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基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备和应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811120191.X (22)申请日 2018.09.26 (71)申请人湘潭大学地址 411105 湖南省湘潭市湘潭大学化学学院 (72)发明人李春艳江文丽 (51)Int.Cl. C07D 491/107(2006.01) C09K 11/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备和应用 (57)摘要本发明涉及了一种基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮(NO)荧光探针的制备和应用，该。

2、荧光探针的结构式为：本发明提供了以罗丹明B、邻苯二胺、氢化铝锂等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种快速响应、高选择性的一氧化氮荧光探针；首先，该荧光探针与NO作用迅速，响应时间在40秒以内；其次，该荧光探针对NO表现出很高的选择性，不受脱氢抗坏血酸(DHA)、抗坏血酸(AA)、丙酮醛 (MGO)的干扰；并且，该荧光探针对NO表现出很高的灵敏度，荧光强度增强170倍；此外，该荧光探针已成功应用于细胞成像研究，可以检测细胞内 NO含量的变化。权利要求书1页说明书5页附图4页 CN 109180695 A 2019.01.11 C。

3、N 109180695 A 1.基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的结构如下：。 2.根据权利要求1所述的基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下： 1）在含有30 mL二氯甲烷的100 mL的圆底烧瓶中加入1当量的罗丹明B， 5当量的邻苯二胺和1当量的卡特缩合剂，在室温下搅拌1014小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:13:1的CH2Cl2/CH3COOC2H5的洗脱剂柱层析分离得白色固体，即化合物RB-OPD，其结构如下： 2）在100 mL圆底烧瓶中，将0.5当量的化合物RB-OPD， 5当量的氢化铝锂溶于无水TH。

4、F 中，室温下，在氮气中搅拌1014小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100 mL蒸馏水，反应混合物用100 mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:13:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为所述的荧光探针。 3.根据权利要求1所述的基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针已成功应用于细胞成像研究，可以检测细胞内一氧化氮含量的变化。权利要求书 1/1 页 2 CN 109180695 A 2 基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的。

5、制备和应用技术领域 0001 本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备和应用。背景技术 0002 一氧化氮(NO)是一种重要的气体信号分子，在不同的生理和病理过程中扮演重要角色(S.Moncada,E.A.Higgs,Eur.J.Clin.Chem.,1991,21 361-374)。通过一氧化氮合酶 (NOS)产生的内生源一氧化氮与多种生理过程紧密相关(D.J.Stuehr,J.Santolini, Z.Q.Wang,C.C.Wei,S.Adak,J.Biol.Chem.,2004,279,36167-36170)，比如：一氧化氮可作为信。

6、号分子参与信号传导过程(D.A.Wink,J.B.Mitchell,Free Radical Biol.Med.,1998, 25,434-456； V.Calabrese,C.Mancuso,M.Calvani,E.Rizzarelli,D.A.Butterfield, A.M.G.Stella,Nat.Rev.Neurosci.,2007,8,766)；而且，一氧化氮也可作为内皮衍生舒张因子，参与心血系统的调节和平滑肌舒张(A.de Mel,F.Murad,A.M.Seifalian,Chem.Rev., 2011,111,5742-5767； J.Loscalzo,Circ.Re。

7、s.,2001,88,756-762.)。此外，水平异常的一氧化氮导致活性氮的产生，与一些疾病相关，比如：癌症，炎症，内皮功能障碍和神经退行性疾病(D.Fukumura,S.Kashiwagi,R.K.Jain,Nat.Rev.Cancer,2006,6,521； P.Pacher, J.S.Beckman,L.Liaudet,Physiol.Rev.,2007,87,315-424； A.G.Tennyson,S.J.Lippard, Chem.Biol.,2011,18,1211-1220)。由于一氧化氮有着重要的生理及临床意义，因此设计有效的方法去准确检测它的含量。

8、就显得非常必要。 0003 目前有许多检测NO的方法，比如：比色法(X.Q.Chen,F.Wang,J.Y.Hyun,T.Wei, J.Qiang ,X.Ren,I.Shin,J.Yoon,Chem.Soc.Rev.,2016,45,2976-3016)，电化学法 (M .M .Musameh ,C .J .Dunn ,M .H .Uddin ,T .D .Sutherland ,T .D .Rapson , Biosens.Bioelectron.,2018,103,26-31)，电子自旋共振波谱法(N.Hogg,Free Radical Biol.Med.,2010,49,122-。

9、129)和化学发光法(J.N.Bates,Neuroprotocols,1992,1,141- 149)。相比于这些传统的方法，荧光分析方法更简单，灵敏，高效，并且能对生物体内外的检测进行实时监控。到目前为止，有许多检测NO的荧光探针被报道(M.Yang,J.Fan,J.Zhang, J .Du ,X .Peng ,Chem .Sci .,2018 ,9 ,6758-6764； S .-T .Wang ,Y .Lin ,C .D .Spicer , M.M.Stevens,Chem.Commun.,2015,51,11026-11029； Y.-Q.Sun,J.Liu,H.Zh。

10、ang,Y.Huo, X.Lv,Y.Shi,W.Guo,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,12520-12523； P.Zhang,Y.Tian,H.Liu, J.Ren,H.Wang,R.Zeng,Y.Long,J.Chen,Chem.Comm.,2018,54,7231-7234)。但是，这些探针存在一些问题： (1)以前所报道的这些探针选择性较低，探针与脱氢抗坏血酸，抗坏血酸，丙酮醛反应生成具有荧光的喹喔啉或杂环化合物； (2)这些荧光探针具有相对较长的响应时间，反应时间在5分钟以上。因此，设计和合成具有高选择性且快速响应的荧光探针是非常有意义的。。

11、0004 罗丹明衍生物是荧光探针领域中应用最广泛的一类染料，具有极好的光学性质。最为关键的是，罗丹明的内酰胺螺环状结构没有荧光，破坏这种环状结构后能够引起荧光说明书 1/5 页 3 CN 109180695 A 3 发射增强。由于结构上的优势，罗丹明内酰胺类化合物是理想的OFF-ON型荧光分子探针，从而实现对分析物高灵敏度的荧光检测。据我们所知，罗丹明类荧光探针已经被广泛地用来检测各种分析物(X.Zheng,R.Ji,X.Cao,Y.Ge,Anal.Chim.Acta,2017,978,48-54； J.Tang, Z.Guo,Y.Zhang,B.Bai,W.-H.Zh。

12、u,Chem.Comm.,2017,53,10520-10523； D.Wu,J.-C.Ryu, Y.W.Chung,D.Lee,J.-H.Ryu,J.-H.Yoon,J.Yoon,Anal.Chem.,2017,89,10924-10931； Q.Wang,X.Jiao,C.Liu,S.He,L.Zhao,X.Zeng,J.Mater.Chem.B,2018,6,4096-4103)。虽然脱氧罗丹明具有与罗丹明相似的化学性质，但是以脱氧罗丹明作为荧光团用来检测仍鲜有报道(X.Wu,Z.Wu,Y.Yang,S.Han,Chem.Commun.,2012,48,1895-1897； L.。

13、He,X.Yang,M.Ren, X.Kong,Y.Liu,W.Lin,Chem.Commun.,2016,52,9582-9585)。因此设计和合成一个脱氧罗丹明类探针来检测NO是非常必要的。发明内容 0005 根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了基于脱氧罗丹明的快速响应，高选择性的一氧化氮荧光探针。 0006 本发明的技术方案是，一种基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针，其结构式如下： 0007 基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备方法。步骤如下： 0008 1)在含有30mL二氯甲烷的100mL的圆底烧瓶中加入1当量的罗丹明B，。

14、 5当量的邻苯二胺和1当量的卡特缩合剂，在室温下搅拌1014小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用 CH2Cl2/CH3COOC2H5体积比约为5:13:1的洗脱剂进行柱层析，得到白色固体(RB-OPD)(产率 73)。 2)在100mL圆底烧瓶中，将0.5当量的化合物RB-OPD， 5当量的氢化铝锂溶于无水THF 中，室温下，在氮气中搅拌1014小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100mL蒸馏水，反应混合物用100mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用CH2Cl2/CH3CH2OH体积比约为5:13:1的洗。

15、脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为荧光探针。 0009 基于罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的性能研究。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，加入NO之前，荧光探针没有罗丹明的荧光发射峰，说明探针分子处于内酰胺闭环结构；随着NO的加入，在590nm处出现了罗丹明的最大发射峰，并且随着NO浓度的增大，探针分子的荧光强度不断增强，当加入25 M NO时，荧光强度增强170倍，说明该探针可以高灵敏的对NO进行检测。该探针的检测范围从0.005 M到25 M，检测限为1.7nM，这说明该探针可以高灵敏的检测NO。其次，还研究了探针对活性氮(ONOO-,NO。

16、2-,NO3-)，活性氧(HClO,H2O2,OH, O2-)， DHA,AA,MGO，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)和金属离子(K+,Mg2+,Ca2+,Na+,Zn2+)的荧光响应情况。结果发现，只有NO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响，这说明该探针具有很好的选择性。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在40秒以内。说明书 2/5 页 4 CN 109180695 A 4 0010 基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的应用。在细胞中加入荧光探针，有红色微弱荧光，这说明细胞中的NO含量较低。细胞用脂多糖(LPS)处理，刺激。

17、细胞内NO的产生，然后用探针染色，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。细胞用氨基胍盐酸盐(AG)处理，抑制细胞内NO的产生，发现细胞内红色荧光大大减弱。这些结果说明荧光探针dRB-OPD 能监控细胞内NO含量的变化，这为监控人体内和一氧化氮相关病变提供一种可靠的手段。附图说明 0011 图1为荧光探针的合成路线。 0012 图2为荧光探针与不同浓度的NO作用后的荧光光谱图。 0013 横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10 M， DEANONOate(NO 释放剂)浓度分别为： 0,0.005,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0。

18、,16.0,18.0,20.0,22.0, 24.0,25.0 M。荧光激发波长为550nm。 0014 图3为荧光探针对不同NO浓度的荧光线性响应图。 0015 图4为荧光探针与NO作用后的紫外可见吸收光谱图。 0016 横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度均为10 M， DEANONOate浓度为 25 M。 0017 图5为荧光探针的选择性图。 0018 荧光探针的浓度均为10 M， DEANONOate浓度为25 M，其它分析物浓度均为200 M。 0019 图6为荧光探针与NO作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。 0020 图7为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓。

19、度，纵坐标为细胞的存活率。 0021 图8荧光探针与NO作用的细胞成像图。 (a)细胞用探针染色10min。 (b)细胞用LPS和处理12h，然后用探针染色10min。 (c)细胞用LPS和AG处理12h，然后用探针染色10min。具体实施方式 0022 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。 0023 实施例1： 0024 荧光探针的合成 0025 合成路线如图1。化合物RB-OPD的合成：在含有30mL二氯甲烷的100mL的圆底烧瓶中加入罗丹明B(0.48g,1.0mmol)，邻苯二胺(0.54g,5.0mmol)和卡特缩合剂(0.44g, 1.0m。

20、mol)，在室温下搅拌1014小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:13:1的 CH2Cl2/CH3COOC2H5的洗脱剂柱层析分离得白色固体(0.39g，产率:73)，即为化合物RB- OPD。 0026 NO荧光探针dRB-OPD的合成：在100mL圆底烧瓶中，将化合物RB-OPD(0.27g , 0.50mmol)和氢化铝锂(0.19g,5.0mmol)溶于无水THF中，室温下，在氮气中搅拌1014小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100mL蒸馏水，反应混合物用100mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除。

21、去溶剂，粗产品用体积比约为 5:13:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物0.11g(42)，即为所述的荧光探针。 1H NMR(400MHz,CDCl3) 7.46(d,J6.8Hz,1H),7.41(t,J8.4Hz,1H),7.34 说明书 3/5 页 5 CN 109180695 A 5 (t,J7.2Hz,1H),7.11(d,J7.6Hz,1H),6.70-6.84(m,4H),6.49(d,J7.6Hz,1H),6.44 (d,J8.4Hz,2H),6.32(s,2H),6.20(d,J8.0Hz,1H),4.43(s,2H),3.71(s。

22、,2H),3.37(d,J 6.8Hz,8H) ,1.17(t,J7.2Hz,12H) .13C NMR(100MHz,CDCl3) 154.4,149.3,140.9, 134.8,132.6,131.0,129.8,128.9,127.5,125.7,120.2,117.9,116.7,115.4,112.7, 108.7,98.1,65.6,58.3,44.7,12.6.MS(TOF)m/z 519.4. 0027 实施例2： 0028 荧光探针和NO溶液配制 0029 探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成110-4M的探针溶液。 NO溶液的配制：将一定量的DE。

23、ANONOate溶解在0.1M NaOH溶液后，转移到500mL的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.010-2molL-1的DEANONOate。将1.010-2molL-1 的DEANONOate溶液逐渐稀释，得到1.010-3-1.010-8molL-1的DEANONOate水溶液。将1.0mL探针的备用溶液和1.0mL的DEANONOate水溶液加入到10mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.010-5molL-1的荧光探针和1.010-4-1.010-9molL-1的NO 混合待测溶液。 0030 实施例3： 0031 荧光探针与NO作用的荧光光谱的测。

24、定 0032 图2为荧光探针与NO作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为10 M， NO的浓度依次为0, 0.005,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,22.0,24.0,25.0 M。激发波长固定为550nm，发射波长范围为560640nm，狭缝宽度为5.0nm/5.0nm。所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图3可以看出，加入NO之前，荧光探针在590nm处有较弱的荧光发射峰。随着NO的加入，在590nm处发射峰大幅度的增强，并且随着NO浓度的增大，探针的荧光强度不断增强，当加入25 M的。

25、NO时，荧光强度增强至未加入NO时的170倍。这是因为探针分子的邻苯二胺与NO反应生成苯三唑化合物,探针结构从罗丹明的闭环形式转变为开环形式。图3为探针对不同NO浓度的线性响应图，荧光强度跟NO的浓度呈现线性关系，线性范围是5.010-92.510-5M，检测限是1.710-9M。这说明该探针可以高灵敏的检测NO。 0033 实施例4： 0034 荧光探针与NO作用的紫外可见吸收光谱的测定 0035 图4为荧光探针与NO作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10 M， NO的加入量为25 M。从图4中可以看出，没有加入NO时，探针在550nm处有较弱的吸收峰。

26、，加入NO 之后，在该处的吸收峰大幅度增强。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。 0036 实施例5： 0037 荧光探针对NO测定的选择性 0038 图5为荧光探针对NO测定的选择性图。考察在浓度为10 M的荧光探针溶液中加入 NO(25 M)及其活性氮(ONOO-,NO2-,NO3-)，活性氧(HClO,H2O2,OH,O2-)， DHA,AA,MGO，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)和金属离子(K+,Mg2+,Ca2+,Na+,Zn2+)(200 M)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有NO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针。

27、的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对NO有较好的选择性。 0039 实施例6：说明书 4/5 页 6 CN 109180695 A 6 0040 荧光探针与NO作用的响应时间的测定 0041 我们研究了荧光探针对NO的响应时间，其结果如图6。从图中可以看出，该探针对 NO的响应时间不到40秒，这能够满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。从图6我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。 0042 实施例7： 0043 荧光探针在活细胞中的应用 0044 首先，我们做了细胞毒性试。

28、验，如图7所示。当加入030 M NO探针，细胞的成活率均在91以上，因此可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的NO。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择巨噬细胞RAW264.7进行共聚焦显微成像，结果如图8所示。在细胞中加入荧光探针，能检测到微弱的红色荧光信号，这说明细胞中的NO含量较低(图8a)。文献报道脂多糖(LPS)可以刺激小鼠巨噬细胞释放NO。细胞用LPS预先处理12 小时，然后用探针染色10min，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号(图8b)；细胞用AG 处理12h，然后用探针染色10min，细胞内没有荧光(图8c)。这些结果说明荧光探针能监控细胞内NO含量的变化，这为监控人体内和一氧化氮相关病变提供一种可靠的手段。说明书 5/5 页 7 CN 109180695 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 109180695 A 8 图3 图4 说明书附图 2/4 页 9 CN 109180695 A 9 图5 图6 说明书附图 3/4 页 10 CN 109180695 A 10 图7 图8 说明书附图 4/4 页 11 CN 109180695 A 11 。

摘要
申请专利号：	CN201811120191.X	申请日：	20180926
公开号：	CN109180695A	公开日：	20190111
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C07D491/107,C09K11/06,G01N21/64	主分类号：	C07D491/107,C09K11/06,G01N21/64
申请人：	湘潭大学
发明人：	李春艳,江文丽
地址：	411105 湖南省湘潭市湘潭大学化学学院
优先权：	CN201811120191A
专利代理机构：		代理人：
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内容摘要

本发明涉及了一种基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮(NO)荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构式为：本发明提供了以罗丹明B、邻苯二胺、氢化铝锂等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种快速响应、高选择性的一氧化氮荧光探针；首先，该荧光探针与NO作用迅速，响应时间在40秒以内；其次，该荧光探针对NO表现出很高的选择性，不受脱氢抗坏血酸(DHA)、抗坏血酸(AA)、丙酮醛(MGO)的干扰；并且，该荧光探针对NO表现出很高的灵敏度，荧光强度增强170倍；此外，该荧光探针已成功应用于细胞成像研究，可以检测细胞内NO含量的变化。

权利要求书

1.基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的结构如下：。 2.根据权利要求1所述的基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：1）在含有30mL二氯甲烷的100mL的圆底烧瓶中加入1当量的罗丹明B，5当量的邻苯二胺和1当量的卡特缩合剂，在室温下搅拌10~14小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:1~3:1的CHCl/CHCOOCH的洗脱剂柱层析分离得白色固体，即化合物RB-OPD，其结构如下：2）在100mL圆底烧瓶中，将0.5当量的化合物RB-OPD，5当量的氢化铝锂溶于无水THF中，室温下，在氮气中搅拌10~14小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100mL蒸馏水，反应混合物用100mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:1~3:1的CHCl/CHCHOH洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为所述的荧光探针。 3.根据权利要求1所述的基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针已成功应用于细胞成像研究，可以检测细胞内一氧化氮含量的变化。

说明书

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备和应用。

背景技术

一氧化氮(NO)是一种重要的气体信号分子，在不同的生理和病理过程中扮演重要角色(S.Moncada,E.A.Higgs,Eur.J.Clin.Chem.,1991,21 361-374)。通过一氧化氮合酶(NOS)产生的内生源一氧化氮与多种生理过程紧密相关(D.J.Stuehr,J.Santolini,Z.Q.Wang,C.C.Wei,S.Adak,J.Biol.Chem.,2004,279,36167-36170)，比如：一氧化氮可作为信号分子参与信号传导过程(D.A.Wink,J.B.Mitchell,Free Radical Biol.Med.,1998,25,434-456；V.Calabrese,C.Mancuso,M.Calvani,E.Rizzarelli,D.A.Butterfield,A.M.G.Stella,Nat.Rev.Neurosci.,2007,8,766)；而且，一氧化氮也可作为内皮衍生舒张因子，参与心血系统的调节和平滑肌舒张(A.de Mel,F.Murad,A.M.Seifalian,Chem.Rev.,2011,111,5742-5767；J.Loscalzo,Circ.Res.,2001,88,756-762.)。此外，水平异常的一氧化氮导致活性氮的产生，与一些疾病相关，比如：癌症，炎症，内皮功能障碍和神经退行性疾病(D.Fukumura,S.Kashiwagi,R.K.Jain,Nat.Rev.Cancer,2006,6,521；P.Pacher,J.S.Beckman,L.Liaudet,Physiol.Rev.,2007,87,315-424；A.G.Tennyson,S.J.Lippard,Chem.Biol.,2011,18,1211-1220)。由于一氧化氮有着重要的生理及临床意义，因此设计有效的方法去准确检测它的含量就显得非常必要。

目前有许多检测NO的方法，比如：比色法(X.Q.Chen,F.Wang,J.Y.Hyun,T.Wei,J.Qiang,X.Ren,I.Shin,J.Yoon,Chem.Soc.Rev.,2016,45,2976-3016)，电化学法(M.M.Musameh,C.J.Dunn,M.H.Uddin,T.D.Sutherland,T.D.Rapson,Biosens.Bioelectron.,2018,103,26-31)，电子自旋共振波谱法(N.Hogg,Free Radical Biol.Med.,2010,49,122-129)和化学发光法(J.N.Bates,Neuroprotocols,1992,1,141-149)。相比于这些传统的方法，荧光分析方法更简单，灵敏，高效，并且能对生物体内外的检测进行实时监控。到目前为止，有许多检测NO的荧光探针被报道(M.Yang,J.Fan,J.Zhang,J.Du,X.Peng,Chem.Sci.,2018,9,6758-6764；S.-T.Wang,Y.Lin,C.D.Spicer,M.M.Stevens,Chem.Commun.,2015,51,11026-11029；Y.-Q.Sun,J.Liu,H.Zhang,Y.Huo,X.Lv,Y.Shi,W.Guo,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,12520-12523；P.Zhang,Y.Tian,H.Liu,J.Ren,H.Wang,R.Zeng,Y.Long,J.Chen,Chem.Comm.,2018,54,7231-7234)。但是，这些探针存在一些问题：(1)以前所报道的这些探针选择性较低，探针与脱氢抗坏血酸，抗坏血酸，丙酮醛反应生成具有荧光的喹喔啉或杂环化合物；(2)这些荧光探针具有相对较长的响应时间，反应时间在5分钟以上。因此，设计和合成具有高选择性且快速响应的荧光探针是非常有意义的。

罗丹明衍生物是荧光探针领域中应用最广泛的一类染料，具有极好的光学性质。最为关键的是，罗丹明的内酰胺螺环状结构没有荧光，破坏这种环状结构后能够引起荧光发射增强。由于结构上的优势，罗丹明内酰胺类化合物是理想的OFF-ON型荧光分子探针，从而实现对分析物高灵敏度的荧光检测。据我们所知，罗丹明类荧光探针已经被广泛地用来检测各种分析物(X.Zheng,R.Ji,X.Cao,Y.Ge,Anal.Chim.Acta,2017,978,48-54；J.Tang,Z.Guo,Y.Zhang,B.Bai,W.-H.Zhu,Chem.Comm.,2017,53,10520-10523；D.Wu,J.-C.Ryu,Y.W.Chung,D.Lee,J.-H.Ryu,J.-H.Yoon,J.Yoon,Anal.Chem.,2017,89,10924-10931；Q.Wang,X.Jiao,C.Liu,S.He,L.Zhao,X.Zeng,J.Mater.Chem.B,2018,6,4096-4103)。虽然脱氧罗丹明具有与罗丹明相似的化学性质，但是以脱氧罗丹明作为荧光团用来检测仍鲜有报道(X.Wu,Z.Wu,Y.Yang,S.Han,Chem.Commun.,2012,48,1895-1897；L.He,X.Yang,M.Ren,X.Kong,Y.Liu,W.Lin,Chem.Commun.,2016,52,9582-9585)。因此设计和合成一个脱氧罗丹明类探针来检测NO是非常必要的。

发明内容

根据所提出的要求，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，提供了基于脱氧罗丹明的快速响应，高选择性的一氧化氮荧光探针。

本发明的技术方案是，一种基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针，其结构式如下：

基于脱氧罗丹明的一氧化氮荧光探针的制备方法。步骤如下：

1)在含有30mL二氯甲烷的100mL的圆底烧瓶中加入1当量的罗丹明B，5当量的邻苯二胺和1当量的卡特缩合剂，在室温下搅拌10～14小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用CH2Cl2/CH3COOC2H5体积比约为5:1～3:1的洗脱剂进行柱层析，得到白色固体(RB-OPD)(产率73％)。2)在100mL圆底烧瓶中，将0.5当量的化合物RB-OPD，5当量的氢化铝锂溶于无水THF中，室温下，在氮气中搅拌10～14小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100mL蒸馏水，反应混合物用100mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用CH2Cl2/CH3CH2OH体积比约为5:1～3:1的洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物，即为荧光探针。

基于罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的性能研究。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，加入NO之前，荧光探针没有罗丹明的荧光发射峰，说明探针分子处于内酰胺闭环结构；随着NO的加入，在590nm处出现了罗丹明的最大发射峰，并且随着NO浓度的增大，探针分子的荧光强度不断增强，当加入25μM NO时，荧光强度增强170倍，说明该探针可以高灵敏的对NO进行检测。该探针的检测范围从0.005μM到25μM，检测限为1.7nM，这说明该探针可以高灵敏的检测NO。其次，还研究了探针对活性氮(ONOO-,NO2-,NO3-)，活性氧(HClO,H2O2,·OH,O2-)，DHA,AA,MGO，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)和金属离子(K+,Mg2+,Ca2+,Na+,Zn2+)的荧光响应情况。结果发现，只有NO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响，这说明该探针具有很好的选择性。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在40秒以内。

基于脱氧罗丹明染料的一氧化氮荧光探针的应用。在细胞中加入荧光探针，有红色微弱荧光，这说明细胞中的NO含量较低。细胞用脂多糖(LPS)处理，刺激细胞内NO的产生，然后用探针染色，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号。细胞用氨基胍盐酸盐(AG)处理，抑制细胞内NO的产生，发现细胞内红色荧光大大减弱。这些结果说明荧光探针dRB-OPD能监控细胞内NO含量的变化，这为监控人体内和一氧化氮相关病变提供一种可靠的手段。

附图说明

图1为荧光探针的合成路线。

图2为荧光探针与不同浓度的NO作用后的荧光光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为10μM，DEA·NONOate(NO释放剂)浓度分别为：0,0.005,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,22.0,24.0,25.0μM。荧光激发波长为550nm。

图3为荧光探针对不同NO浓度的荧光线性响应图。

图4为荧光探针与NO作用后的紫外可见吸收光谱图。

横坐标为波长，纵坐标为吸光度。荧光探针的浓度均为10μM，DEA·NONOate浓度为25μM。

图5为荧光探针的选择性图。

荧光探针的浓度均为10μM，DEA·NONOate浓度为25μM，其它分析物浓度均为200μM。

图6为荧光探针与NO作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。

图7为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。

图8荧光探针与NO作用的细胞成像图。(a)细胞用探针染色10min。(b)细胞用LPS和处理12h，然后用探针染色10min。(c)细胞用LPS和AG处理12h，然后用探针染色10min。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。

实施例1：

荧光探针的合成

合成路线如图1。化合物RB-OPD的合成：在含有30mL二氯甲烷的100mL的圆底烧瓶中加入罗丹明B(0.48g,1.0mmol)，邻苯二胺(0.54g,5.0mmol)和卡特缩合剂(0.44g,1.0mmol)，在室温下搅拌10～14小时，减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:1～3:1的CH2Cl2/CH3COOC2H5的洗脱剂柱层析分离得白色固体(0.39g，产率:73％)，即为化合物RB-OPD。

NO荧光探针dRB-OPD的合成：在100mL圆底烧瓶中，将化合物RB-OPD(0.27g,0.50mmol)和氢化铝锂(0.19g,5.0mmol)溶于无水THF中，室温下，在氮气中搅拌10～14小时后，缓慢加入乙醇淬灭，待气体逸出后，加入100mL蒸馏水，反应混合物用100mL二氯甲烷萃取三次，收集有机相，并用无水硫酸镁干燥，通过减压蒸馏除去溶剂，粗产品用体积比约为5:1～3:1的CH2Cl2/CH3CH2OH洗脱剂进行柱层析，得到紫色固体产物0.11g(42％)，即为所述的荧光探针。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.46(d,J＝6.8Hz,1H),7.41(t,J＝8.4Hz,1H),7.34(t,J＝7.2Hz,1H),7.11(d,J＝7.6Hz,1H),6.70-6.84(m,4H),6.49(d,J＝7.6Hz,1H),6.44(d,J＝8.4Hz,2H),6.32(s,2H),6.20(d,J＝8.0Hz,1H),4.43(s,2H),3.71(s,2H),3.37(d,J＝6.8Hz,8H),1.17(t,J＝7.2Hz,12H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ154.4,149.3,140.9,134.8,132.6,131.0,129.8,128.9,127.5,125.7,120.2,117.9,116.7,115.4,112.7,108.7,98.1,65.6,58.3,44.7,12.6.MS(TOF)m/z 519.4.

实施例2：

荧光探针和NO溶液配制

探针溶液的制备：称取一定量探针溶解在二甲基亚砜中，配成1×10-4M的探针溶液。NO溶液的配制：将一定量的DEA·NONOate溶解在0.1M NaOH溶液后，转移到500mL的容量瓶中，加水至刻度线，得到浓度为1.0×10-2mol·L-1的DEA·NONOate。将1.0×10-2mol·L-1的DEA·NONOate溶液逐渐稀释，得到1.0×10-3-1.0×10-8mol·L-1的DEA·NONOate水溶液。将1.0mL探针的备用溶液和1.0mL的DEA·NONOate水溶液加入到10mL的容量瓶中，用缓冲溶液定容后，得到浓度为1.0×10-5mol·L-1的荧光探针和1.0×10-4-1.0×10-9mol·L-1的NO混合待测溶液。

实施例3：

荧光探针与NO作用的荧光光谱的测定

图2为荧光探针与NO作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为10μM，NO的浓度依次为0,0.005,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,18.0,20.0,22.0,24.0,25.0μM。激发波长固定为550nm，发射波长范围为560～640nm，狭缝宽度为5.0nm/5.0nm。所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图3可以看出，加入NO之前，荧光探针在590nm处有较弱的荧光发射峰。随着NO的加入，在590nm处发射峰大幅度的增强，并且随着NO浓度的增大，探针的荧光强度不断增强，当加入25μM的NO时，荧光强度增强至未加入NO时的170倍。这是因为探针分子的邻苯二胺与NO反应生成苯三唑化合物,探针结构从罗丹明的闭环形式转变为开环形式。图3为探针对不同NO浓度的线性响应图，荧光强度跟NO的浓度呈现线性关系，线性范围是5.0×10-9～2.5×10-5M，检测限是1.7×10-9M。这说明该探针可以高灵敏的检测NO。

实施例4：

荧光探针与NO作用的紫外可见吸收光谱的测定

图4为荧光探针与NO作用后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为10μM，NO的加入量为25μM。从图4中可以看出，没有加入NO时，探针在550nm处有较弱的吸收峰，加入NO之后，在该处的吸收峰大幅度增强。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。

实施例5：

荧光探针对NO测定的选择性

图5为荧光探针对NO测定的选择性图。考察在浓度为10μM的荧光探针溶液中加入NO(25μM)及其活性氮(ONOO-,NO2-,NO3-)，活性氧(HClO,H2O2,·OH,O2-)，DHA,AA,MGO，生物硫醇(Cys,Hcy,GSH)和金属离子(K+,Mg2+,Ca2+,Na+,Zn2+)(200μM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有NO能引起荧光光谱的改变，其他检测物对探针的荧光光谱没有明显的影响。这些结果表明，荧光探针对NO有较好的选择性。

实施例6：

荧光探针与NO作用的响应时间的测定

我们研究了荧光探针对NO的响应时间，其结果如图6。从图中可以看出，该探针对NO的响应时间不到40秒，这能够满足在实际样品中进行实时监测时对响应时间的要求。从图6我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。

实施例7：

荧光探针在活细胞中的应用

首先，我们做了细胞毒性试验，如图7所示。当加入0～30μM NO探针，细胞的成活率均在91％以上，因此可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的NO。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择巨噬细胞RAW264.7进行共聚焦显微成像，结果如图8所示。在细胞中加入荧光探针，能检测到微弱的红色荧光信号，这说明细胞中的NO含量较低(图8a)。文献报道脂多糖(LPS)可以刺激小鼠巨噬细胞释放NO。细胞用LPS预先处理12小时，然后用探针染色10min，检测到细胞内出现了很强的红色荧光信号(图8b)；细胞用AG处理12h，然后用探针染色10min，细胞内没有荧光(图8c)。这些结果说明荧光探针能监控细胞内NO含量的变化，这为监控人体内和一氧化氮相关病变提供一种可靠的手段。