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1、(10)申请公布号 CN 103194440 A (43)申请公布日 2013.07.10 CN 103194440 A *CN103194440A* (21)申请号 201210003952.X (22)申请日 2012.01.09 C12N 15/10(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号 (72)发明人 张震宇 顾春银 徐灿 李忠浩 杨冬美 (54) 发明名称 一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基 因组的方法 (57) 摘要 一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基 因组的方法， 。
2、包括采用 lyticase 破壁、 蛋白酶 k 与 RNase 除去组蛋白和 RNA、 氯仿抽提、 沉淀、 溶 解。本发明从影响酿酒酵母基因组提取的质和量 入手， 将破壁和去除蛋白、 RNA 的过程分开， 分别 采用不同的缓冲液及添加还原剂来保证破壁的效 率和除去杂质的效果。在工艺过程上进行了更细 致的优化， 增加了抽提的次数， 使基因组更加完整 并提高了纯度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书2页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103194440 A CN 103。
3、194440 A *CN103194440A* 1/1 页 2 1. 一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法， 其特征在于 ： 包括破壁、 去除组蛋白和 RNA、 抽提、 沉淀、 溶解， 具体工艺过程如下 ： 破壁 ： 用 500l 的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母， 加入 40l、 1000U/ml 的 lyticase 和 1l - 巯基乙醇， 混匀后 37孵育 3h。 去除组蛋白和 RNA ： 8000r/min 1min 离心弃上清 ( 加速要慢 )， 加 500lTE 缓冲液 (pH8.0)， 混匀后加 50l、 10 SDS， 加入 10l、 200mg/ml 蛋白酶 k， 再。
4、加入 10l、 10g/ml RNase， 37孵育 1h。 抽提 ： 加入 500l 平衡酚， 颠倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1min。移取上层加入 250l 平衡酚和 250l 氯仿异戊醇 (24 1) 颠倒混匀、 静置 5min， 加 500l 氯仿， 颠 倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1min， 取上层水相。 沉淀 ： 加入 2 倍体积无水乙醇， -20放置 1h。12000r/min 离心 10min。 溶解 ： 弃上清并置于超净台吹干， 加入 50l ddH2O 溶解 DNA。 所述山梨醇缓冲液为 ： 1mol/L， pH 7.5 。
5、； 所述 TE 缓冲液为 ： 1mol/LTrisCl， pH 8.0， 0.5mol/L EDTA， 0.5mol/L 柠檬酸， 加水至 1000ml。 权 利 要 求 书 CN 103194440 A 2 1/2 页 3 一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方法 技术领域 0001 本发明涉及微生物的分子生物学领域， 特别提供了一种从酿酒酵母细胞中高效提 取高分子量基因组的方法。通过该方法提取的基因组可以满足许多分子生物学分析的需 要。 背景技术 0002 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为低等真核生物， 与同属真核生物的动物 和植物细胞在结构上有很多相。
6、似性。早在 1996 年酿酒酵母的基因组测序工作就已完成， 是 被人们了解最多的微生物之一。酿酒酵母具有易于培养且繁殖迅速的特点， 经常被用来作 为研究真核生物的工程菌。酿酒酵母被广泛应用于食品生产和基因工程领域。目前对酿酒 酵母的研究已经上升到了分子水平， 随着对其生理机制研究的深入， 酿酒酵母的一些功能 蛋白的基因经常被用来在其它工程菌中克隆、 表达。 研究中对于酿酒酵母基因组的需求， 无 论是在量或质上都大为提高。 0003 目前实验室提取酵母基因组 DNA 的方法主要有试剂盒法、 液氮研磨法、 化学试剂 法。但这些方法往往只能适用于部分酵母， 缺乏通用性， 对于酿酒酵母基因组的提取， 。
7、效果 往往不够理想。由于缺乏专门针酿酒酵母这一特定酵母基因组的提取方法， 本专利通过多 次优化实验流程和试剂配方， 总结出一种从酿酒酵母细胞中高效提取高分子量基因组的方 法。 发明内容 0004 为了解决现有酵母基因组提取方法的不足， 本发明提供了一种从酿酒酵母细胞中 高效提取高分子量基因组的方法， 包括破壁、 去除组蛋白和 RNA、 抽提、 沉淀、 溶解， 具体工艺 过程如下 ： 0005 破壁 ： 破解细胞壁与细胞膜是提取基因组 DNA 的基础， 由于酿酒酵母细胞壁结构 比细菌细胞壁更为坚固、 厚实， 一般的溶菌酶并不能有效的分解酿酒酵母的细胞壁， 因此本 专利使用 lyticase 来破。
8、除细胞壁。 0006 用 500l 的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母， 加入 40l、 1000U/ml 的 lyticase 和 1l- 巯基乙醇， 混匀后 37孵育 3h。 0007 去除组蛋白和 RNA ： 对破壁后的细胞使用蛋白酶 k 和 RNase 去除染色体上的组蛋 白和不需要的 RNA。 0008 8000r/min 1min 离心弃上清 ( 加速要慢 )， 加 500lTE 缓冲液 (pH8.0)， 混匀后 加 50l、 10 SDS， 加入 10l、 200mg/ml 蛋白酶 k， 再加入 10l、 10g/ml RNase， 37孵育 1h。 0009 抽提 ： 加入 500l 。
9、平衡酚， 颠倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1mmin。移取上 层加入 250l 平衡酚和 250l 氯仿异戊醇 (24 1) 颠倒混匀、 静置 5min， 加 500l 氯 仿， 颠倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1min， 取上层水相。 说 明 书 CN 103194440 A 3 2/2 页 4 0010 沉淀 ： 取上层水相， 加入 2 倍体积无水乙醇， -20放置 1h。12000r/min 离心 10min。 0011 溶解 ： 弃上清并置于超净台吹干， 加入 50l ddH2O 溶解 DNA。 0012 所述山梨醇缓冲液为 ： 1mol。
10、/L， pH 7.5 ； 0013 所述 TE 缓冲液为 ： 1mol/LTrisCl， pH 8.0， 0.5mol/L EDTA， 0.5mol/L 柠檬酸， 加 水至 1000ml ； 0014 Lyticase(1000U/ml) 蛋白酶 k(200mg/ml)RNase(10g/ml)。 0015 本发明从影响酿酒酵母基因组提取的质和量入手， 将破壁和去除蛋白、 RNA 的过程 分开， 分别采用不同的缓冲液及添加还原剂来保证破壁的效率和除去杂质的效果。在工艺 过程上进行了更细致的优化， 增加了抽提的次数， 使基因组更加完整并提高了纯度， 能更好 地满足分子生物学的需求。 附图说明 0。
11、016 图 1 ： 1、 2、 3 为本方法提取的基因组 ； 4 为用蜗牛酶法 ； 5 为 SDS 反复冻融法 ； M 为 -HindIII digestDNA 分子量标准。 具体实施方式 0017 实施例 1 ： 0018 挑取酿酒酵母BY4742单菌落培养至OD3， 收集湿重约1g的新鲜菌体， 山梨醇洗 涤一次 ； 0019 加入 500l 的山梨醇缓冲液悬浮酿酒酵母， 加入 40l、 1000U/ml 的 lyticase 和 1l- 巯基乙醇， 混匀后 37孵育 3h ； 0020 8000r/min 1min 离心弃上清 ( 加速要慢 )， 加 500l TE 缓冲液 (pH8.0)。
12、， 混匀后 加 50l、 10 SDS， 加入 10l、 200mg/ml 蛋白酶 k， 再加入 10l、 10g/ml RNase， 37孵育 1h ； 0021 加入 500l 平衡酚， 颠倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1min。移取上层加入 250l 平衡酚和 250l 氯仿异戊醇 (24 1) 颠倒混匀、 静置 5min， 加 500l 氯仿， 颠 倒混匀、 静置 5min， 8000r/min 离心 1min， 取上层水相 ； 0022 加入 2 倍体积无水乙醇， -20放置 1h。12000r/min 离心 10min ； 0023 弃上清并置于超净台吹干， 加入 50l ddH2O 溶解 DNA。 说 明 书 CN 103194440 A 4 1/1 页 5 图 1 说 明 书 附 图 CN 103194440 A 5 。