技术领域
本发明涉及人血白蛋白的抗原表位，还涉及其在人血白蛋白特异性检测 中的应用。
背景技术
血液制品是当前医疗行业使用广泛且用量逐年增加的一类药品，随着医 疗保障体系的不断完善和人们对疾病治疗意识的提高，临床中的非保守性手 术治疗方式越来越普遍，从而推动了血液制品市场的发展。人血白蛋白 (HSA)作为一种临床常用的血液制品，多年居于畅销药物的前五位，在医 药行业有着举足轻重的地位。
HSA主要是由肝脏产生的，是血液中含量最高的蛋白质，占血浆蛋白总 量的50％-60％，占血浆总胶体渗透压的70％-80％，在调节血液和组织间的 水分动态平衡方面起着重要作用。HSA自20世纪40年代应用于临床以来， 一直有着“救命药”之称，在增加循环血容量和维持血浆渗透压方面起着重 要作用，是治疗因失血、创伤、烧伤、整形外科手术及脑损伤、防治低蛋白 血症以及肝硬化、肾水肿等恶性病变不可缺少的药物，而且在抗肿瘤及免疫 治疗中也具有极大的需求。
由于白蛋白分子量较大，通过膜的速度较慢，从而其产生的胶体渗透压 可以与毛细血管的静压力抗衡，以此来维持正常与恒定的血容量；同时白蛋 白保留循环水的能力较强，从而起到增加循环血容量的作用。白蛋白对某些 离子和化合物具有较高的亲和力，可与其可逆结合，发挥转运功能，将有毒 物质转运至解毒器官，从而具有加速机体有毒物质的排出，可用于血浆置换 和新生儿高胆红素血症。白蛋白也可为机体提供大量的氨基酸，20％HSA的 氨基酸储备能力相当于全血的8倍，因此可用作机体的营养供给。对于需要 营养干预的患者，HSA不作为直接蛋白质的补充来源。
人血白蛋白制品的主要成分为人血白蛋白，目前市售HSA为液体制剂 或冻干粉末，其来源于健康人血浆，采用低温乙醇法进行分离纯化，经灭活 病毒后使用。由于HSA在临床的广泛应用，极大的需求推动了HSA类药物 的市场增长，据不完全统计，我国每年原料血浆投料约4000吨左右，生产 人血白蛋白约120吨左右，远不能满足当前临床需求。巨大的市场需求和利 益驱使，导致假冒伪劣产品流向市场，恶性事件频发，极大的危害了患者的 生命安全和市场秩序。
假冒手段的层出不穷，给鉴别和监管部门造成了极大的困难。目前人血 白蛋白鉴别和定量的标准主要遵循2010版《中国药典》，采用免疫双扩散和 免疫电泳法进行鉴别，凯氏定氮法进行定量检测，操作相对繁琐，只适用于 实验室的鉴别和检验，且若混有牛、马、羊、猪等其他种属白蛋白时，会出 现假阳性反应，影响结果的判定。拉曼光谱法可用于人血白蛋白的快速检测， 将样品的光谱图与特征拉曼光谱图进行对比，即可判断其真假伪劣，同时可 进行粗略定量，是一种快速且专属性较强的检测方法，但缺点在于仪器价格 昂贵。
为实现HSA特异、快速、有效的鉴别，本发明拟通过生物信息学手段， 筛选出HSA的优势抗原表位，即为HSA的特异性表位。通过基因克隆表达 技术，可大量制备抗原，并制备HSA特异性抗体，在此基础上拟建立一种 HSA的检测试剂，用于HSA的快速鉴别。
发明内容
为建立一种专属性较强的可区别于其他物种的人血白蛋白快速检测技 术，以实现其真假伪劣的鉴别，本发明通过对人、猪、马、牛、羊白蛋白抗 原表位的生物信息学研究，取三段HSA优势抗原表位进行克隆表达，并利 用HSA免疫鼠血清通过间接酶联免疫技术检验抗原的敏感性，利用人、猪、 马、牛、羊白蛋白免疫鼠血清检验抗原的特异性，筛选具有抗原性、特异性 的抗原表位，用于人血白蛋白的快速检测技术的进一步研究。
本发明的目的是提供人血白蛋白特异性抗原表位。
本发明公开的人血白蛋白特异性抗原表位，其氨基酸序列分别如序列表 中下列序列所示：
(1)序列表中序列H1；
(2)序列表中序列H2；
(3)序列表中序列H3；
本发明主要采用的技术如下：
1.发明是建立在生物信息学与基因重组技术的基础上
人血白蛋白是一种临床常用的血液制品，其来源于健康人血浆，主要成 分为人血白蛋白。目前，国内未见关于其抗原性分析的报道。本研究利用生 物信息学预测技术，从人血白蛋白基因序列中选取三段可能具有较高抗原性 的序列片段，采用优势密码子技术，通过合成法获得相关基因，对其克隆表 达即可获得相应的目的蛋白。再通过免疫反应即可获得蛋白相应的鼠源或兔 源抗体，具有较高的专属性，继而利用抗原抗体特异性的结合反应即可实现 人血白蛋白的检测。
2.主要利用酶联免疫反应(间接法)验证和筛选目的蛋白的敏感性和特 异性
酶联免疫反应是一种常用的抗原抗体检测手段，是利用抗原抗体 间能够特异性结合的原理，再通过酶标记的二抗显色可进行定性、定量的测 定，具有较高的专属性和敏感性，且操作快速简便。本实验主要采用间接酶 联免疫反应进行测定，即用克隆表达得到的目的蛋白分别包被酶标板，分别 与人、猪、马、牛、羊血白蛋白抗体反应，对其特异性和敏感性进行分析， 筛选获得具有抗原性的目的蛋白。继而用筛选所得蛋白片段制备抗体，与不 同种属白蛋白反应，进行特异性分析。
本发明的目的在于筛选出人血白蛋白特异性的抗原表位序列，克隆表达 后可得到蛋白产物，通过免疫反应可得到其特异性的鼠源或兔源多抗，能与 人血白蛋白特异性的抗原位点发生反应，而与猪、马、牛、羊白蛋白完全无 交叉，从而为实现建立一种专属性较强的人血白蛋白快速检测方法提供基 础。
为达到上述目的，发明人利用生物信息学预测软件对人血白蛋白氨基酸 序列进行分析，选取3段序列进行克隆表达抗原，其氨基酸序列如序列表中 序列1-序列3所示。基因克隆表达后，分别纯化3种抗原，测定浓度后，稀 释至适宜浓度包被酶标板，分别与人、猪、马、牛、羊血白蛋白免疫鼠血清 反应，分析抗原活性、特异性及敏感性，筛选出优势抗原表位，可大量制备、 纯化，并以此为抗原制备抗体，用于后续人血白蛋白的检测。
本发明是通过以下技术方案得以实现的：
利用Biosun软件对人血白蛋白序列进行分析，预测其抗原表位，选取3 段抗原性及特异性较强的区间片段进行重组表达，间接ELISA法对其活性 及特异性进行分析，选择较好表位用于人血白蛋白的鉴别。
本发明为了有利于区间片段在E.coli中获得高效表达，选择大肠杆菌的 偏性密码子设计并合成基因；为了便于基因克隆表达载体，在连接臂的两端 引入BamHI和EcolI两个酶切位点，以适合表达载体PGEX-4T-2。双酶切 后使片段插入载体PGEX-4T-2，以构建相应的表达质粒。测序法证明各基因 片段已正确插入载体中。
HSA抗原表达质粒，转化E.coliHB101后，经IPTG诱导过夜，取全菌 液进行SDS-PAGE鉴定，证明各质粒均已达到高效表达，再经GST柱及凝 胶过滤纯化，可获得电泳纯的抗原纯品。间接ELISA检测所得抗原与人、 猪、马、牛、羊白蛋白免疫鼠血清反应，筛选出HSA敏感性及特异性较高 的抗原区段。
实验结果证明，本发明所提供的抗原3具有较好的敏感性和特异性，其 分别与人、猪、马、牛、羊白蛋白抗体反应，分析结果可得，抗原3既可与 人白蛋白抗体反应，同时与猪、马、牛、羊白蛋白抗体不发生交叉反应，在 1600倍稀释血清时，区分效果最佳。并以此为抗原制备抗体，分别与人、猪、 马、牛、羊白蛋白反应，只与人白蛋白反应，与其他白蛋白无交叉，特异性 高，排除了假阳性干扰。因此可用于人血白蛋白检测实验的进一步研究。
附图说明
附图1人血白蛋白序列的抗原性分析
附图2抗原1、2、3与不同种属白蛋白抗体交叉反应
具体实施方式
实施例1候选抗原表位的选择
通过Biosun生物信息学软件对人、猪、马、牛、羊白蛋白序列的抗原 性进行预测，预测结果如图1所示，取HSA三个优势抗原区段进行克隆表 达，其氨基酸序列如序列表中序列1-序列3所示。
实施例23种HSA抗原表位的克隆与表达
1.3种HSA抗原表达质粒的构建
1.13种HSA抗原基因的合成
根据上述3种HSA抗原的序列，中心模板法设计引物，委托赛默飞世 尔科技有限公司合成引物。适宜条件PCR合成序列。
1.23种HSA抗原表达质粒的构建
1.2.1PCR产物及表达载体PGEX-4T-2双酶切
取以上合成基因产物及PGEX-4T-2表达载体各83μl分别放于 Eeppendorf离心管中，各加入10×buffer(Muti-CORE)10μl、BamHI和Ecol I各3μl，BSA1μl，置37℃水浴酶切过夜。
酶切产物的琼脂糖凝胶电泳纯化和回收：PCR产物及载体PGEX-4T-2 经双酶切后，用2％琼脂糖凝胶进行纯化，具体方法按《分子克隆》(科学出 版社，第二版)的方法进行。纯化基因用北京百泰克生物技术有限公司生产 的小量胶回收试剂盒回收：即在紫外灯下分别切下含质粒和目的基因的琼脂 糖，放于Eeppendorf离心管中，各加入三倍体积溶胶/结合液，置56℃水 浴10分钟使胶溶解，每100mg最初的凝胶重量加入150μl的异丙醇，振荡 混匀。然后分别移入吸附柱后，按试剂盒说明书进行纯化。
1.2.2连接：于灭菌Eeppendorf离心管中加入上述酶切后的载体及目的 基因各2μl、DNA连接酶4μl，置16℃5h。
1.2.3转化：在超净工作台中，用无菌吸头取50μl感受态细胞(感受态 细胞按《分子克隆》(科学出版社，第二版)的方法进行)悬液于Eppendorf 中，加入上述连接物8μl，轻轻旋转混匀，冰浴45分钟。立即转移到42℃ 水浴中放置2分钟，每管加入1mlLB培养基(不加抗生素)，36.5℃摇床培养 60分钟后，各取0.2ml分别涂于LB琼脂培养基平皿上(含抗生素)，室温 晾干后，置37℃恒温箱倒置培养过夜。挑选数个菌落，分别接种于LB中(2ml /管)，培养过夜，次日各取0.1ml转移到LB中(2ml/管)，36.5℃培养3小时， 每管各加2μlIPTG摇床中诱导培养过夜，收菌，用SDS-PAGE鉴定，选择 目的基因获得高表达菌株，并测序鉴定。
2.抗原的表达与纯化
2.1表达菌株的培养：取-70℃保存的表达菌株20μl接种于LB培养基 中(200mlLB/500ml三角瓶)，36.5℃空气摇床培养过夜，次日按5％的比 例转种于LB培养基(同上)，36.5℃空气摇床培养约3小时，当OD600值 达到0.7时，加2％的IPTG诱导过夜。次日将菌液合并，6000rpm离心10 分钟，弃上清，收集沉淀部分。
2.2粗提蛋白产物：将收集的沉淀用少量GSTbuffer(不含氯化钠)透析 液震荡悬起，在冰浴中超声波破碎菌，每次超声3s，间隔7s，共超声22min。 超声后，4℃、12000rpm离心10min，取上清待用。
2.3纯化：将粗提的蛋白产物过GST蛋白纯化柱，上样前用GSTbuffer Ⅰ平衡柱子4-5个柱体积，以低流速缓慢上样，使蛋白与柱子充分结合，GST bufferⅡ(Tris、Hcl、L-GST)洗脱，收集洗脱峰。再过SephardexG-50凝 胶过滤柱，收集第一洗脱峰。各种纯化重组表位抗原均用SDS-PAGE鉴定。
实施例3间接ELISA对重组HSA抗原的鉴定及筛选
3.1间接ELISA检测重组抗原的抗原性：将纯化的重组抗原用pH值9.6 的磷酸盐缓冲液稀释至2.5μg/ml包被96孔酶标板，100μl/孔，至4℃过夜； 洗板2次，拍干，用5％的脱脂奶粉37℃封闭1h，200μl/孔；弃去液体后洗 板2次，分别取HSA免疫鼠血清稀释200倍加至首孔，100μl/孔，后面倍比 稀释至51200，同时设阴性和空白对照，37℃30min；弃液后洗板5次，排 干，每孔加2000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗100μl，37℃ 20min；弃液后洗板5次，排干，加TMB显色A、B液各50μl，37℃避光反 应10min；每孔加2mol/L的硫酸终止液50μl；酶标仪读取450nm处的吸光 值OD，P/N>2.1为阳性。经分析，H3抗原具有较高的抗原性。
3.2间接ELISA检测重组抗原所制备抗体的特异性：特异性分析所采用 的反应体系和步骤同前，使不同抗原分别与人、猪、马、牛、羊白蛋白抗体 进行交叉反应，结果如图2所示，H3具有较强特异性；使HSA、H3抗原所 制备的抗体分别与人、猪、马、牛、羊白蛋白进行交叉反应，结果显示H3 抗体的交叉反应率低于HSA抗体，其统计学分析P<0.05，差异有统计学意 义，即H3抗原能够产生针对HSA特异性强的抗体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明 的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发 明的保护范围之内。