一种重组人促红素的工业化生产方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103205478 A (43)申请公布日 2013.07.17 CN 103205478 A *CN103205478A* (21)申请号 201310116456.X (22)申请日 2013.04.03 C12P 21/02(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/18(2006.01) (71)申请人 北京四环生物制药有限公司 地址 100176 北京市大兴区北京经济技术开 发区建安街 5 号 (72)发明人 程度胜 韩明娣 龙应国 桑建彬 张文学 (74)专利代理机构 北京同辉知识产权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 11357 。

2、代理人 刘洪勋 (54) 发明名称 一种重组人促红素的工业化生产方法 (57) 摘要 本发明公开了一种重组人促红素的工业化生 产方法， 包括扩增培养和分离纯化， 其特征在于 ： 扩增培养采用无血清培养基， 无血清培养基为在 DMEM中添加有2-4%Ultroser G和250-300mg/L正 丁酸钠以及 2-3mg/L 核黄素形成的培养基。分离 纯化采用二步层析， 其第一步层析为反相层析， 第 二步层析为离子层析。本发明的重组人促红素的 工业化生产方法， 在细胞培养时全程采用无血清 培养， 避免了血清培养带来的不足， 同时使得收获 期增长， 收获量增大， 提高了产量。二步层析纯化 方法， 减。

3、少了生产环节， 减轻了工作量和成本， 增 加了产率， 使得 EPO 生产总回收率达到 50% 以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 (10)申请公布号 CN 103205478 A CN 103205478 A *CN103205478A* 1/1 页 2 1. 一种重组人促红素的工业化生产方法， 包括扩增培养和分离纯化， 其特征在于 ： 扩增培养采用无血清培养基， 无血清培养基为在 DMEM 中添加有 2-4%Ultroser G 和 250-300mg/L 正丁酸钠以及 2。

4、-3mg/L 核黄素形成的培养基。 2. 如权利要求 1 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于 ： 所述扩增培 养是在所述无血清培养基内， 2-3 天传代一次， 细胞接种上罐后用再所述无血清培养基培 养， 葡萄糖糖值控制在 1g/L, 开始罐流 ； 罐内细胞增殖培养 6-8 天后， 更换成无血清培养基 CHO-S-SFM 培养， 上获收清液。 3. 如权利要求 2 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于所述分离纯化采 用二步层析法， 其第一步层析为反相层析， 第二步层析为离子层析。 4. 如权利要求 3 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于， 所述反相层析 是。

5、利用 Best chrom 公司的 Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料， 用 30% 乙醇 -1.5mol/L 脲 40ml/min 洗脱 2 个柱体积， 60% 乙醇 -3.0mol/L 脲 40ml/min 洗脱目的蛋白。 5. 如权利要求 4 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于， 所述 Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料装柱的柱规格为 10cm*13cm。 6. 如权利要求 4 或 5 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于， 所述离子 层析是利用 Best chrom 公司的 DEAE Bestarose FF。

6、 填料， 用 pH4.2 的 6mol/L 脲 -1mmol/L 甘氨酸 - 醋酸 6ml/min 洗脱 3 个柱体积， 用 20mmol/L 柠檬酸钠 -0.3mmol/L 柠檬酸溶液平 衡到 pH7.0 ； 用 20mmol/L 柠檬酸钠 -0.3mmol/L 柠檬酸 -100mmol/L 氯化钠溶液洗脱目的蛋 白， 得到的目的蛋白为 EPO 原液。 7. 如权利要求 6 所述的重组人促红素的工业化生产方法， 其特征在于， 所述 DEAE Bestarose FF 填料装柱的柱规格 5cm*8cm。 权 利 要 求 书 CN 103205478 A 2 1/4 页 3 一种重组人促红素的工。

7、业化生产方法 技术领域 0001 本发明涉及制药领域， 具体来说是一种生物制药方法， 涉及的是重组人促红素工 业化生产方法。 背景技术 0002 促红素 （Erythropoietin， EPO）是一种促进红系造血前体细胞分化、 繁殖的细 胞因子， 是一种高度糖基化的糖蛋白。人类 EPO 基因位于 7 号染色体长 22 区。1985 年 其 cDNA 被成功克隆， 并利用基因重组技术开始生产重组人促红素 （recombinant human Erythropoietin， rhEPO） ， 在临床上用于治疗慢性肾衰竭合并贫血症， 慢性肾功能衰竭 （CRF） 贫血， 骨髓增生异常综合症贫血 （M。

8、DS） ， AIDS 病人的伴生贫血等贫血症的治疗。 0003 rhEPO 是以重组 DNA 技术生产的红细胞生成素， 目前主流生产方法是将人促红素 的基因构建连接到表达载体上， 常用表达载体为中国仓鼠卵巢 CHO 细胞， 经过细胞扩增培 养， 从细胞培养上清液中经分享纯化得到促红细胞生成素。 0004 目前， 在培养基应用方面， 重组人促红素生产细胞株主要是在含有 8-10% 牛血清 的培养基中进行扩增培养。但是血清培养基培养具有很多不足， 主要表现在 ： 0005 1、 血清的成份复杂， 有几百种之多， 含有许多仍然未知的成份， 给后续的分离纯化 带来困难。 0006 2、 血清中可能带入。

9、的支原体、 病毒或其他未知成份， 对细胞产生潜在影响， 因此具 有一定风险性。 0007 3、 血清取自于动物， 受个体影响大， 因此不同动物个体、 不同批次产品之间差异 大， 不能保证一致性。 0008 因此， 无血清培养技术开始引起人们重视。深圳赛保尔生物药业有限公司在 CN102268402A 公开的 “无血清培养基及 CHO 细胞中高效表达促红细胞的培养方法” ， 是在培 养基中添加正丁酸钠、 D- 半乳酸、 D- 甘露糖、 D- 葡萄糖、 N- 乙酰基葡萄糖中的一种或多种， 培养基是由 DMEM 培养基和 CHO-S-SFM 培养基按一定比例配成。朱绿松等 “重组人促红素 生产工艺研。

10、究” （ 药物研究 2001 年第 10 卷第 4 期） 中， 也采用无血清培养基 CHO-S-SFM 进行生产研究， 获得了成功。 0009 但是， 目前全球所有的无血清培养基生产重组人红细胞生成素技术， 均与上述文 献一样并不是全程无血清培养， 均是仅在维持阶段再转用无血清培养基培养， 而在细胞复 苏活化后的扩增培养阶段仍然要用含有 5% 或 10% 胎牛血清的培养基扩增培养。还未有在 扩增阶段采用无血清培养的研究和尝试。所以目前现有的无血清培养技术， 虽然在生产维 持阶段采用无血清培养基有利于后续纯化， 使得纯化过程最低可减少到三次层析， 但因为 在扩增阶段都还是利用有血清培养基进行培养。

11、， 还不是真正意义上的无血清生产技术， 前 述第 2、 3 项不足仍然存在。 0010 目 前 全 球 对 于 EPO 成 品 的 下 游 处 理 一 般 进 行 三 步 以 上 的 层 析， 例 如 CN102040695Ar“一种重组人促红素分离纯化方法” 中， 要经过蓝胶层析、 超滤浓缩后进行离 说 明 书 CN 103205478 A 3 2/4 页 4 子交换层析、 C4 反相层析、 离子交换层析、 S-200 分子筛层析共 5 次层析， 纯化得到的 rHEPO 达到 99% 以上， 回收率只有 15%。而基于维持阶段无血清培养技术的三步层析技术， 是目前层析次数最少的分离纯化工艺，。

12、 例如而朱绿松等 “重组人促红素生产工艺研究” 中分 离纯化则包括 Blue Sepharose6F.F 层析、 Q Sepharose6F.F 层析和 Superdex75 层析共三 步层析， 获得半成品纯度为 99.14%， 总回收率为 45%。李琳等在 “无血清培养基生产重组人 红细胞生成素的纯化” （生物化学与生物物理进展， 1997， 24（2） ） 一文中则是采用了 R1 反 相层析、 DEAE 离子交换层析和 Sephacryl S-200 分子筛层析， 获得纯度 98% 以上， 总回收率 38.5%。 0011 在工业化生产中， 层析次数多， 意味着生产周期长， 成本高， 原材。

13、料的浪费。因此， 如果能够减少层析次数， 不仅将对企业产生较大的经济效益， 同时符合节约、 环保的可持续 发展要求， 同时具有很好的社会效益。 发明内容 0012 针对现有技术存在的上述问题， 本发明的目的在于提供一种全程无血清培养的重 组人促红素的工业化生产方法。 0013 为达到上述目的， 本发明采用如下技术方案 ： 0014 一种重组人促红素的工业化生产方法， 包括扩增培养， 其特征在于 ： 扩增培养采用 无血清培养基， 无血清培养基是在 DMEM 中加入 2-4%（wt%） Ultroser G 和 250-300mg/L 正 丁酸钠以及 2-3mg/L 核黄素形成的培养基。 0015。

14、 申请人经过大量研究和试验出人意料地发现， 2-4%Ultroser G 加 250-300mg/L 正 丁酸钠、 2-3mg/L 核黄素， 不仅能够代替胎牛血清， 而且细胞生长活力比 5% 血清要高的多。 0016 更进一步地， 本发明的重组人促红素的工业化生产方法中， 分离纯化采用二步层 析法， 即第一步采用反相层析去除没有疏水性蛋白， 第二步采用离子层析。 0017 首先通过反相层析， 去除没有疏水性蛋白 ； 利用 EPO 蛋白的疏水性进行分离， 本发 明利用反相层析在离子层析前一步， 避免了去离子的麻烦， 而且反相层析填料使用次数高， 回收率也较高。 本发明反相层析是利用Best ch。

15、rom公司的Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料， 柱规格 10cm*13cm。用 30%（v%） 乙醇 -1.5mol/L 脲 40ml/min 洗脱 2 个柱体积， 60% （v%） 乙醇 -3.0mol/L 脲 40ml/min 洗脱目的蛋白。这种反相层析能够进行规模化生产， 柱规 格较大处理量也大。EPO 回收率达到 88% 以上。 0018 离子层析， 利用 EPO 蛋白电荷的特性进行分离， 利用低 pH 处理， 得到高质量的蛋 白。离子层析是利用 Best chrom 公司的 DEAE Bestarose FF 填料， 柱规格 5cm*8cm。用 pH4.2。

16、 的 6mol/L 脲 -1mmol/L 甘氨酸 - 醋酸 6ml/min 洗脱 3 个柱体积， 用 20mmol/L 柠 檬酸钠 -0.3mmol/L 柠檬酸溶液平衡到 pH7.0 ； 用 20mmol/L 柠檬酸钠 -0.3mmol/L 柠檬 酸 -100mmol/L 氯化钠溶液洗脱目的蛋白， 得到的目的蛋白为 EPO 原液。回收率达到 60% 以 上。 0019 本发明的重组人促红素的工业化生产方法， 在细胞培养时全程采用无血清培养， 避免了血清培养带来的不足， 同时使得收获期增长， 收获量增大， 提高了产量。二步层析 纯化方法， 减少了生产环节， 减轻了工作量和成本， 增加了产率， 使。

17、得 EPO 生产总回收率达 到 50% 以上。而且蛋白产品质量有了明显提高， 药效更稳定， 目前市场 EPO 原液等电点在 说 明 书 CN 103205478 A 4 3/4 页 5 3.3-4.5， 而该发明获得的 EPO 电点达到 3.3-4.15， 并能确保所生产的 EPO 蛋白纯度 99%， 离子洗脱液均采用人体可接受的缓冲液， 所得产品可以直接用于成品药物的生产。得到的 产品的其他指标体内外比活、 纯度 （SDS-PAGE） 、 纯度 （HPLC-SEC） 、 分子量、 紫外光谱、 等电 点、 残余外源 DNA、 内毒素含量、 唾液酸含量、 CHO 蛋白惨留、 小牛血清残留量、 酶。

18、切胎图谱、 N- 末端氨基酸序列分析都符合标准。 具体实施方式 0020 下面通过具体实施例对本发明作进一步详细描述。下面实施例中 Ultroser G 在 培养基中的百分含量均为质量百分含量， 乙醇含量为体积百分含量。 0021 实施例 1 0022 培养基名称 ： Ultroser G 血清替代品 ； 代号 ： 15950-017 ； 生产商 :PALL。 0023 生产用 rhRPO 种子细胞 : 四环生物制药构建。 0024 rhEPO 种子细胞复苏后在 3%Ultroser G+250mg/L 正丁酸钠 +2mg/L 核黄素 +DMEM 培养基内， 2-3 天传代一次， 细胞接种上罐。

19、后， 葡萄糖糖值控制在 1g/L， 开始罐流， 温度 37-38。罐内细胞增殖培养 6-8 天后 （增殖培养基 ： DMEM+2% ： Ultroser G+300mg/L 正丁 酸钠 +2.5mg/L 核黄素） ， 更换成无血清培养基 CHO-S-SFM 培养， 收获上清。收获上清达到 1200L， 收获期在 30 天， 平均收获上清 40L/ 天， 平均活性在 12000IU/ml。 0025 实施例 2 0026 rhEPO 种子细胞复苏后在 2%Ultroser G+275mg/L 正丁酸钠 +2.5mg/L 核黄素 +DMEM 培养基内， 2-3 天传代一次， 细胞接种上罐后， 葡萄。

20、糖糖值控制在 1g/L， 开始罐流， 温 度37-38。 罐内细胞增殖培养6-8天后 （增殖培养基 ： DMEM+4% ： Ultroser G+250mg/L正丁 酸钠 +2.5mg/L 核黄素） ， 更换成无血清培养基 CHO-S-SFM 培养， 收获上清。收获上清达到 1250L， 收获期在 30 天， 平均收获上清 42L/ 天， 平均活性在 12000IU/ml。 0027 实施例 3 0028 rhEPO 种子细胞复苏后在 4%Ultroser G+300mg/L 正丁酸钠 +3mg/L 核黄素 DMEM 培养基内， 2-3 天传代一次， 细胞接种上罐后， 葡萄糖糖值控制在 1g/。

21、L， 开始罐流， 温度 37-38。罐内细胞增殖培养 6-8 天后 （增殖培养基 ： DMEM+4% ： Ultroser G+300mg/L 正丁 酸钠 +3mg/L 核黄素） ， 更换成无血清培养基 CHO-S-SFM 培养， 收获上清。采用 Ultroser G 增殖细胞数量收获上清达到 1300L， 收获期在 31 天， 平均收获上清 42L/ 天， 平均活性在 12000IU/ml。 0029 对比例 1 0030 rhEPO 种子细胞复苏后在 5% 胎牛血清 +DMEM 培养基， 进行扩增培养， 2-3 天传代一 次， 细胞接种上罐后， 葡萄糖糖值控制在 1g/L， 开始罐流， 温。

22、度 37-38。罐内细胞增殖培养 6-8天后 （增殖培养基 ： DMEM+5%胎牛血清） ， 更换成无血清培养基CHO-S-SFM培养， 收获上 清。可收获上清液 300L， 收获期在 20 天， 平均收获上清 15L/ 天， 平均活性在 12000IU/ml。 0031 与实施例 1-3 对比可以看出， 实施例 1-3 中内进行无血清扩增培养生产重组人促 红素， 与传统含血清培养基扩增培养相比， 收获延长了 50%， 每日收获量提高了 2.7 倍， 总收 获量提供了 4 倍。 0032 对比例 2 说 明 书 CN 103205478 A 5 4/4 页 6 0033 rhEPO 种子细胞复。

23、苏后在 3%Ultroser G+DMEM 培养基内， 2-3 天传代一次， 细胞接 种上罐后， 葡萄糖糖值控制在 1g/L， 开始罐流， 温度 37-38。罐内细胞增殖培养 6-8 天后 （增殖培养基 ： DMEM+3%Ultroser G） ， 更换成无血清培养基 CHO-S-SFM 培养， 收获上清。收 获上清达到 330L， 收获期在 16 天， 平均收获上清 21L/ 天， 平均活性在 11000IU/ml。与有血 清培养方式相当， 收获量和收获期均低于实施例 1-3。 0034 实施例 4 0035 将实施例 1 获得的上清液进行纯化， 过程为 ： 0036 （1） 反相层析 00。

24、37 经过过滤去除细胞碎片， 上 Butyl-S Bestarose6Fast Flow 填料柱， 柱规格 10cm*13cm。先用 30% 乙醇1.5mol/L 脲以 40ml/min 的流速洗脱 2 个柱体积， 再用 60% 乙 醇3.0mol/L 脲以 40ml/min 的流速洗脱目的蛋白， 并收拾目的蛋白洗脱液。经过检测和 计算， 回收率为 91%。 0038 （2） 离子交换层析 0039 将收集到的目的蛋白洗脱液用 20mmol/L 柠檬酸钠0.3mmol/L 柠檬酸溶液稀释 6 倍， 上 Best chrom 公司的 DEAE Bestarose FF 填料柱， 柱规格 5cm*。

25、8cm。用 6mol/L 脲 1mmol/L 甘氨酸 - 醋酸 （pH4.2） 以 6ml/min 的流速洗脱 3 个柱体积， 再用 20mmol/L 柠檬酸 钠0.3mmol/L 柠檬酸溶液平衡到 pH7.0 ； 最后用 20mmol/L 柠檬酸钠0.3mmol/L 柠檬 酸100mmol/L氯化钠溶液洗脱目的蛋白， 得到的目的蛋白为EPO原液， 该步骤回收率61%。 全程总回收率 55.51%。 0040 根据药典标准进行检测， 等电点达到 3.3-4.15， 所生产的 EPO 蛋白纯度 99%。得 到的产品的其他指标体内外比活、 纯度 （SDS-PAGE） 、 纯度 （HPLC-SEC） 、 分子量、 紫外光谱、 等电点、 残余外源 DNA、 内毒素含量、 唾液酸含量、 CHO 蛋白残留、 小牛血清残留量、 酶切胎图 谱、 N- 末端氨基酸序列分析都符合标准。 说 明 书 CN 103205478 A 6 。