技术领域
本发明属于生化药品制备技术领域，涉及一种活性脑多肽类物质的制备方法以及采 用该方法制备获得的活性脑多肽类产品，更具体地说是一种变性蛋白粉及采用此蛋白粉 制备的脑蛋白水解物。
背景技术
脑蛋白水解物类药物是近年应用最多的生化药物之一。在国内外相关研究领域及市 场上占有重要地位。脑蛋白水解物作为健康、新鲜动物大脑组织经多酶酶解提取的一种 活性脑多肽类物质，含有多种人脑必须氨基酸及脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等 重要元素，能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成， 诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。它可以通 过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内 能量代谢，激活腺苷酸环化酶催化其他激素系统，提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。 目前，临床上主要采用脑蛋白水解物制成各种剂型，用于治疗痴呆和脑功能障碍、脑发 育不全、脑萎缩、神经衰弱、脑外伤综合症、中枢神经系统感染、脑膜炎、老年性痴呆、 抑郁症、精神病或脑血管代谢失调等多种疾病，同时能有效增强学习记忆力和机体应激 能力，疗效显著且安全无毒副作用。因此，进一步开发和研究脑蛋白水解物类药物，对 治病救人和改善患者的生存质量具有重要意义。
脑蛋白水解物的以上显著疗效，除了其中含有的16种氨基酸以外，其他的组分，尤 其是制备过程中蛋白质未完全水解得到的小分子多肽，同样发挥重要的药理作用，现在 众多的研究表明，动物脑蛋白水解物类药物可显著增强大鼠对缺氧的耐受能力，而同质 的多种氨基酸的混合物则无此作用；实验证明脑蛋白水解物对神经细胞作用与神经生长 因子(NGF)相似，但不同的是NGF为巨分子肽，而脑蛋白水解物是小分子多肽，相比之 下，后者能通过血脑屏障，更好的发挥治疗作用，也就是说，小分子多肽的疗效是氨基 酸不可替代的，它们共同保证了脑蛋白水解物的临床疗效。因此脑蛋白水解物的具体组 成成分极大影响它的疗效，控制脑蛋白水解物的质量是保证该产品临床使用安全有效的 基础。
脑蛋白水解物质量控制方法主要是测定药品中小分子多肽(分子量小于10000Da) 和多种氨基酸的含量(其注射剂的国家标准为WS1-(X-018)-200lz)。生产出的产品既 需要控制水解后16种氨基酸含量，还需要控制不完全水解产物小分子多肽的含量，以 到达合理的含量和配比，从而保证药物的疗效和安全性。产品之所以规定了16种氨基 酸的含量范围，完全是基于开发这种药物时进行的大量临床试验，证明这种含量和相互 配比是科学合理，能够起到最好的治疗效果，同时，临床使用基本没有不良反应。所以， 一旦产品中这些有效成分含量不符，比例不符，都会影响药物的治疗效果和安全性。
由于脑蛋白水解物产物是个多组分的生化药物，其生产工艺十分复杂，不同工艺生 产的脑蛋白水解物的最终组成各不相同，例如猪脑水解所用的蛋白酶种类、酶量及水解 温度、时间等都对脑蛋白的水解程度有很大影响，从而影响终产品的组成成分。由于技 术门槛的原因，即使是已经批准生产的许多厂家仍然不能生产出合格产品，许多生产者 不得不放弃生产。有的企业因为自身技术不成熟，产品达不到注射剂的国家标准，但出 于利益驱使，为了得到检验合格产品，就直接向产品中添加相应的氨基酸，调配含量至 符合规定，这种人工添加有效成分做法本身违反药品生产法律规定(GMP规定)，更严 重的后果是：没有经过真正的提取生产步骤，得到的脑蛋白水解物有效成分小分子多肽 将减少甚至丧失，进一步导致药品疗效的下降，不但起不到治疗作用，甚至耽误病人及 时治疗，导致更严重的临床后果。为此，2008年12月15日国家发文：国食药监办[2008]734 号“关于加强脑蛋白水解物注射液监督检查的通知”文件特别提出了这个问题，同时 也停止了国内所有脑蛋白水解物注射液一百多个批准文号的生产，至今未恢复生产。
近年来国内外可查到脑蛋白水解物相关报道有很多，在国内外相关报道中有关生产 工艺的具体内容却较少。现行的制备工艺还不十分完善，无法得到符合注射剂国家标准 的产品。许多专利描述的工艺得到的脑蛋白产品本身也都不能达到注射剂的国家标准， 例如专利94104516.1；200910071802.0；200410073403.5，另外一些专利甚至直接注 明提取后的脑蛋白水解产物还需额外添加氨基酸成分，才能达到注射剂的国家标准，例 如专利200710055421.4；200610065169.0；200410022091.5等等，这几个专利的特点 都是前处理、匀浆、脱脂(丙酮、乙醚、正丁醇)、单酶或双酶水解、离心、超滤、柱 层析精制、灭菌得到；其存在的主要问题是根据这些工艺得到的脑蛋白水解物并不符合 脑蛋白水解物注射剂国家标准中对氨基酸的含量要求。
由于脑蛋白水解物中小分子多肽的含量是与氨基酸含量有关联的，在总氮量和氨基 酸含量一定的情况下，小分子肽的含量也是确定的。人工添加氨基酸后更是无法确定活 性成分小分子多肽的含量。其结果会导致对产品中小分子多肽这种有效成分完全失控。
从脑蛋白水解物制备工艺上看：现有报道的方法都有胶匀浆、酶水解的步骤，有的 还加上层析精制的工艺步骤，但采用的工艺条件均各不相同，因此导致得到的脑蛋白水 解物产品组分各不相同，国内报道的产品也没有对其中的小分子多肽含量进行明确。国 外同类产品奥地利依比威大药厂是最早开发本产品的厂家，其产品名为施普善，但至今 无相关工艺报道。综上所述，从已公开的脑蛋白水解物生产工艺的专利中可看出，该产 品的生产技术难度极大，目前脑蛋白水解物存在的关键问题是如何能保证所制备的脑蛋 白水解物氨基酸含量在脑蛋白水解物注射剂国家标准规定范围内，同时小分子多肽的含 量在氨基酸含量合格的前提下尽可能的高，以确保产品的安全性及疗效，甚至提高其疗 效。
目前要解决上述的问题，关键在于通过控制制备过程中变性蛋白总氮含量(120mg/g 以上)，以及探索合适的制备工艺和条件，从而得到氨基酸含量符合注射剂的国家标准、 多肽含量高的脑蛋白水解物，而这方面的相关文献尚未见报道。本发明第一次提出了控 制蛋白粉的总氮量指标和分子量小于10000Da小分子多肽含量的关键技术指标。
发明内容
本发明的主要目的在于提供变性蛋白粉及采用此蛋白粉制备脑蛋白水解物。为此：
本发明的一个目的在于公开了一种采用特定的条件得到的变性蛋白粉。
本发明的另一个目的在于公开了一种变性蛋白粉的制备方法。
本发明的再一个目的在于公开了变性蛋白粉在制备脑蛋白水解物药物中的用途。
本发明还一个目的在于公开了一种采用变性蛋白粉制备的脑蛋白水解物。
本发明还一个目的在于公开了一种采用变性蛋白粉制备脑蛋白水解物的方法。
本发明还一个目的在于公开了脑蛋白水解物在制备治疗痴呆和脑功能障碍药物中 的用途。
本发明制备的脑蛋白水解物能达到氨基酸含量符合注射剂的国家标准，且小分子多 肽含量高达25-35％。
本发明的脑蛋白水解物是用一种特定的中间体变性蛋白粉获得的。本发明原创性地 通过用溶菌酶在特定条件下处理猪脑，获得了一种总含氮量高于120mg/g的变性蛋白 粉，然后用该蛋白粉作为中间体，在特定条件下进行处理，从而最终获得了各氨基酸含 量符合国家注射剂标准，小分子多肽含量高的脑蛋白水解物。
本发明的一个实施方案涉及变性蛋白粉，该变性蛋白粉的总含氮量为120mg/g以 上；它是通过在新鲜的猪脑中加入溶菌酶，经过初混、加热脱脂、丙酮脱脂得到。其制 备过程如下：
(1)制备初混物：采用新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水，每kg脑组织 加入0.1～1.0g溶菌酶一起混合搅拌胶体磨或匀浆机匀浆，经过4～6次匀浆，得到初 混物；
(2)脱脂：将初混物，加热煮沸0.5～1h，冷却至常温，然后加入10～20倍(重 量)丙酮，搅拌0.5～1h；过滤，常温干燥，得到总含氮量为120mg/g以上的变性蛋白 粉，-20℃以下保存。
本发明进一步公开了变性蛋白粉在制备脑蛋白水解物药物中的用途。
本发明同时也公开了采用变性蛋白粉制备的脑蛋白水解物，其特征在于：脑蛋白水 解物中各氨基酸含量如下：门冬氨酸2.4-3.6mg/ml，丝氨酸0.21-0.39mg/ml，谷氨 酸3.2-4.8mg/ml，甘氨酸1.2-1.8mg/ml，组氨酸1.04-1.56mg/ml，精氨酸0.3-1.1 mg/ml，苏氨酸0.21-0.39mg/ml，丙氨酸2.4-3.6mg/ml，脯氨酸1.6-2.4mg/ml，缬 氨酸1.6-2.4mg/ml，蛋氨酸0.35-0.65mg/ml，赖氨酸4.8-7.2mg/ml，异亮氨酸1.6-2.4 mg/ml，亮氨酸4.8-7.2mg/ml，苯丙氨酸1.6-2.4mg/ml，色氨酸0.35-0.65mg/ml； 分子量小于10000Da小分子多肽含量占脑蛋白水解物的25～35％。
本发明进一步公开了脑蛋白水解物的制备方法，它是采用以下的步骤；
(1)选用总含氮量为120-140mg/g变性蛋白粉，用纯化水溶解变性蛋白粉至总氮 量3-30mg/mL的浓度，加热煮沸1小时；
(2)以总氮量计算，加入同等量3-30mg/mL胃蛋白酶进行酸性水解，水解条件37 ℃～40℃；在pH 2.0-3.0下搅拌反应4-8小时，水解完成后，煮沸30分钟；
(3)上述水解产物以总氮量计算继续分数次总共加入同等量3-30mg/mL的胰蛋白 酶再次水解，水解条件45℃～50℃；在pH 7.0-7.5下搅拌反应20～30小时，水解后， 调节pH值至5.0-6.0，煮沸0.5～1h；放置室温后离心，取上清溶液，为脑蛋白水解物 中间品；
(4)上述中间品通过ORGANO阳离子交换树脂进行吸附，采用pH 5-6、浓度为0.1～ 0.2mol/L的氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品；
(5)上述粗品，用10000Da孔径的膜超滤，得到脑蛋白水解物。
其中步骤(3)所述的胰蛋白酶分数次加入指的是按水解产物总氮量计算平均分为 3～6次加入。
本发明所采用的ORGANO阳离子交换树脂指的是：型号为IRI20B、IRI124、200CT 或252，优选型号为IRI124或200CT。
本发明步骤中pH值的调节是用常规pH调节剂完成的，其实例非限制性地包括：盐 酸、氢氧化钠、磷酸、柠檬酸及其盐类等等。
本发明进一步公开了脑蛋白水解物在制备治疗痴呆和脑功能障碍、脑发育不全、脑 萎缩、神经衰弱、脑外伤综合症、中枢神经系统感染、脑膜炎、老年性痴呆、抑郁症、 精神病或脑血管代谢失调的药物中的用途。
本发明的关键点在于：首先控制中间体变性蛋白粉的总含氮量，通过采用溶菌酶破 坏细胞膜，再通过脱脂处理，改善了丙酮的脱脂效果，从而提高了总氮的含量。
本发明人在多次试验中发现，当用于制备脑蛋白水解物的变性蛋白粉的总含氮量小 于120mg/g时，后续无论经过何种水解条件和层析分离，始终无法让16种氨基酸都在 上述合格范围内，尤其是门冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸等含量总是有一 种或多种低于上述含量范围的下限；因此，本发明首次公开了对中间体-变性蛋白进行 控制这一关键性的步骤。其中一个典型的比较实例在于：
常规的方法：
(1)制备初混物：采用新鲜的猪脑组织适量，洗净，搅拌，胶体磨匀浆，得到初 混物；
(2)脱脂：将初混物加热煮沸0.5-2h，冷却至常温，然后加入适量(重量)丙酮， 搅拌0.5-2h；过滤，常温干燥，没有关于总含氮量的控制。
本发明的方法：
(1)制备初混物：采用新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水，每kg脑组织 加入0.5g溶菌酶一起混合搅拌，胶体磨匀浆，经过6次匀浆，得到初混物；
(2)加热、脱脂：将初混物加热煮沸1h，冷却至常温，然后加入20倍(重量) 丙酮，搅拌1h；过滤，常温干燥，得到总含氮量为128mg/g变性蛋白粉，-20℃以下保 存。
以上两种方法得到的蛋白粉分别按照本发明制备方法进行后续脑蛋白水解物的制 备：
A.用纯化水溶解脑蛋白粉至总氮量15mg/mL的浓度，加热煮沸1小时；以总氮量 计算，加入同等量胃蛋白酶(15mg/mL)进行酸性水解，水解条件37℃；在pH 2.0下 搅拌反应4小时，水解完成后，煮沸30分钟；
B.上述水解产物以总氮量计算继续分3次加入同等量的胰蛋白酶(15mg/mL)再次 水解，水解条件45℃；在pH 7.0下搅拌反应20小时，水解后，调节pH值至5.0，煮 沸1h；放置室温后离心，取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品；
C.上述中间品通过ORGANO阳离子交换树脂(型号200CT)进行吸附，采用pH 值5.0、浓度0.2mol/mL的氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品。
D.上述粗品，用10000Da孔径的超滤膜处理后，得脑蛋白水解物：
本发明另一个比较典型的实例：
以总含氮量为120mg/g以上(优选120-140mg/g)的变性蛋白粉为原料，严格按照 本发明的(1)-(5)步骤进行制备，这样所制备的脑蛋白水解物中各氨基酸含量符合 “脑蛋白水解物注射剂国家标准”，分子量小于10000Da的小分子多肽含量占水解产 物25～35％。同时，变性蛋白的水解条件尤其重要，不同水解pH值和时间，会得到水 解程度不同的产物，例如，胃蛋白酶水解时间过短，会导致苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨 酸之外的其他氨基酸含量达不到范围；而胰蛋白酶水解时间过短，则会导致精氨酸、赖 氨酸、丝氨酸之外的其他氨基酸含量超过含量范围下限；另一方面，蛋白质不完全水解 才能得到小分子多肽，一旦条件控制不合理，水解程度过大，又会使蛋白质彻底的水解 成氨基酸，导致小分子多肽含量太低，从而影响疗效。
本发明再一个比较典型的实例：
胰蛋白酶的加入方式也对水解的程度有很大的影响，分次加入的效果要好于一次 性加入，其典型的例子如下：
A.用纯化水溶解脑蛋白粉至总氮量8mg/mL的浓度，加热煮沸1小时；以总氮量 计算，加入同等量胃蛋白酶(8mg/mL)进行酸性水解，水解条件37℃；在pH 2.5下搅 拌反应5小时，水解完成后，煮沸30分钟；
B.上述水解产物分为两份样品，样品①以总氮量计算一次性加入同等量的胰蛋白酶 (8mg/mL)再次水解；样品②以总氮量计算分4次加入同等量的胰蛋白酶(8mg/mL) 再次水解，后续操作均相同，水解条件40℃；在pH7.0下搅拌反应25小时，水解后， 调节pH值至5.0，煮沸1h；放冷后离心，取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品；
C.上述中间品通过ORGANO阳离子交换树脂(型号200CT)进行吸附，采用pH 值5.0的氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品。
D.上述粗品，用10000Da孔径的超滤膜处理后，得脑蛋白水解物：
结论：
(1)经过无数的试验发现，我们目前描述的制备方法，综合考虑了各种工艺影响 因素，能够很好地控制变性蛋白的水解程度，使所有的氨基酸含量都在合格范围，并且 保证含有较高的小分子多肽。所得到的产品符合注射剂国家标准中16中氨基酸含量范 围；
(2)国内的脑蛋白水解物产品标准较低，没有对小分子多肽含量进行规定；但是 经过我们对其上市销售的产品进行实际测定(采用同样的方法测定)，小分子多肽含量 均在20％以下，如下表所示，而本发明的产品，小分子多肽含量远远超过国外原研产品， 达到25～35％，具有更好的疗效。
下面是奥地利产品施普善(脑蛋白水解物注射液)6批上市品平均值和本发明产品的实 测值：
本发明制备的脑蛋白水解物的质量检测：
1)总氮量的测定方法：按照现行2010版药典附录VIID氮的测定第二法进行。
2)多种氨基酸含量的测定方法：
氨基酸的含量测定方法有很多种，都是已知的成熟技术，例如可用氨基酸测定仪、 AccQ.Tag法等等，我们采用了后者，具体来说使用下面的条件：
①高效液相色谱仪(岛津LC-2010A)色谱柱(NOVA-Pak C18 5μm 3.9×150mm)流 速1.0ml/min，柱温：37℃
②衍生试剂盒：AccQ.Tag氨基酸专用衍生剂AccQ-FluorTMReagent kit(市售)；
③流动相的配制：流动相A的配制：取三水合醋酸钠19.0g，三乙胺2.37ml溶于1000ml 水中，用磷酸调节pH值至4.95。流动相B的配制：乙腈-水(60∶40)。
④测定条件：洗脱梯度
时间(分钟) A％ B％ 0.01 100 0 17 92 8 24 76 24 32 67 33 34 67 33
35 0 100 37 0 100 38 100 0 45 100 0
⑤样品配制：按照上述市售衍生试剂盒所述方法，分别取衍生后的对照品溶液和供试品 溶液各10μl进样，记录色谱图。
⑥计算：以外标法计算
3)小分子多肽的计算方法：
用下列公式计算：肽含量[％]＝(Ntotal-∑NAS)/Ntotal×100
式中Ntotal为总氮含量(mg/ml)，NAS为单个游离氨基酸的氮含量(mg/ml)。
本发明制备的脑蛋白水解物不但主要成分与进口产品相同，且含量与纯度高于同类 进口产品，其中的肽含量可以达到25-35％，远高于进口产品平均18％的水平。
下面是采用奥地利施普善注射液、本发明实施例1产品两种脑蛋白水解物进行的急 性毒性试验：
摘要：小鼠急性毒性试验：小鼠100只(体重18-22g)，雌雄各半，随机分为10组； 其中5组用于脑蛋白水解物(施普善)的LD50实验，其他5组用于实施例1脑蛋白水 解物的LD50实验。两个受试药物均由小鼠尾静脉注射给药，1次/日。采用Bliss法计算 LD50。研究结果显示，脑蛋白水解物(施普善)的LD50及95％可信限为72.3(69.1～ 75.3)mL/kg，实施例1脑蛋白水解物为74.2(70.4～78.1)mL/kg；两制剂的LD50无显 著性差异。结论：脑蛋白水解物(施普善)与实施例1脑蛋白水解物的急性毒性无显著 性差异。
1试验目的
观察静脉注射脑蛋白水解物(施普善)、实施例1脑蛋白水解物对小鼠的毒性反应 及死亡情况，并比较二者LD50的差异。
2试验材料
2.1试验药物
脑蛋白水解物注射液(施普善)：橙黄色液体，奥地利依比威大药厂，批号92799904。
施普善用法：推荐每日10～30mL，稀释于250mL生理盐水中滴注。或皮下注射2mL， 肌注5mL，静推10mL。
自制脑蛋白水解物原液(实施例1)：橙黄色液体，批号20120306。
2.2试验动物
昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半；由中国医学科学院实验动物研究所提供。
2.3饲养管理
饲料：由天津市动物中心提供。
动物实验室：室温由中央空调控制在24±2℃，湿度为60±15％。
3实验方法与结果
3.1脑蛋白水解物(施普善)静脉注射给药小鼠急性毒性试验
50只小鼠按性别、体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。尾静脉注射给药。 剂量为90、76.5、65、55.3、47mL/kg，剂距比为1∶0.85。因小鼠每10g体重的静脉给药 容积为0.2mL，上述剂量设置的给药容积过大，实验前须将脑蛋白水解物(施普善)浓 缩10倍。按照0.2mL/10g的给药容积静脉注射上述5个剂量的药物后，观察并记录动 物的毒性反应及死亡情况，连续观察14天，用Bliss法计算LD50及95％可信限，结果 见表1。
表1脑蛋白水解物(施普善)静脉注射给药小鼠急性毒性试验
脑蛋白水解物(施普善)小鼠立即出现惊跳、震颤，肌张力增加、小便失禁，俯 卧不动，直至死亡。随剂量加大，症状加重。死亡大都在给药后30分钟内，死亡小鼠 立即解剖，肉眼观察未发现明显异常，存活小鼠1天后外观、活动均恢复正常，1周、 2周体重均增加。
3.2实施例1脑蛋白水解物静脉注射给药小鼠急性毒性试验
50只小鼠按性别、体重随机分为5组，每组10只，雌雄各半。尾静脉注射给药。 剂量为110、93.5、79.5、67.6、57.4、48.8mL/kg，剂距比为1∶0.85。因小鼠每10g 体重的静脉给药容积为0.2mL，上述剂量设置的给药容积过大，实验前须将实施例1脑 蛋白水解物浓缩10倍。按照0.2mL/10g的给药容积静脉注射上述5个剂量的药物后， 观察并记录动物的毒性反应及死亡情况，连续观察14天，用Bliss法计算LD50及95％ 可信限，结果见表2。
表2实施例1脑蛋白水解物注射给药小鼠急性毒性试验
实施例1脑蛋白水解物静脉注射后，小鼠立即出现呼吸加快、奔跑、惊跳、小便 失禁，俯卧少动，直至死亡。随剂量加大，症状加重。死亡大都在给药后30分钟内， 死亡小鼠立即解剖，肉眼观察未发现明显异常，存活小鼠1天后外观、活动均恢复正常， 1周、2周体重均增加。
小结：研究结果显示，脑蛋白水解物(施普善)的LD50及95％可信限为72.3(69.1～ 75.3)mL/kg，实施例1脑蛋白水解物为74.2(70.4～78.1)mL/kg；两制剂的LD50无显 著性差异。结论：脑蛋白水解物(施普善)与实施例1脑蛋白水解物的急性毒性无显著 性差异。
以上测定数据和毒理试验结果表明：本发明制备的脑蛋白水解物不但主要成分与进 口产品相同，均符合国家注射剂标准，且总氮量和小分子多肽高于同类进口产品，其中 分子量小于10000Da的小分子肽含量可以达到25-35％，高于进口产品平均18％的水平； 并且安全性和进口产品相当。小分子肽的增加没有增加其毒性。
对于小分子多肽含量的提高是否的确会有更好的疗效，我们进行了进一步的动物药 效试验，意外的发现，相比进口的奥地利产品，本发明产品中小分子肽的增加显著提高 了脑蛋白水解物治疗痴呆和脑功能障碍方面的疗效，具体的试验方法和结果如实施例5 所述，结果证明：本发明的脑蛋白水解物药效明显好于现有的脑蛋白水解物产品。
本发明制备的脑蛋白水解物与现有技术相比所具有的积极效果在于：
(1)得到符合注射剂国家标准的脑蛋白水解物，确保药品质量。
(2)各氨基酸含量合格，分子量小于10000Da的小分子多肽含量高，与现有脑蛋白水 解物产品相比，药效显著提高的同时毒性没有增加。。
(3)真正的从猪脑中提取的生物活性物质，不人工添加有效成分，确保药品安全有效。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专 业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在 本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。所用到的试剂均有市售。在 没有提及温度的情况下，都是在环境温度下进行的。
实施例1
变性蛋白粉的制备：
第一步脑组织匀浆
新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水。加入0.5g/kg溶菌酶一起混合搅拌， 胶体磨匀浆。经过6次匀浆得到初混物。
第二步蛋白变性
将上述脑组织加热煮沸1h，冷却至常温。向其中加入20倍量(重量)的丙酮，搅 拌1h，过滤，常温干燥得变性蛋白粉，含总氮量135mg/g。-20℃以下保存脑蛋白粉。
脑蛋白水解物的制备：
第三步酶解
(1)取上述蛋白粉，根据总氮量，用纯化水溶解蛋白粉至3mg/mL总氮量的浓度， 加热煮沸1小时。
(2)加入同等量3mg/ml(以总氮量计算)胃蛋白酶，进行酸性水解，水解条件具 体为：37℃；用10％磷酸调pH值至2.0，在pH2.0下搅拌反应。4小时，水解完成后煮 沸30分钟。
(3)水解产物继续加入同等量(以总氮量计算)3mg/ml的胰蛋白酶水解，水解条 件具体为：45℃，用10％氢氧化钠调pH值至7.0，在pH7.0下搅拌反应22小时。胰酶 的加入方法是等分为5份，分5次加入。水解后，10％磷酸调pH值至6.0以下，煮沸 0.5h。
(4)水解产物离心，除掉渣滓。取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品。
第四步精制
阳离子交换树脂(ORGANO PK 200CT，购自ORGANO)：用10％磷酸将上述(4) 的水解产物中间品的pH值调至6.0，通过阳离子交换树脂进行吸附，采用pH6.0的 0.12mol/L氯化钠缓冲液解吸。得到脑蛋白水解物粗品。
上述粗品，用10000Da孔径的超滤膜处理后，得脑蛋白水解物。
测定的氨基酸含量如下，小分子多肽含量(分子量小于10000Da)占水解产物的 34.69％
实施例2
变性蛋白粉的制备：
第一步脑组织匀浆
新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水。加入0.2g/kg溶菌酶一起混合搅拌， 均浆机匀浆。经过4次匀浆得到初混物。
第二步蛋白变性
将上述脑组织加热煮沸1h。冷却至常温。向其中加入10倍量(重量)的丙酮。搅 拌1h。过滤。常温干燥。得变性蛋白粉，含总氮量123mg/g。-20℃以下保存脑蛋白粉。
脑蛋白水解物的制备：
第三步酶解
(1)根据蛋白粉的总氮量，用纯化水溶解蛋白粉至3mg/mL总氮量的浓度，加热 煮沸1小时。
(2)加入同等量3mg/ml(以总氮量计算)胃酶进行酸性水解。水解条件37℃； pH2.5下搅拌反应，6小时。用10％磷酸调pH值至2.0，在pH2.0下搅拌反应。水解完 成后，煮沸30分钟。
(3)水解产物继续加入同等量3mg/ml(以总氮量计算)的胰酶水解。水解条件 45℃、pH7.5下搅拌反应。用10％氢氧化钠调pH值至7.0，在pH7.0下搅拌反应22小 时。胰酶的加入方法是等分为5份，分5次加入。水解后，10％磷酸调pH值至6.0，煮 沸0.5h。
(4)水解产物离心，除掉渣滓。取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品。
第四步精制
阳离子交换树脂(ORGANO PK 200CT，购自ORGANO)：用10％磷酸将上述(4)的 水解产物中间品的pH值调至6.0，通过阳离子交换树脂进行吸附，采用pH6.0的 0.12mol/L氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品。
上述粗品，用10000Da孔径的超滤膜处理后，得脑蛋白水解物，测定的氨基酸含量 如下，小分子多肽含量(分子量小于10000Da)占水解产物的29.7％：
实施例3
变性蛋白粉的制备：
第一步脑组织匀浆
新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水。加入0.8g/kg溶菌酶一起混合搅拌， 胶体磨匀浆。经过5次匀浆得到初混物。
第二步蛋白变性
将上述脑组织加热煮沸1h。冷却至常温。向其中加入20倍量(重量)的丙酮，搅 拌1h，过滤，常温干燥得变性蛋白粉，含总氮量135mg/g。-20℃以下保存脑蛋白粉。
脑蛋白水解物的制备：
第三步酶解
(1)取上述蛋白粉，根据总氮量，用纯化水溶解蛋白粉至3mg/mL总氮量的浓 度，加热煮沸1小时。
(2)加入同等量3g/ml(以总氮量计算)胃蛋白酶，进行酸性水解，水解条件具 体为：37℃；用10％磷酸调pH值至2.0，在pH2.0下搅拌反应4小时，水解完成后煮 沸30分钟。
(3)水解产物继续加入同等量(以总氮量计算)3mg/ml的胰蛋白酶水解，水解 条件具体为：45℃，用10％氢氧化钠调pH值至7.0，在pH7.0下搅拌反应22小时。胰 酶的加入方法是等分为5份，分5次加入。水解后，用10％磷酸调pH值至6.0以下， 煮沸0.5h。
(4)水解产物离心，除掉渣滓。取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品。
第四步精制
阳离子交换树脂(ORGANO 200CT，购自ORGANO)：用10％磷酸将上述(4)的水 解产物中间品的pH值调至6.0，通过阳离子交换树脂进行吸附，采用pH6.0的0.12mol/L 氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品。
上述粗品，用10000Da孔径的超滤膜处理后，得脑蛋白水解物。
测定的氨基酸含量如下，小分子多肽含量(分子量小于10000Da)占水解产物的 26.1％：
实施例4
(1)制备初混物：采用新鲜的猪脑组织适量，用水清洗干净去血水，每kg脑组织 加入0.2g溶菌酶一起混合搅拌、胶体磨或匀浆机匀浆，经过4次匀浆，得到初混物；
(2)加热、脱脂：将初混物，加热煮沸0.5h，冷却至常温，然后加入20倍(重 量)丙酮，搅拌1h，过滤，常温干燥，得到总含氮量为135mg/g的变性蛋白粉，-20 ℃以下保存。
采用变性蛋白粉制备的脑蛋白水解物的方法：
(1)选用总含氮量为135mg/g变性蛋白粉，用纯化水溶解变性蛋白粉至总氮量 20mg/mL的浓度，加热煮沸1小时；
(2)以总氮量计算，加入同等量20mg/mL胃蛋白酶进行酸性水解，水解条件37 ℃；在pH2.0-3.0下搅拌反应4-8小时，水解完成后，煮沸30分钟；
(3)上述水解产物以总氮量计算继续3次加入同等量20mg/mL的胰蛋白酶再次水 解，水解条件50℃；在pH7.5下搅拌反应30小时，水解后，调节pH值至5.0，煮沸 1h；放置室温后离心，取上清溶液，为脑蛋白水解物中间品；
(4)上述中间品通过ORGANO阳离子交换树脂进行吸附，采用pH5-6、浓度为 0.1-0.2mol/L的氯化钠缓冲液解吸，得到脑蛋白水解物粗品；
(5)上述粗品，用10000Da孔径的膜超滤(型号200CT)，得到脑蛋白水解物。
测定的氨基酸含量如下，小分子多肽含量(分子量小于10000Da)占水解产物的 31.5％：
实施例5
本发明进一步公开了脑蛋白水解物在制备治疗痴呆和脑功能障碍、脑发育不全、脑 萎缩、神经衰弱、脑外伤综合症、中枢神经系统感染、脑膜炎、老年性痴呆、抑郁症、 精神病和脑血管代谢失调药物中的用途。下面是本发明制备的脑蛋白水解物(实施例3) 在制备治疗痴呆和脑功能障碍方面的药效学实验：
脑蛋白水解物对于痴呆大鼠学习记忆能力的影响
1、材料
1.1动物：SD雄性大鼠，体重250～300g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。
1.2试剂药物：试验药物：实施例3制备的脑蛋白水解物。阳性对照药选用脑蛋白 水解物注射液(施普善，奥地利依比威药品有限公司，批号：93373504)。Aβ25-35 购自Sigma公司，采用无菌生理盐水溶解配制成10mmol/L的溶液，置于孵育箱中37℃ 老化3天，存于-20℃冰箱保存备用。
1.3实验仪器：SN-3N脑立体定位仪(日本Narishige)，DMS-2Morris水迷宫系统。
2、方法
2.1构建AD模型大鼠
大鼠适应性喂养3d后，用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(40mg/kg体重)。将麻醉大 鼠固定于脑立体定位仪上，头顶部去毛，碘酊消毒后切开皮肤，参照包新民的《大鼠脑 立体定位图》，选择右侧侧脑室为注射靶区。于前囟向后1.0mm、中线旁开1.7mm处， 用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，再以微量注射器自脑表面垂直进针3.8mm，将10mmol/L 的Aβ25-35浴液5μl缓慢注入(注入时间不少于5min)，留针2min后缓慢撤针，缝 合伤口；空白对照组注射等量无菌生理盐水。各组动物术后常规腹腔注射苄星青霉素抗 感染，待动物清醒后治疗组即开始尾静脉注射给药。
2.2给药方法
随机将大鼠分为四个组：空白对照组、模型组、实施例3脑蛋白水解物组以及施普 善阳性药对照组，每组6只。用药量为成人临床剂量的20倍，即40mg/kg/d；注射容 积为0.3ml/100g(根据总量和药品浓度计算准确值)，每日2次。空白对照和模型组 则以等体积无菌生理盐水注射。大鼠造模后连续给药15d，次日进行水迷宫实验；试验 期间仍然给药。
2.3行为学实验方法
水迷宫由圆形水池(黑色内壁)、黑色平台和记录系统3部分组成。水池直径120cm， 高60cm，水深40cm，用墨水将池水染成黑色，平台没于水下2cm，水温保持在23℃-24 ℃。迷宫置于实验室中央，室内各物体的位置保持固定不变。水迷宫测试包括连续5d 的定位航行试验(place navigation)和一次空间探索试验(spatial probe test)。
定位航行试验：
试验前一日将大鼠放入水池中(不放入平台)自由游泳2min，使其熟悉试验环境 环境。正式试验历时5d，每天分上、下午2个时间段，每段时间训练4次，分别从东、 南、西、北4个点入水。入水时，大鼠面向池壁，记录大鼠找到平台所需时间即逃避潜 伏期；如大鼠在2min内未找到平台，则由实验者将其引向平台并停留10s，其潜伏期 为120s。摄像系统自动记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期)和游泳途径(过程)， 电脑自动记录上述数据；设定120s为最长逃避潜伏期，120s后自动停止记录。
空间探索试验：
第6d撤除平台，让大鼠自原平台对侧象限盆壁的中点入水自由游泳120s，记录其 游泳轨迹，软件分析计算动物在各象限所用时间和各象限轨迹长度。计算动物在原平台 所在象限游泳时间占逃避潜伏期的百分比，在原平台象限的轨迹长度占搜索距离的百分 比。
2.4统计方法数据以均数±标准差表示，采用SPSS10.0统计分析软件。 定位航行实验及空间探索实验结国采用单因素方差分析(One way ANOVA)，组间两两比 较采用t检验。
3、结果
表1、药物对AD大鼠定位航行实验中逃避潜伏期和搜索距离的影响
组别 逃避潜伏期(s) 搜索距离(cm) 空白对照组 13.25±4.851) 264.12±68.261) 模型组 57.18±7.58 778.36±122.12 实施例3脑蛋白水解物 22.86±5.381) 312.40±75.721) 奥地利脑蛋白水解物注射液 38.44±7.931)2) 504.72±88.941)2)
注：与模型组比较1)P＜0.05，与实施例3脑蛋白水解物组比较2)P＜0.05
表2、药物对AD大鼠空间探索实验中原象限搜索时间及距离的影响
组别 搜索时间百分比(％) 搜索距离百分比(％) 空白对照组 45.12±5.131) 47.12±4.331) 模型组 16.26±4.37 15.96±5.17 实施例3脑蛋白水解物 37.02±4.231) 35.02±5.431) 奥地利脑蛋白水解物注射液 28.33±5.721)2) 26.26±4.121)2)
注：与模型组比较1)P＜0.0，与实施例3脑蛋白水解物组比较2)P＜0.05
结果表明：大鼠定位航行及空间探索实验结果表明，实施例3脑蛋白水解物以及奥 地利脑蛋白水解物注射液均能显著提高AD模型大鼠的空间学习、记忆能力，即缩短逃 避潜伏期和搜索距离，且显著增加大鼠在原平台象限的空间探索时间以及搜索距离。此 外，实施例3脑蛋白水解物对AD大鼠学习、记忆能力的改善作用显著优于奥地利脑蛋 白水解物注射液。