在 63反应 1h， 85 3min， 对不同浓度的 MgSO4、 Betaine 和内外引物浓度比例的 反应体系进行优化反应， 最终通过对含有 103拷贝的肺炎支原体标准菌株 ATCC15531 模板 扩增效果作为反应的最终浓度， 结果为， FIP/BIP 引物终浓度为 1.6uM， F3/B3 引物终浓度为 0.2M， MgSO4终浓度为 6mM， 甜菜碱终浓度为 0.16M。

20、 时体系扩增效果最好， 体系优化可参见 表 1， 表 2。 0045 表 1LAMP 扩增体系硫酸镁与甜菜碱试剂浓度优化 0046 0047 说 明 书 CN 102618655 B 5 4/8 页 6 0048 使用浓度 103拷贝的 ATCC15531 模板标准品优化扩增体系。每个反应重复 3 次， “+” 为三次全阳性结果，“-” 为三次全阴性结果，“” 为 3 次扩增有阳性也有阴性结果。提 示体系硫酸镁 1l( 终浓度 6mM)， 甜菜碱 1l(0.16M) 体系扩增最稳定。 0049 表 2LAMP 扩增体系内外引物浓度优化 0050 0051 使用浓度 103拷贝的 ATCC155。

21、31 模板标准品优化扩增体系。每个反应重复 3 次， “+” 为三次全阳性结果，“-” 为三次全阴性结果，“” 为 3 次扩增有阳性也有阴性结果。提 示 FIP/BIP 引物 0.4l( 终浓度 1.6uM)， F3/B3 引物 0.5l(0.2uM) 体系扩增最稳定。 0052 因此， 得到优化的检测体系 (25L) 如下 ： 0053 0054 检测反应条件 ： 63恒温 1h， 85 温度 3min， 终止反应。 0055 反应结束后根据体系颜色肉眼直接判定实验结果， 体系天蓝色为阳性结果， 深蓝 色为阴性结果 ( 见图 1)。 0056 实施例 3LAMP 检测试剂盒特性评价 0057。

22、 1、 灵敏度评价 0058 灵敏度 (sensitivity)， 又称真阳性率 (true positive rate)， 即实际上是肺炎 说 明 书 CN 102618655 B 6 5/8 页 7 支原体并按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的肺炎支 原体基于颜色判定 LAMP 体系检测 9 株 ATCC 标准株 (ATCC39505， ATCC15531， ATCC29085， ATCC29342， ATCC29343， ATCC15377， ATCC15492， ATCC49894， ATCC15293) 和实验室保存的 50 株肺炎支原体临床分离株DNA。 。

23、除阴性对照外， 所有59株肺炎支原体基于颜色判定LAMP体 系检测结果呈阳性， 灵敏度达 100。 0059 2. 特异度评价 0060 特异度(specificity)， 又称真阴性率(true negative rate)， 即实际上不是肺炎 支原体而按照该检测方法的标准被正确地判为肺炎支原体的百分比。用优化了的基于颜 色判定 LAMP 体系检测呼吸道常见菌株 20 种及人类染色体 ( 表 3)， 以肺炎支原体标准菌株 ATCC15531模板为阳性对照。 结果除阳性对照外， 其余21种非肺炎支原体模板均为阴性， 特 异度达 100。 0061 表 3 基于颜色判定 LAMP 试剂盒特异性所。

24、用的 DNA 0062 0063 0064 ATCC ： 美国模式培养物集存库 0065 3、 检测下限的评价 0066 本实施例以该优化的检测方法 ( 见实施例 2 结果 ) 对一系列倍比稀释的阳性模板 进行检测。以肺炎支原体标准菌株 ATCC15531 模板系列浓度梯度 1 拷贝 /l-105拷贝 / l 为模板， 每个浓度梯度取 1l 检测。按照优化的反应体系和反应条件进行基于颜色判 说 明 书 CN 102618655 B 7 6/8 页 8 定 LAMP 检测， 每个浓度梯度做 3 个平行样。该基于颜色判定 LAMP 检测体系的检测限为 100 个拷贝 ( 图 2)。 0067 实施。

25、例 4LAMP 检测试剂盒临床标本实际应用评价 0068 使 用 本 发 明 基 于 颜 色 判 定 LAMP 检 测 试 剂 盒 与 已 报 道 的 普 通 PCR 方 法 (Development of a Genomics-Based PCR Assay for Detection of Mycoplasma pneumoniae in a Large Outbreak in New York State.ALFRED L.WARING， JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY， Apr.2001， 1385-1390)分别检测60份临床咽拭子标本。 检测结果 。

26、见表4。 本发明试剂盒标本检测阳性率为31.7(19/60)， 普通PCR方法的阳性率为20.0 (12/60)， 经统计学计算两种方法阳性率存在显著性差异 (0.01 P 0.05， 卡方 5.14)， 说明本发明试剂盒对于临床标本检测能力优于普通 PCR 方法。 0069 表 4 基于颜色判定 LAMP 检测与普通 PCR 方法对 60 份临床标本检测结果 说 明 书 CN 102618655 B 8 7/8 页 9 0070 0071 0072 注 ： + 检测阳性， - 检测阴性 说 明 书 CN 102618655 B 9 8/8 页 10 0073 实施例 5 肺炎支原体常用检测方。

27、法比较 0074 本实施例对肺炎支原体的几种常用检测方法进行了比较， 包括普通 PCR、 荧光 PCR、 血清学试剂盒和本发明的 LAMP 检测试剂盒， 通过综合比较发现 ( 见表 5)， 本发明的基 于颜色判定 LAMP 检测技术是一种灵敏度较高， 方便， 快速的肺炎支原体检测技术。其成本 费用低廉， 易于操作， 非常适用于基层单位和疾控系统应对大量检测任务及现场突发事件。 0075 表 5 常见肺炎支原体检测 0076 0077 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。 说 明 书 CN 102618655 B 10 1/2 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102618655 B 11 2/2 页 12 序 列 表 CN 102618655 B 12 1/1 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102618655 B 13 。