一种阿拉瑞林的固液相合成法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102702327 B (45)授权公告日 2013.10.30 CN 102702327 B *CN102702327B* (21)申请号 201210204261.6 (22)申请日 2012.06.20 C07K 7/23(2006.01) C07K 1/06(2006.01) C07K 1/04(2006.01) (73)专利权人 吉尔生化 （上海） 有限公司 地址 上海市闵行区紫月路 519 号 专利权人 上海吉尔多肽有限公司 滨海吉尔多肽有限公司 (72)发明人 徐红岩 竺剑峰 饭岛悠介 (74)专利代理机构 上海浦东良风专利代理有限 责任公司 31113。

2、 代理人 张劲风 CN 101279998 A,2008.10.08, 全文 . US 2009/0131587 A1,2009.05.21, 全文 . CN 101935339 A,2011.01.05, 全文 . (54) 发明名称 一种阿拉瑞林的固液相合成法 (57) 摘要 本发明涉及阿拉瑞林的一种固液结合的合成 方法。 主要解决现有合成方法存在的收率低、 成本 高、 反应条件苛刻、 污染大的技术问题。本发明主 要合成步骤 ： 1） 以脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树 脂为起始树脂采用芴甲氧羰基固相合成法逐一偶 联每一个保护氨基酸， 合成得到侧链全保护的肽 链树脂 ； 2） 对侧。

3、链全保护的肽链树脂进行切割， 得到全保护的肽链片段 pGluP-9 ； 3） 对全保护的 肽链片段pGluP-9进行C端乙胺化， 得到阿拉瑞林 的全保护片段 ； 4） 对阿拉瑞林的全保护片段切割 除去侧链保护基， 得到阿拉瑞林粗品肽。 本发明具 备大规模化生产能力， 操作简易、 工艺稳定、 生产 成本低， 总收率超过 40%。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘洋 权利要求书 2 页 说明书 7 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书7页 (10)授权公告号 CN 102702327 B CN 102702327 B *CN1027。

4、02327B* 1/2 页 2 1. 一种阿拉瑞林的固液相合成法， 其特征在于， 包括如下步骤 ： 1） 步骤 1） 包括 ： 取脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂用二氯甲烷浸泡， 使树脂充分溶胀， 抽干， 以 N,N- 二甲基甲酰胺作溶剂， 加入芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰 基） 精氨酸、 N- 甲基吗啉或二异丙基乙胺， 用 O- 苯并三唑 -N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸 盐 /1- 羟基苯并三唑、 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 /1- 羟基苯 并三唑、 O-(7- 偶氮苯并三氮唑 -。

5、1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基 -7- 偶 氮苯并三唑中的一种混合物为缩合剂， 反应 0.5-2 小时， 茚三酮法检测反应终点， 抽干， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 抽干， 获得芴甲氧羰基 -（2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋 喃 -5- 磺酰基） 精氨酸 - 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂 ； 在步骤获得的树脂中， 加入脱帽试剂， 反应 10-30 分钟， 抽干， 用 N,N- 二甲基甲酰 胺洗涤 5-10 次， 抽干， 以 N,N- 二甲基甲酰胺为溶剂， 加入具有芴甲氧羰基保护的氨基酸、 N-甲基吗啉或二异丙基。

6、乙胺， 以及用O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟 基苯并三唑、 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 /1- 羟基苯并三唑、 O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-氧)-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/1-羟基-7-偶氮苯并三 唑中的一种混合物为缩合剂， 反应 0.5-2 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 N,N- 二甲基甲酰胺 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有芴甲氧羰基保护基团 的氨基酸， 如此反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 再用 甲醇和二。

7、氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得焦谷氨酸 -( 三 苯甲基 ) 组氨酸 -（叔丁氧羰基） 色氨酸 -（叔丁氧基） 丝氨酸 -（叔丁氧基） 酪氨酸 -D- 丙氨 酸 - 亮氨酸 - （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰基） 精氨酸 - 脯氨酸 -2 氯 - 三苯 甲基 - 氯树脂 ； 所说的具有芴甲氧羰基保护基团的氨基酸， 依次包括 ： 芴甲氧羰基亮氨酸， 芴甲氧羰基 -D- 丙氨酸， 芴甲氧羰基叔丁氧基酪氨酸， 芴甲氧羰基叔丁氧基丝氨酸， 芴甲氧 羰基叔丁氧羰基色氨酸， 芴甲氧羰基三苯甲基组氨酸 ； 2）在侧链全保护的肽链树脂。

8、加入切肽试剂， 反应 1-3 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收 集滤液， 减压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 ； 3） 将全保护的肽链片段 pGluP-9 溶于 N,N- 二甲基甲酰胺溶液中， 加入乙胺盐酸盐、 二 异丙基乙胺， 用 ( 苯并三唑 -1- 氧 )- 三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基苯并三唑、 二 异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑、 O-苯并三唑-N,N,N,N-四甲基脲鎓六氟磷酸盐/ 1-羟 基苯并三唑中一种混合物为缩合剂， 搅拌反应 12-24 小时， 乙胺盐酸盐的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1。

9、-5 倍， 缩合剂的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1-5 倍， 二异丙基乙 胺的用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的3-15倍， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色 固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的全保护片段 ； 4） 将阿拉瑞林的全保护片段中加入去保护试剂， 去保护试剂选用体积比三氟乙酸 : 水 : 三异丙基硅烷 =95:2:3 的混合试剂， 或者是体积比为三氟乙酸 : 苯甲硫醚 : 苯酚 : 乙 二硫醇 : 水 =87.5:5:2.5:2.5:2.5 的混合试剂， 反应时间是 1-3 小时， 反应结束后， 加乙醚 沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 。

10、次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 1） 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树 权 利 要 求 书 CN 102702327 B 2 2/2 页 3 脂的取代度在 0.3mmol/g-1.2mmol/g 之间， 芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋 喃 -5- 磺酰基） 精氨酸的量为树脂摩尔量的 1-5 倍 ； 脱帽试剂为体积比 10-30% 的哌啶 / N,N- 二甲基甲酰胺混合溶液， 每一步保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的 1-5 倍， 缩合试剂 的量是树脂摩尔量的 1-5 倍， N- 甲基吗啉或二异丙基。

11、乙胺的量是树脂摩尔量的 2-10 倍， 每 一步反应终点的检测方法所采用的是茚三酮检测法。 3. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 脯氨酸 -2 氯 - 三苯甲基 - 氯树脂的取代 度为 0.6mmol/g， 芴甲氧羰基 （2,2,4,6,7- 五甲基 -2H- 苯并呋喃 -5- 磺酰基） 精氨酸的量 为树脂摩尔量的2倍 ； 脱帽试剂为体积比20%的哌啶/N,N-二甲基甲酰胺混合溶液， 每一步 保护氨基酸的量的是树脂摩尔量的 2 倍， 缩合试剂为 O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲 基脲鎓六氟硼酸盐/1-羟基苯并三唑， 其用量是树脂摩尔量的2倍， 二异丙基乙胺。

12、的量是树 脂摩尔量的 4 倍。 4. 根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤2） 所用的切肽试剂为体积比为1%-5% 的三氟乙酸 / 二氯甲烷混合溶液。 5. 根据权利要求 4 所述的方法， 其特征在于所用的切肽试剂为体积比为 2% 的三氟乙 酸 / 二氯甲烷混合溶液。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 步骤 3）缩合试剂选用 ( 苯并三 唑 -1- 氧 )- 三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 /1- 羟基苯并三唑， 搅拌反应 18 小时， 乙胺盐酸 盐的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， 缩合剂的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数 的 1.5 倍， 二。

13、异丙基乙胺的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 6 倍。 权 利 要 求 书 CN 102702327 B 3 1/7 页 4 一种阿拉瑞林的固液相合成法 技术领域 0001 本发明涉及一种阿拉瑞林的合成方法， 特别涉及一种阿拉瑞林的固液相合成法。 背景技术 0002 阿拉瑞林， 中文名称为醋酸阿拉瑞林， 又名丙氨瑞林， 英文名称 Alarelin Acetate, 多 肽 序 列 为 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHC2H5, 分 子 式 C56H78N16O12, 分子量为 1167.30, 结构式如下 : 0003 0004 本品为。

14、人工合成的促性腺激素释放激素 （GnRH） 的九肽类似物， 用药初期可刺激垂 体释放促黄体生成素 （LH） 和促卵泡素 （FSH） 引起卵巢源性甾体激素短暂升高 ； 重复用药可 抑制垂体释放 LH 和 FSH 使血中的雌二醇水平下降达到药物去卵巢的作用这种抑制作用可 用于治疗子宫内膜异位症等激素依赖性疾病。 发明内容 0005 本发明的目的是提供了一种高收率、 低成本、 反应条件温和、 环境污染小、 有利于 实现产业化的阿拉瑞林的固液相结合的合成方法。主要解决现有合成方法存在的收率低、 成本高、 反应条件苛刻、 污染大的技术问题。 0006 为实现上述目的， 本发明采取以下技术方案 ： 000。

15、7 一种阿拉瑞林的固液相合成方法， 包括如下步骤 ： 0008 1） 以H-Pro-2Cl-Trt-Cl树脂为起始树脂采用Fmoc固相合成法逐一偶联每一个保 护氨基酸， 合成得到侧链全保护的肽链树脂 ； 0009 2） 对侧链全保护的肽链树脂进行切割， 得到全保护的肽链片段 pGluP-9 ； 0010 3） 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化， 得到阿拉瑞林的全保护片段 ； 0011 4） 对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基， 得到阿拉瑞林粗品肽 ； 0012 按照本发明， 依次连接每一个保护氨基酸， 获得侧链全保护的肽链树脂， 其间依次 脱除 Fmoc- 保护基团。

16、的方法包括如下步骤 ： 0013 1） 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂用 DCM 浸泡， 使树脂充分溶胀， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 依次加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 NMM 或 DIEA， 用 HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种 说 明 书 CN 102702327 B 4 2/7 页 5 混合物为缩合剂， 反应 0.5-2 小时， 茚三酮法检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 ； 0014 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂取。

17、代度为 ： 0.3mmol/g1.2mmol/g， 更为优化的方案为 0.6mmol/g ； 0015 Fmoc-Arg(pbf)-OH 的量为树脂摩尔量的 1-5 倍， 更为优化的方案为树脂摩尔量的 2 倍。 0016 2） 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入脱帽试剂， 反应 10-30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 5-10 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具有 Fmoc 保护的氨基 酸、 NMM 或 DIEA， 以及用 HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种混合物为缩合剂， 反 应 0。

18、.5-2 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱 保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸， 用 N,N- 二甲基甲酰胺洗涤 3-5 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩 树脂， 抽干， 真空干燥 , 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu -Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 ； 0017 脱帽试剂的配比为10%-30%的PIP/DMF(v/v)溶液， 更为优化的方案为20%的。

19、PIP/ DMF(v/v) 溶液 ； Fmoc 保护的氨基酸的量为树脂摩尔量的 1-5 倍， 更为优化的方案为树脂摩 尔量的 2 倍 ； 缩合试剂 （HBTU/HOBT、 TBTU/HOBT、 HATU/HOAT 中的一种混合物） 的量为树脂摩 尔量的 1-5 倍， 更为优化的方案为 TBTU/HOBT 的量为树脂摩尔量的 2 倍 ； NMM 或 DIEA 的量 为树脂摩尔量的 2-10 倍， 更为优化的方案为 DIEA 为树脂摩尔量的 4 倍 ； 所说的具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 依次包括 ： 0018 Fmoc-Leu-OH，Fmoc-D-Ala-OH，Fmoc-Tyr(tbu)-。

20、OH，Fmoc-Ser(tbu)-OH， Fmoc-Trp(boc)-OH， Fmoc-His(Trt)-OH。 0019 按照本发明， 所述的切肽包括如下步骤 ： 0020 在上述步骤 (2) 所获得的 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala- Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中加入 1%-5%TFA/DCM(v/v) 切肽试剂， 反应 1-3 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获 得全保护的肽链片段 pGluP-9 ； 0021 更为优化的方案。

21、为选用 2%TFA/DCM(v/v) 切肽试剂， 反应 2 小时。 0022 按照本发明， 所述的对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化的方法步骤如 下 ： 0023 将全保护的肽链片段pGluP-9溶于DMF溶液中， 加入乙胺盐酸盐、 DIEA ， 用PyBOP/ HOBT、 DIC /HOBT、 HBTU/ HOBT 中一种混合物为缩合剂， 搅拌反应 12-24 小时， 乙胺盐酸盐的 用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的1-5倍， 缩合剂的用量是肽链片段pGluP-9摩尔数的1-5 倍， DIPEA 的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 3-15 倍， 反应结束后， 。

22、加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的全保护片段 ； 0024 更为优化的方案为 ： 乙胺盐酸盐的用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， 缩 合试剂选用 PyBOP/HOBT， 用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 1.5 倍， DIEA 用量是肽链片段 pGluP-9 摩尔数的 6 倍， 反应时间 18 小时。 0025 按照本发明， 所述的对阿拉瑞林的全保护片段切割除去侧链保护基的方法步骤如 说 明 书 CN 102702327 B 5 3/7 页 6 下 ： 0026 将 阿 拉 瑞 林 的 全 保 护 片 段 中 加 入 去 保 护 。

23、试 剂，去 保 护 试 剂 的配比是 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v), 或者是 TFA: 苯甲硫醚 : 苯 酚 :EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)。反应时间是 1-3 小时， 反应结束后， 加乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 ； 0027 更为优化的方案是选用 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v) 的去保护试剂， 反应 2 小时。 0028 本发明中一些常用缩写具有以下含义 0029 HBTU ： O- 苯并三唑 -N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 0030 HATU ： O-(7。

24、- 偶氮苯并三氮唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟磷酸盐 0031 TBTU ： O-( 苯并三唑 -1- 氧 )-N,N,N,N- 四甲基脲鎓六氟硼酸盐 0032 PyBOP ： ( 苯并三唑 -1- 氧 )- 三吡咯烷子基磷鎓六氟磷酸盐 0033 DIC ： 二异丙基碳二亚胺 0034 HOBt ： 1- 羟基苯并三唑 0035 HOAt ： 1- 羟基 -7- 偶氮苯并三唑 0036 DIEA ： 二异丙基乙胺 0037 PIP ： 哌啶 0038 NMM ： N- 甲基吗啉 0039 Fmoc ： 芴甲氧羰基 0040 Pbf ： 2,2,4,6,7- 五甲基 -2H。

25、- 苯并呋喃 -5 磺酰基 0041 Trt ： 三苯甲基 0042 Tbu ： 叔丁基 0043 Boc ： 叔丁氧羰基 0044 pGLu ： 焦谷氨酸 0045 His ： 组氨酸 0046 Trp ： 色氨酸 0047 Ser ： 丝氨酸 0048 Tyr ： 酪氨酸 0049 D-Ala ： D- 丙氨酸 0050 Leu ： 亮氨酸 0051 Arg ： 精氨酸 0052 Pro ： 脯氨酸 0053 Piperide ： 哌啶 0054 DMF ： N,N- 二甲基甲酰胺 0055 DCM ： 二氯甲烷 0056 TFA ： 三氟乙酸 0057 EDT ： 乙二硫醇 0058 T。

26、is ： 三异丙基硅烷 0059 pGluP-9 ： 序列为 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg (pbf)-Pro-OH 九肽的缩写。 说 明 书 CN 102702327 B 6 4/7 页 7 具体实施方式 0060 以下将参照实例对本发明做进一步的详细描述， 但本发明不限于这具体实例。 0061 实施例 1 0062 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 0063 称 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 50 克 (Loading 0.6mmol/g, 30mmol。

27、)，用 800ml DCM 浸泡 30 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8， 60mmol) 38.9g， TBTU(MW:321.1， 60mmol) 19.3g， HOBT(MW:135.1， 60mmol) 8.1g， DIEA(MW:129.24， 120mmol)20ml， DMF500ml， 反应 1.5 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0064 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Se。

28、r(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 0065 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具 有 Fmoc 保护的氨基酸、 DIEA、 TBTU/HOBT、 ， 反应 1.5 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基。

29、团的氨基酸， 如 此反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后， DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(t bu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 102g。 0066 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 60mmol)21.2g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 60mmol)18.7g， Fmoc-Tyr(。

30、tbu)-OH (MW:459.5， 60mmol)27.6g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 60mmol)23g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)31.6g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 60mmol)37.2g， pGlu-OH (MW:129.1， 60mmol)7.7g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： TBTU(MW:321.1， 60mmol) 19.3g， HOBT(MW:135.1， 60mmol) 8.1g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： DIEA(MW:129.24。

31、， 120mmol)20ml。 0067 3） 制备全保护的肽链片段 pGluP-9 0068 取 步 骤 （2）中 的 pGLu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Ar g(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 102g， 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 切肽试剂 , 配比 为 2%TFA/DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减 压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 51.2g。 0069 4)。

32、 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 0070 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段pGluP-9共51.2g溶于2L DMF溶液中， 加入1.5eq 的乙胺盐酸盐 3.67g、 1.5eq PyBOP 23.4g、 1.5eq HOBT 6.08g 、 6eq DIEA 30ml， 25搅拌反应 18 小时， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获 得阿拉瑞林的全保护片段共 53.2g。 0071 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 0072 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共 53.2g 置于 2L 的圆底。

33、烧瓶中， 加入 1000ml 说 明 书 CN 102702327 B 7 5/7 页 8 去保护试剂， 配比为 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v)， 25恒温振荡反应 2 小时， 反应结束后， 加 乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 31.2g。粗品 收率 89.1%， 粗品纯度 75.8%。 0073 实施例 2 0074 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 0075 称 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 67 克 (Loading 0.45mmol/g, 30mmol)， 用。

34、 800ml DCM 浸泡 30 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8， 90mmol) 58.4g， HBTU(MW:379.2， 90mmol) 34.1g， HOBT(MW:135.1， 90mmol) 12.2g， NMM(MW:102.1， 180mmol)20ml， DMF500ml， 反应 1 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽 干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0076 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu。

35、)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 0077 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具 有 Fmoc 保护的氨基酸、 NMM、 HBTU/HOBT， 反应 1 小时， 检测反应终点， 抽干， 用 DMF 洗涤 3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此 。

36、反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后， DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu) -D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 115g。 0078 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 90mmol)31.8g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 90mmol)28.0g， Fmoc-Tyr(tbu)-OH (M。

37、W:459.5， 90mmol)41.4g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 90mmol)34.5g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)47.4g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 90mmol)55.8g， pGlu-OH (MW:129.1， 90mmol)11.6g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： HBTU(MW:379.2， 90mmol) 34.1g， HOBT(MW:135.1， 90mmol) 12.2g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： NMM(MW:102.1， 180mmo。

38、l)20ml。 0079 3） 制备全保护的肽链片段 pGluP-9 0080 取 步 骤 （2）中 的 pGLu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Ar g(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 115g， 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 切肽试剂 , 配比 为 2%TFA/DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减 压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 47.2g。 0081 4) 对全保护的肽链。

39、片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 0082 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段pGluP-9共49.6g溶于2L DMF溶液中， 加入1.5eq 的乙胺盐酸盐 3.67g、 1.5eq PyBOP 23.4g、 1.5eq HOBT 6.08g 、 6eq DIEA 30ml， 25搅拌反应 18 小时， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获 得阿拉瑞林的全保护片段共 48.5g。 0083 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 0084 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共48g置于2L的圆底烧瓶中， 加入1000ml去。

40、 说 明 书 CN 102702327 B 8 6/7 页 9 保护试剂， 配比为 TFA:H2O:Tis=95:2:3(v/v)， 25恒温振荡反应 2 小时， 反应结束后， 加乙 醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干燥， 获得阿拉瑞林粗品 28.6g。粗品收 率 81.7%， 粗品纯度 65.2%。 0085 实施例 3 0086 1) 制备 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 0087 称 取 H-Pro-2Cl-Trt-Cl 树 脂 42 克 (Loading 0.72mmol/g, 30mmol)， 用 800ml DCM 浸泡 3。

41、0 分钟， 使树脂充分溶胀， 抽干， 加入 Fmoc-Arg(pbf)-OH (MW:648.8， 60mmol) 38.9g， HATU(MW:380.23， 60mmol) 22.8g， HOAT(MW:136.1， 60mmol) 8.2g， NMM(MW:102.1， 120mmol)14ml， DMF500ml， 反应 0.5 小时， 茚三酮检测树脂无色透明， 抽干， 用 DMF 洗涤 3 次， 抽干， 获得 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂。 0088 2） 制备 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-A。

42、la-Leu-Arg(pbf)-Pro -2Cl-Trt-Cl 树脂 0089 在步骤 （1） 的 Fmoc-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂中， 加入 800ml 脱帽试剂 (20% 的 PIP/DMF(v/v) 溶液 )， 反应 30 分钟， 抽干， 用 DMF 洗涤 6 次， 抽干， 以 DMF 做溶剂， 加入具 有Fmoc保护的氨基酸、 NMM、 HATU/HOAT， 反应0.5小时， 检测反应终点， 抽干， 用DMF洗涤3-5 次， 抽干， 然后再加入脱保护试剂， 脱保护反应， 再加入具有 Fmoc 保护基团的氨基酸， 如此 反复， 直至连完最后一个焦谷氨酸之后，。

43、 DMF 洗涤 3 次， 再用甲醇和二氯甲烷交替洗涤 3 次， 最后加甲醇收缩树脂， 抽干， 真空干燥， 获得 pGlu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu) -D-Ala-Leu-Arg(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 92g。 0090 每 一 步 缩 合 反 应 所 加 入 的 氨 基 酸 的 量 分 别 为 ： Fmoc-Leu-OH (MW:353.4， 60mmol)21.2g， Fmoc-D-Ala-OH (MW:311.3， 60mmol)18.7g， Fmoc-Tyr(tbu)-OH (MW:459.5， 60mmol)27.6。

44、g，Fmoc-Ser(tbu)-OH (MW:383.4， 60mmol)23g，Fmoc-Trp(Boc)-OH (MW:526.6， 60mmol)31.6g， Fmoc-His(Trt)-OH (MW:619.7， 60mmol)37.2g， pGlu-OH (MW:129.1， 60mmol)7.7g， 每一步缩合反应所采用的缩合剂的量为 ： HATU(MW:380.23， 60mmol) 22.8g， HOAT(MW:136.1， 60mmol) 8.2g， 每一步缩合反应所添加的有机碱的量为 ： NMM(MW:102.1， 120mmol)14ml。 0091 3） 制备全保护的肽。

45、链片段 pGluP-9 0092 取 步 骤 （2）中 的 pGLu-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Ala-Leu-Ar g(pbf)-Pro-2Cl-Trt-Cl 树脂 92g， 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 切肽试剂 , 配比 为 2%TFA/DCM(v/v)， 于恒温摇床中 25振荡反应 2 小时， 抽滤滤掉树脂颗粒， 收集滤液， 减 压蒸馏除去溶剂， 加水析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得全保护的肽链片段 pGluP-9 共 49.3g。 0093 4) 对全保护的肽链片段 pGluP-9 进行 C 端乙胺化 009。

46、4 将步骤 （3） 中全保护的肽链片段 pGluP-9 共 49.3g 溶于 2L DMF 溶液中， 加入 3eq 的乙胺盐酸盐 7.34g、 3eq DIC 11.4g、 3eq HOBT 12.2 g 、 12eq DIEA 60ml， 25搅拌反应 18 小时， 反应结束后， 加柠檬酸饱和溶液， 析出白色固体， 抽干， 真空干燥， 获得阿拉瑞林的 全保护片段共 51.2g。 0095 5) 对阿拉瑞林全保护片段切割除去侧链保护基获得阿拉瑞林粗品 0096 将步骤 （4） 中的阿拉瑞林全保护片段共 51.2g 置于 2L 的圆底烧瓶中， 加入 1000ml 说 明 书 CN 102702327 B 9 7/7 页 10 去保护试剂， 配比为 TFA: 苯甲硫醚 : 苯酚 :EDT:H2O=87.5:5:2.5:2.5:2.5(v/v)， 25恒温 振荡反应 2.5 小时， 反应结束后， 加乙醚沉淀， 离心收集沉淀， 再用乙醚洗涤 3-6 次， 真空干 燥， 获得阿拉瑞林粗品 29.8g。粗品收率 85.1%， 粗品纯度 72.3%。 说 明 书 CN 102702327 B 10 。