技术领域：
本发明属于微生物发酵技术领域，具体是指在11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮制备方法中一 种提高16α，17α-环氧黄体酮转化率的方法。
技术背景：
11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮(简称霉菌)，是一种重要的激素类药物中间体，广泛应用 于激素类药物的合成，是氢化可的松、可的松、强的松和肤轻松等甾体激素类药物的重要原 料。
16α，17α-环氧黄体酮(16α，17α-Epoxyprogesterone，EP)全名16，17a-环氧-4-孕甾烯-3，20- 二酮，又名沃氏氧化物，是一种无臭、白色结晶粉末，在甲醇、乙醇、苯中溶解度小。
16α，17α-环氧黄体酮转化为11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮分子结构
1952年Upjohn公司的Murray和Peterson最早发现了黑根霉对甾体具有C11α羟化反应能 力，使孕酮一步转化成C11α-羟基孕酮。1955年Skull和Kita用新月弯孢霉(Curvularia lunata) 由脱氧皮质醇经11β羟基化作用制成了皮质醇。1955年，我国著名有机化学家黄鸣龙先生以 薯芋皂素为原料，经开环、氧化、环氧化等生成中间产物16α，17α-环氧黄体酮，然后用微生物 黑根霉菌发酵，在C-α位上引入羟基制的霉菌，并在此基础上再经溴化、碘置换等反应成功的 冲破国外文献记载的十四步反应的束缚，创出七步反应制备可的松的方法，并实现了产业化， 填补了我国甾体激素药物的空白。黑根霉菌发酵是这一系列反应的关键步骤，因为采用生物 发酵，转化率仅为44％左右，且产品中含有大量的未反应完的16α，17α-环氧黄体酮及发酵过程 中产生的副产物，需对产品进行进一步的分离精制。造成产品损失较大，总收率较低，成本 较高。
2007年河北农业大学李安华，在500mL摇瓶中利用绿僵菌进行16α、17α环氧黄体酮转 化，64h转化率达72％左右，随后在100L发酵罐中放大，转化率为53％左右(《河南科学》2007 年第5期)。
2011年浙江工业大学王丽娅等通过低能氮离子注入诱变，获得一株银汉霉突变株，进行 16α、17α-环氧黄体酮转化，48h投料，转化率达58％(《浙江化工》，2011年第42卷第10期)。
造成上述16α、17α-环氧黄体酮转化率较低的主要原因是水相发酵与16α，17α-环氧黄体 酮难溶性的矛盾，限制了底物与胞内酶的接触，从而使该反应的速度和产率都很低，成为甾 体工业发展的瓶颈。
由此可见，提高16α，17α-环氧黄体酮在发酵过程中转化率是分离、生产出高收率、高纯 度11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的前提和基础，无论采用怎样的结晶、萃取和过滤方法，都 得首先提高16α，17α-环氧黄体酮转化为11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮的转化率，其问题的关 键仍然是发酵过程，所以寻求合适的发酵方法已迫在眉睫。
发明内容
针对现有微生物发酵生产11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮工艺的缺陷，本发明所解决的技 术问题是利用耐受甲苯的赭曲霉(aspergillus ochraceus)菌株，在两相催化系统中，实现对具 有多个手性碳的甾体底物16α，17α-环氧黄体酮11位手性碳选择性11α生物催化，获得产物11α- 羟基-16α，17α-环氧黄体酮，双液相发酵的方法可以有效地解决底物和产物的溶解问题，增 加了与细胞的接触面积，缩短了转化时间，进而有效提高了16α，17α-环氧黄体酮的溶解度和 转化率。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种提高16α，17α-环氧黄体酮转化率的方法包括以下步骤：
(1)斜面制备
将赭曲霉试管菌种接种于土豆斜面培养基，25-28℃恒温培养4-7d生成黄色孢子，覆盖 在斜面上，颜色为灰黄色，于土豆斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏斜面培 养基上，25-28℃培养7-10d，可生成金黄色孢子，即得生产用斜面，于冰箱中4℃恒温保存 2-3个月备用。超过此期限则再按上述步骤重新培养、保存。
所述赭曲霉(Aspergillus ochraccus)菌种保藏于天津科技大学工业微生物菌种保藏中 心，保藏编号为TCCC41060；
所述土豆斜面培养基组成为：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，酵母膏1 g/L，纯净水1000mL，pH值6.8，121℃蒸汽灭菌20min；
所述酵母膏斜面培养基组成为：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L， 琼脂20g/L，纯净水1000mL，pH值5.8，121℃蒸汽灭菌20min。
(2)孢子悬液制备
将含2‰(w/v)吐温80的无菌水加入步骤(1)保存的生产斜面中，洗下孢子，血球计 数板计数，配制、调整孢子悬液浓度为4×106-8×106个/mL。
(3)静息细胞制备
将步骤(2)中的孢子悬液按8-10％的接种量接入液体培养基，28-30℃培养24-30h后， 发酵液抽滤，用3-5倍的无菌水洗涤菌体两遍，即得菌体静息细胞。
所述液体培养基组成为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、MgSO42g/L， 纯净水1000mL，pH值5.8，121℃蒸汽灭菌20min。
(4)两相体系中的转化
向加塞瓶中加入双液相培养基和步骤(3)中的静息细胞，同时加入16α，17α-环氧黄体酮 和浓度为30％的H2O2溶液，于28-30℃，180-200r/min振荡培养46-48h。
所述双液相培养基由无菌水和邻苯二甲酸二丁酯混合而成；
所述双液相培养基中无菌水与邻苯二甲酸二丁酯的质量比为3∶1-4∶1；
所述静息细胞的添加量为双液相培养基的7-10％；
所述双液相培养基每100ml添加1-2g16α，17α-环氧黄体酮；
所述H2O2溶液的添加量为双液相培养基的0.8-1.2％。
(5)过滤
将步骤(4)中的发酵液于室温用500-800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤， 操作压力为0.14-0.24Mpa；
所述硅藻土粒度为100目-300目。
(6)萃取
将步骤(5)中的滤液于80℃加热30min，冷却至室温，以乙酸乙酯萃取3次。
(7)结晶
萃取后利用旋转蒸发仪将有机相浓缩至较小体积，室温冷却结晶。
(8)重结晶精制
结晶产物再用氯仿-甲苯(82％v/v)混合溶剂进行重结晶精制，60℃烘干至恒重，即得 11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮白色针状结晶体。
有益效果：
本发明提供了一种利用赭曲霉在两相系统中催化生产11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮 的方法。通过添加有机溶剂邻苯二甲酸二丁酯，有效地解决底物和产物的溶解问题，增加与 细胞的接触面积，简化分离过程，缩短了转化的时间，大大提高了底物的转化率，16α，17 α-环氧黄体酮转化率可达84％以上，为生产出高收率、高纯度的11α-羟基-16α，17α-环氧 黄体酮奠定了坚实的实践生产基础，从而降低了生产成本，提高了企业经济效益。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本 领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围， 本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实 质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发 明的保护范围。
一、本发明赭曲霉(Aspergillus ochraccus)菌种保藏于天津科技大学工业微生物菌种 保藏中心，保藏编号为TCCC41060。
二、高效液相色谱(HPLC)分析方法
在240nm的波长下，产物与底物都有最大特征吸收，可以用HPLC法在240nm下对转化 产物进行定量分析。
(1)样品制备。
取均一的发酵液1mL于1.5mL的Eppendorf管中，12000r/min离心10min，弃上清， 沉淀加入两倍体积的丙酮或乙酸乙酯，有机相过0.45μm微孔滤膜后，以备HPLC分析。
(2)色谱条件
色谱仪：美国安捷伦高效液相色谱1100/1200型；色谱柱PhenomsilC18(5μ，250mm×4.6 mm)；流动相，乙腈∶水(60∶40)；流速1.2mL/min；检测波长240nm；进样量20μl。
(3)转化率的计算
采用面积归一化法，以该物质的谱峰面积与所有物质(包括底物和产物)的谱峰面积总 和的百分比来表示。
三、培养基组成：
(1)土豆斜面培养基：土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，酵母膏1g/ L，纯净水1000mL，pH值6.8，121℃蒸汽灭菌20min。
(2)酵母膏斜面培养基：葡萄糖20g/L，大豆蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，琼 脂20g/L，纯净水1000mL，pH值5.8，121℃蒸汽灭菌20min。
(3)液体培养基：培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏20g/L、MgSO42 g/L，纯净水1000mL，pH值5.8，121℃蒸汽灭菌20min。
实施例1
(1)斜面制备
将赭曲霉试管菌种接种于土豆斜面培养基，28℃恒温培养4d生成黄色孢子，覆盖在斜 面上，颜色为灰黄色，于土豆斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏斜面培养基 斜面上，28℃培养7d，可生成金黄色孢子，即得生产用斜面，于冰箱中4℃恒温保存2个月 备用。超过此期限则再按上述步骤重新培养、保存。
(2)孢子悬液制备
将含2‰(w/v)吐温80的无菌水加入步骤(1)保存的生产斜面中，洗下孢子，血球计 数板计数，配制、调整孢子悬液浓度为4×106个/mL。
(3)静息细胞制备
将步骤(2)中的孢子悬液按8％的接种量接入液体培养基，28℃培养24h后，发酵液抽 滤，用3倍的无菌水洗涤菌体两遍，即得菌体静息细胞。
(4)两相体系中的转化
向250ml加塞瓶中加入32mL的无菌水和8mL的邻苯二甲酸二丁酯构成双液相体系，然后 加入步骤(3)中的静息细胞3g，同时加入16α，17α-环氧黄体酮0.4g和浓度为30％的H2O2溶液0.32g，于28℃，180r/min振荡培养46h。
(5)过滤
将步骤(4)中的发酵液于室温用500目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操 作压力为0.14Mpa；
所述硅藻土粒度为100目。
(6)萃取
将步骤(5)中的滤液于80℃加热30min，冷却至室温，以乙酸乙酯萃取3次。
(7)结晶
萃取后利用旋转蒸发仪将有机相浓缩至较小体积，室温冷却结晶。
(8)重结晶精制
结晶产物再用氯仿-甲苯(82％v/v)混合溶剂进行重结晶精制，60℃烘干至恒重，既得 11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮白色针状结晶体。
上述步骤(4)中发酵液发酵46h后，经高效液相色谱(HPLC)分析，发酵液中16α，17 α-环氧黄体酮转化率为84.7％。
实施例2
(1)斜面制备
将赭曲霉试管菌种接种于土豆斜面培养基，26℃恒温培养5d生成黄色孢子，覆盖在斜面 上，颜色为灰黄色，于土豆斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏斜面培养基斜 面上，26℃培养8d，可生成金黄色孢子，即得生产用斜面，于冰箱中4℃恒温保存2个月备 用。超过此期限则再按上述步骤重新培养、保存。
(2)孢子悬液制备
将含2‰(w/v)吐温80的无菌水加入步骤(1)保存的生产斜面中，洗下孢子，血球计 数板计数，配制、调整孢子悬液浓度为6×106个/mL。
(3)静息细胞制备
将步骤(2)中的孢子悬液按9％的接种量接入液体培养基，29℃培养28h后，发酵液抽 滤，用4倍的无菌水洗涤菌体两遍，即得菌体静息细胞。
(4)两相体系中的转化
向250ml加塞瓶中加入31mL的无菌水和9mL的邻苯二甲酸二丁酯构成双液相体系，然后 加入步骤(3)中的静息细胞3.2g，同时加入16α，17α-环氧黄体酮0.6g和浓度为30％的H2O2溶液0.4g，于29℃，190r/min振荡培养47h。
(5)过滤
将步骤(4)中的发酵液于室温用600目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操 作压力为0.20Mpa；
所述硅藻土粒度为200目。
(6)萃取
将步骤(5)中的滤液于80℃加热30min，冷却至室温，以乙酸乙酯萃取3次。
(7)结晶
萃取后利用旋转蒸发仪将有机相浓缩至较小体积，室温冷却结晶。
(8)重结晶精制
结晶产物再用氯仿-甲苯(82％v/v)混合溶剂进行重结晶精制，60℃烘干至恒重，既得 11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮白色针状结晶体。
上述步骤(4)中发酵液发酵47h后，经高效液相色谱(HPLC)分析，发酵液中16α，17 α-环氧黄体酮转化率为84.0％。
实施例3
(1)斜面制备
将赭曲霉试管菌种接种于土豆斜面培养基，25℃恒温培养7d生成黄色孢子，覆盖在斜面 上，颜色为灰黄色，于土豆斜面背面可以观察到红色色素，然后转接在酵母膏斜面培养基斜 面上，25℃培养10d，可生成金黄色孢子，即得生产用斜面，于冰箱中4℃恒温保存2个月备 用。超过此期限则再按上述步骤重新培养、保存。
(2)孢子悬液制备
将含2‰(w/v)吐温80的无菌水加入步骤(1)保存的生产斜面中，洗下孢子，血球计 数板计数，配制、调整孢子悬液浓度为8×106个/mL。
(3)静息细胞制备
将步骤(2)中的孢子悬液按10％的接种量接入液体培养基，30℃培养30h后，发酵液抽 滤，用6倍的无菌水洗涤菌体两遍，即得菌体静息细胞。
(4)两相体系中的转化
向250ml加塞瓶中加入30mL的无菌水和10mL的邻苯二甲酸二丁酯构成双液相体系，然 后加入步骤(3)中的静息细胞4g，同时加入16α，17α-环氧黄体酮0.8g和浓度为30％的H2O2溶液0.48g，于30℃，200r/min振荡培养48h。
(5)过滤
将步骤(4)中的发酵液于室温用800目滤布预涂硅藻土，采用板框过滤机进行过滤，操 作压力为0.24Mpa；
所述硅藻土粒度为300目。
(6)萃取
将步骤(5)中的滤液于80℃加热30min，冷却至室温，以乙酸乙酯萃取3次。
(7)结晶
萃取后利用旋转蒸发仪将有机相浓缩至较小体积，室温冷却结晶。
(8)重结晶精制
结晶产物再用氯仿-甲苯(82％v/v)混合溶剂进行重结晶精制，60℃烘干至恒重，既得 11α-羟基-16α，17α-环氧黄体酮白色针状结晶体。
上述步骤(4)中发酵液发酵48h后，经高效液相色谱(HPLC)分析，发酵液中16α，17 α-环氧黄体酮转化率为85.1％。