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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310344832.0 (22)申请日 2013.08.03 CCTCC M2012398 2012.10.11 C12N 1/20(2006.01) A23B 7/155(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (73)专利权人 山西省农业科学院农产品贮藏保 鲜研究所 地址 030031 山西省太原市农科北路 16 号 (72)发明人 施俊凤 孙常青 王潇冉 王春生 白云凤 郭志利 CN 102217656 A,2011.10.19, C.L. Brady et al.Isolation of Enterobact。
2、er cowanii from Eucalyptus showing symptoms of bacterial blight and dieback in Uruguay. The Society for Applied Microbiology .2009, 全文 . Cong-Jun Yang1,2, et al.Isolation and identification of endophytic bacterium W4 against tomato Botrytis cinerea and antagonistic activity stability.African Journal。
3、 of Microbiology Research .2011, 第 5 卷 ( 第 2 期 ), 全文 . (54) 发明名称 防治果蔬采后病害的生物拮抗菌菌株、 其制 备方法及其应用 (57) 摘要 本发明涉及微生物和生物防治领域中的一 种生物拮抗菌、 其制备方法及其应用。菌株名称 为 Enterobacter cowanii B-6-1， 属于肠杆菌属 Enterobacteriaceae。其主要形态特征包括 ： 杆 状， 短棒状， 长 0.8-1.2m， 宽 1.0-1.6m， 革兰 氏染色阴性， 菌落白色， 表面光滑， 在常温下生长 良好。本发明的菌株具有优良的抗病性能， 最佳 配方。
4、为 ： 拮抗菌菌液浓度为 1108cfu/mL 以上， 添加50mmol/L的Na2SiO3， 能够达到最佳的抗病效 果， 对果蔬农业的发展具有十分重要的价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 赵鹏 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书6页 序列表4页 附图3页 CN 103952327 B 2016.04.27 CN 103952327 B 1.防治果蔬采后病害的生物拮抗菌菌株B-6-1， 其名称为EnterobactercowaniiB- 6-1， 属于肠杆菌属Enterobacteriaceae， 保藏日期。
5、2012年10月11日， 保藏号CCTCCMNO： 2012398； 其主要特征见下表： 。 2.利用权利要求1所述的生物拮抗菌菌株B-6-1制备的抗病菌液， 其特征在于： 拮抗菌 菌液浓度为1107cfu/mL以上， 添加25-100mmol/L的Na2SiO3。 3.根据权利要求2所述的抗病菌液， 其特征在于： 拮抗菌菌液浓度为1108cfu/mL以上， 添加50mmol/L的Na2SiO3。 4.权利要求2或3所述的抗病菌液的制备方法， 其特征步骤包括： 权利要求书 1/2 页 2 CN 103952327 B 2 挑取原种， 将其接种在LB液体培养基中， 在28下摇床培养1-2天后， 。
6、得种子液； 种子液在28条件下， 200rpm摇床培养， LB培养基中摇床培养24-36小时后即得目的菌 液。 5.权利要求2或3所述的抗病菌液的使用方法， 其特征在于： 将果蔬浸泡于抗病菌液中， 其腐烂即得到良好控制。 权利要求书 2/2 页 3 CN 103952327 B 3 防治果蔬采后病害的生物拮抗菌菌株、 其制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物和生物防治领域中的一种生物拮抗菌、 其制备方法及其应用， 特别是涉及此生物拮抗菌在果蔬采后病害防治中的应用。 背景技术 0002 果蔬采后由真菌引起的腐烂而造成的损失非常巨大。 目前， 化学杀菌剂是防治果 蔬采后真菌病害的主。
7、要手段之一。 然而， 长期使用化学杀菌剂， 其残留水平不断升高， 同时 也导致具有抗性病原菌的产生。 例如， 许多杀菌剂可控制柑桔的青霉病和绿霉病的发生， 但 近年来由于大量使用杀菌剂引起指状青霉和意大利青霉的获得性抗性已经成为采后病害 防治的一大难题而引起人们的重视。 许多杀菌剂具有异味， 污染环境， 不易降解， 因此， 寻找 低毒性、 高效、 环境友好和残留量低的杀菌剂的替代品或部分替代品就日渐迫切。 0003 使用拮抗酵母菌防治果蔬采后病害， 可以减少化学农药的用量和在果蔬产品上的 残毒， 对保护人体健康和防止环境污染都极为重要。 AspireTM、 Biosave110和Biosave。
8、111是 国外己经注册升记的酵母类微生物抗菌剂， 主要用于控制柑橘类和仁果类果实的采后腐 烂。 这展示了利用拮抗菌来安全有效地防治水果采后病害具有广阔的前景。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种能防治果蔬采后病害的菌株Enterobacter cowaniiB-6-1， 同时提供此菌株的制备方法以及利用此菌株制备的抗病菌液。 0005 为解决上述技术问题， 本发明所采取的技术方案如下。 0006 防治果蔬采后病害的生物拮抗菌菌株B-6-1， 其名称为EnterobactercowaniiB- 6-1， 属于肠杆菌属Enterobacteriaceae， 保藏日期2012年10。
9、月11日， 保藏号CCTCCMNO： 2012398； 其主要特征见下表： 0007 说明书 1/6 页 4 CN 103952327 B 4 0008 0009 防治果蔬采后病害的生物拮抗菌菌株B-6-1的制备方法， 其步骤包括： 0010 A、 取一至多个番茄， 将其放在盛有0.2M磷酸缓冲液的容器中， 在100rpm旋转振荡 器中洗涤10min， 丢弃洗液； 再用相同方法进行二次清洗， 二次清洗前， 先对番茄进行30秒超 声处理， 保留洗液； 说明书 2/6 页 5 CN 103952327 B 5 0011 B、 然后对二次洗液进行连续稀释后， 将稀释液涂布在LB固体培养基上， 每皿 。
10、0.1mL， 在28下培养24-48h至长出单菌落， 依据不同的菌落特征随机选取单菌落， 在LB固 体培养基上重复划线后， 挑取纯化的单菌落与配制的灰葡萄孢孢子悬液在PDA平皿上做对 峙试验， 选择可明显抑菌作用的菌落； 0012 C、 将有明显抑菌作用的菌落于200r/min28下， 在LB液体培养基中摇菌， 48小时 后进行番茄的活体实验； 每果刺5mm5mm伤口两个， 于伤口处分别接种悬浮液接种50 L， 2h 后再分别接种1X105孢子/mL的灰葡萄孢悬液20 L， 将上述经处理的果实于25下保湿， 7d 后统计发病率和病斑直径； 0013 D、 筛选出抑菌效果较好的菌株， 再根据权利。
11、要求1所述的特征对其进行鉴定， 即得 目的菌株。 0014 利用上述生物拮抗菌菌株B-6-1制备的抗病菌液， 其中拮抗菌菌液浓度为1 107cfu/mL以上， 添加25-100mmol/L的Na2SiO3； 优选的， 拮抗菌菌液浓度为1108cfu/mL以 上， 添加50mmol/L的Na2SiO3。 0015 上述抗病菌液的制备方法， 其步骤包括： 0016 挑取原种， 将其接种在LB液体培养基中， 在28下摇床培养1-2天后， 得种子液； 0017 种子液在28条件下， 200rpm摇床培养， LB培养基中摇床培养24-36小时后即得目 的菌液。 0018 上述抗病菌液的使用方法， 将果蔬。
12、浸泡于抗病菌液中， 其腐烂即得到良好控制。 0019 菌株的16SrDNA序列见SEQIDNO： 1， 基于16SrDNA构建的系统发育树见附图1。 0020 菌株的rpoB基因序列见SEQIDNO： 2， 基于rpoB基因构建的系统发育树树见附图 2。 0021 采用上述技术方案所产生的有益效果在于： 参看具体实施方式部分的具体试验结 果， 本发明的菌株具有优良的抗病性能， 对果蔬农业的发展具有十分重要的价值。 0022 本发明通过大量试验获取了抗病菌液的配方： 拮抗菌菌液浓度为l107cfu/mL 以上， 添加25-100mmol/L的Na2SiO3； 并进一步确定了最佳配方： 拮抗菌菌液。
13、浓度为1 108cfu/mL以上， 添加50mmol/L的Na2SiO3； 能够达到最佳的抗病效果。 0023 本发明得到了目的菌株的分离方法， 简便快捷， 成本也很低。 0024 另外， 本发明的菌株具有固氮能力， 同时还可以产生细胞激肽和植物生长素， 促 进植物生长。 附图说明 0025 图1是基于菌株16SrDNA构建的系统发育树。 0026 图2是基于菌株rpoB基因构建的系统发育树 0027 图3是实施例3试验效果的柱形图。 0028 图4是实施例4试验效果的柱形图。 0029 图5显示不同浓度的菌液对灰葡萄孢菌丝生长的抑制效果， 此图源自发明人的系 列科学试验。 0030 图6中，。
14、 上： CK； 下： 11010菌液对樱桃番茄灰霉病的抑制效果， 此图源自发明人的 系列科学试验。 说明书 3/6 页 6 CN 103952327 B 6 0031 菌株Enterobactercowanii属细菌域(Bacteria)、 变形菌门(Proteobacteria)、 -变形菌纲(Gammaproteobacteria)、 肠杆菌目(Enterobacteriales)、 肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、 肠杆菌属(Enterobacter)。 由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保 藏， 中心位于武汉大学。 保藏日期为2012年10月11日， 保藏号为：。
15、 CCTCCMNO： 2012398。 具体实施方式 0032 以下实施例详细说明了本发明。 本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市 售产品， 均能够通过市场购买直接获得。 0033 实施例1： 生物拮抗菌菌株EnterobactercowaniiB-6-1的制备 0034 番茄果面存在大量能够对病原物产生抑制作用的微生物。 现从番茄表面及伤口处 分离菌株， 具体方法如下： 取3个番茄， 将其放在盛0.2M磷酸缓冲液容器中， 在100rpm旋转振 荡器中洗涤10min， 丢弃洗液。 再用相同方法进行二次清洗(二次清洗前， 先对番茄进行30秒 超声处理)， 保留洗液。 然后对二次洗液进行连续。
16、稀释后(10、 102、 103和104倍)， 将稀释液涂 布在LB固体培养基上， 每皿0.1mL， 在28下培养24-48h至长出单菌落， 依据不同的菌落特 征随机选取单菌落， 在LB固体培养基上重复划线后， 挑取纯化的单菌落与配制的灰葡萄孢 孢子悬液在PDA平皿上做对峙试验， 选择可明显抑菌作用的菌落。 将有明显抑菌作用的菌 落， 200r/min28下， 在LB液体培养基中摇菌， 48小时后进行番茄的活体实验。 每果刺5mm 5mm伤口两个， 于伤口处分别接种悬浮液接种50 L， 2h后再分别接种1X105孢子/mL的灰葡 萄孢悬液20 L， 将上述经处理的果实于25下保湿， 7d后统计。
17、发病率和病斑直径。 在本实施 例中， 其筛选到浓度为1X1010cfu/mL以上可完全抑制灰霉病发生的细菌菌株2株， 浓度为 1X109cfu/mL可完全抑制灰霉病发生的酵母菌菌株2株。 而Enterobactercowanii为其中一 株菌株， 根据其特征对其进行鉴定， 或者利用实施例2的鉴定方法进行鉴定， 即得。 0035 实施例2： 生物拮抗菌菌株EnterobactercowaniiB-6-1的鉴定 0036 菌株的16SrDNA序列见SEQIDNO： 1， 基于16SrDNA构建的系统发育树见附图1。 0037 菌株的rpoB基因序列见SEQIDNO： 2， 基于rpoB基因构建的系。
18、统发育树树见附图 2。 0038 菌株的鉴定方法如下： 0039 1、 PCR引物 0040 16SrDNA正向引物27F： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 (见SEQIDNO： 3)， 0041 16SrDNA反向引物1541R： 5 -AAGGAGGTGATCCACCC-3 (见SEQIDNO： 4)， 0042 RopB基因正向引物CM7-f： 5 -AACCAGTTCCGCGTTGGCCTG-3 (见SEQIDNO： 5)， 0043 RopB基因反向引物CM7-r： 5 -CCTGAACAACACGCTCGGA-3 (见SEQIDNO： 6)； 0044 2、 菌。
19、体培养 0045 将冻干保藏的菌种复状培养后， 在平板上划线分离， 培养20h后挑取单菌落接种到 20ml液体培养基中， 37200rpm培养15h。 0046 3、 基因组DNA提取 0047 用SDS-蛋白酶K裂解， 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖， 再用异 丙醇沉淀来提取总DNA。 0048 1)取单菌落接种于5ml相应的培养基中， 在合适的温度下培养。 根据细菌的生长率 说明书 4/6 页 7 CN 103952327 B 7 不同培养时间可由几小时到几天不等。 0049 2)取1.0ml菌液于1.5ml离心管中， 13,000rpm离心2min， 弃上清。 005。
20、0 3)沉淀重悬于1.0ml0.85NaCl中。 0051 4)室温13,000rpm离心2min， 弃上清。 0052 5)沉淀重悬于550 l1TE中。 0053 6)加17 l溶菌酶(35mg/ml)， 37温育30min。 0054 7)加3 l蛋白酶K(20mg/ml)， 37温育30min。 0055 8)加30 l10SDS， 37温育30min。 0056 9)加100 l5MNaCl充分混匀。 0057 10)加80 lCTAB/NaCl溶液， 混匀， 65水浴10min。 0058 11)加等体积(0.70.8ml)氯仿/异戊醇(241)， 轻轻振荡混匀。 0059 12)。
21、室温， 13,000rpm离心10min。 0060 13)将上清液转移到一新1.5ml离心管中， 加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25241) 轻轻振荡混匀。 0061 4、 PCR扩增 0062 16SrDNA序列PCR反应条件： 0063 95for5min； 95for1min， 57for1min， 72for1min20sec， 30cycles： 72 for 0064 5min； 4save， end。 0065 16SrDNA序列反应体系为100 l： 0066 Taq(5U/ l)0.8 l； 10PCRBuffer(Mg2+Plus)10 l； dNTPMixture(2.5。
22、mM/each)8 l； 模板DNA2.5ng； 引物F1(10 mol/L)2 l， 引物R1(10 mol/L)2 l； ddH2O补足到100 l。 0067 ropB基因序列反应条件： 0068 denaturationat95for5min； 3cyclesofdenaturationat95for1min， annealingat55for2min15s， elongationat72for1min15s； 30cyclesof denaturationat95for35s， annealingat55for1min15s， elongationat72 for1min15s； a。
23、further7minofelongationat72.Anannealingtemperatureof 50wasusedforseveralstrainswhichwouldnotamplifyat55. 0069 ropB基因序列反应体系为100 l： 0070 Taq(5U/ l)0.8 l； 10PCRBuffer(Mg2+Plus)10 l； dNTPMixture(2.5mM/each)8 l； 模板DNA2.5ng； 引物F1(10 mol/L)2 l， 引物R1(10 mol/L)2 l； ddH2O补足到100 l。 0071 实施例3： 对番茄灰霉病的生防效果 0072 。
24、配制浓度分别为0(对照)、 1107cfu/mL、 1108cfu/mL、 1109cfu/mL、 1 1010cfu/mL的Enterobactercowanii菌液， 番茄果实经2的NaClO表面消毒后， 每果刺5mm 5mm伤口两个， 于伤口处分别将以上四种浓度的EnterobactercowaniiB-6-1悬浮液接 种50 L， 2h后再分别接种1X106孢子/mL的灰葡萄孢悬液30 L， 将上述经处理的果实于25 下保湿， 7d后统计发病率。 每次处理10个果实， 该试验重复三次。 0073 发病率统计结果如附图3所示， 随着浓度的升高， 番茄灰霉病的发病率下降。 CK灰 霉病的发。
25、生率为100； 在1107cfu/mL时， 其发生率75.33， 1108cfu/mL为57.11， 1 说明书 5/6 页 8 CN 103952327 B 8 109cfu/mL时仅为9.11， 在最高浓度11010cfu/mL时， 可完全抑制番茄灰霉的发生。 0074 实施例4.添加Na2SiO3对Enterobactercowanii生防效果的影响 0075 方法： 番茄果实经2的NaClO表面消毒后， 每果刺5mm5mm伤口两个， 于伤口处分 别将接种下表所示9种不同的悬浮液50 L， 2h后再分别接种1X106孢子/mL的灰葡萄孢悬液 30 L， 将处理后的果实于25下保湿， 7d。
26、后统计发病率。 每次处理10个果实， 该试验重复三 次。 0076 编号处理发病率() 1CK100.00 21107Enterobactercowanii75.33 31107Enterobactercowanii+25mMNa2SiO366.58 41107Enterobactercowanii+50mMNa2SiO334.89 51107Enterobactercowanii+100mMNa2SiO340.40 61108Enterobactercowanii57.11 71108Enterobactercowanii+25mMNa2SiO350.18 81108Enterobacter。
27、cowanii+50mMNa2SiO317.97 91108Enterobactercowanii+100mMNa2SiO325.80 0077 结果参看附图4， 显示在Enterobactercowanii菌液中， 适当添加Na2SiO3可以增强 Enterobactercowanii的生防效力， 不同浓度的Na2SiO3对肠杆菌的生防效力的影响不同， 50mmol/L对效力的提高效果最好。 0078 上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出， 不作为对其技术方案本身的单一 限制条件。 说明书 6/6 页 9 CN 103952327 B 9 0001 序列表 1/4 页 10 CN 103952327 B 10 0002 序列表 2/4 页 11 CN 103952327 B 11 0003 序列表 3/4 页 12 CN 103952327 B 12 0004 序列表 4/4 页 13 CN 103952327 B 13 图1 图2 说明书附图 1/3 页 14 CN 103952327 B 14 图3 图4 说明书附图 2/3 页 15 CN 103952327 B 15 图5 图6 说明书附图 3/3 页 16 CN 103952327 B 16 。