技术领域
本发明属于基因诊断领域，涉及一种用于检测肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒。
背景技术
在临床中，肾细胞癌(remahcellcarcinoma，RCC)的发病率逐年升高，已成为一种高发、常见的肾实质恶性肿瘤。既往研究显示，该病多发于50～70岁年龄段人群，仅有约5％患者年龄为40岁以下，但近几年，青年RCC患者的人数逐年增多。RCC肿瘤包含多个亚型，且各亚型间在病理表征及预后均存在不同差异性，早期对它们进行准确的病理学分型，能够有效改善患者预后，提高抗癌治疗效果及患者存活率(参考文献：对比分析不同肾细胞癌亚型的临床病理学特征，热带医学杂志2016年11月第16卷第11期)。
但是，目前基本都是通过病理分析确定肾细胞癌的亚型，结果受临床医生的经验影响较大，往往需要2～3名经验丰富的临床医生才可确诊。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNAs)曾经被认为不具有任何生物学功能，被称为是基因组转录的“噪音”。然而，近年来研究发现这些“噪音”基因组可能发挥重要的生物学作用，并有研究证明，lncRNAs在各种疾病中都有异常表达，其中包括癌症。研究认为lncRNAs的表达能够通过DNA甲基化来调控，其启动子区CpG岛发生甲基化后，会抑制该基因的转录，如果抑癌基因启动子区CpG岛发生甲基化就很可能导致肿瘤的发生，并且不同位点的甲基化率不同，会对基因的沉默有一定的影响。
若能通过检测不同肾细胞癌亚型之间及与正常肾组织之间的lncRNA是否甲基化以及甲基化位置的差异就可以对肾细胞癌进行诊断并分型，必然有助于肾细胞癌的确诊。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基因检测试剂盒确定不同肾细胞癌亚型的方法，这种方法不依赖于临床医生的经验，不受主观因素影响。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含用于检测基因ENST00000567236在10bp～175bp位点完全甲基化的引物。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.1所示，下游序列如Sequence NO.2所示。
优选地，还含有PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000567236在10bp～175bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为透明细胞癌亚型。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.1所示，下游序列如Sequence NO.2所示。
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含用于检测基因ENST00000567236在254bp～392bp位点完全甲基化的引物。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.3所示，下游序列如Sequence NO.4所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000567236在254bp～392bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为透明细胞癌亚型。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.3所示，下游序列如Sequence NO.4所示。
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含用于检测基因ENST00000567236在513bp～685bp位点完全甲基化的引物。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.5所示，下游序列如Sequence NO.6所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000567236在513bp～685bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为透明细胞癌亚型。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.5所示，下游序列如Sequence NO.6所示。
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测基因ENST00000558905在125bp～263bp位点完全甲基化的引物。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.7所示，下游序列如Sequence NO.8所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000558905在125bp～263bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为乳头状癌亚型。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.7所示，下游序列如Sequence NO.8所示。
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测基因ENST00000558905在338bp～495bp位点完全甲基化的引物。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.9所示，下游序列如Sequence NO.10所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000558905在338bp～495bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为乳头状癌亚型。
优选地，所述引物的上游序列如Sequence NO.9所示，下游序列如Sequence NO.10所示。
一种诊断肾癌中嫌色细胞癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中嫌色细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含用于检测基因ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化的引物。
优选地，引物的上游序列如Sequence NO.11所示，下游序列如Sequence NO.12所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中嫌色细胞癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为嫌色细胞癌亚型。
优选地，引物的上游序列如Sequence NO.11所示，下游序列如Sequence NO.12所示。
一种诊断肾癌中囊性肾细胞癌亚型的基因检测试剂盒
一种诊断肾癌中囊性肾细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测基因ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化的引物。
优选地，引物的上游序列如Sequence NO.13所示，下游序列如Sequence NO.14所示。
优选地，还含PCR反应所需酶和试剂。
一种诊断肾癌中囊性肾细胞癌亚型的方法，包括如下步骤：
步骤S1，取肾癌患者原发灶组织于液氮保存备检；
步骤S2，检测前取出原发灶组织，采用酚/氯仿抽提法提取组织中总DNA；
步骤S3，取2μg总DNA用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用WizardDNA纯化试剂进行纯化；
步骤S4，使用用于检测基因ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析，若扩增出目的条带则判定为囊性肾细胞癌亚型。
优选地，引物的上游序列如Sequence NO.13所示，下游序列如Sequence NO.14所示。
本发明的有益效果：
1、透明细胞癌原发灶中ENST00000567236在10bp～175bp、254bp～392bp、513bp～685bp位点完全甲基化，而透明细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可以通过检测ENST00000567236在10bp～175bp、254bp～392bp、513bp～685bp位点是否完全甲基化诊断透明细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
2、乳头状癌原发灶中ENST00000558905在125bp～263bp、338bp～495bp位点完全甲基化，而乳头状癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000558905在125bp～263bp、338bp～495bp位点是否完全甲基化诊断乳头状癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
3、嫌色细胞癌原发灶中ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化，而嫌色细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000571911在74bp～165bp位点是否完全甲基化诊断嫌色细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
4、囊性肾细胞癌原发灶中ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化，而囊性肾细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000547387在92bp～205bp位点是否完全甲基化诊断囊性肾细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％。
附图说明
图1为不同亚型肾癌原发灶组织和癌旁正常组织中目标lncRNA的目标位点PCR扩增电泳图(T代表原发灶组织，N代表癌旁正常组织)；从电泳图可见，使用用于检测基因ENST00000567236在10bp～175bp、254bp～392bp或513bp～685bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增时，仅有透明细胞癌亚型的原发灶扩增出目的条带，特异性强；使用用于检测基因ENST00000558905在125bp～263bp或338bp～495bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增时，仅有乳头状癌亚型的原发灶扩增出目的条带，特异性强；使用用于检测基因ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增时，仅有嫌色细胞癌亚型的原发灶扩增出目的条带，特异性强；使用用于检测基因ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化的引物对纯化后的DNA进行PCR扩增，仅有囊性肾细胞癌亚型的原发灶扩增出目的条带，特异性强。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：长链非编码RNA甲基化位点与不同亚型肾癌的关系
一、实验材料
1、主要试剂
亚硫酸氢钠和氢醌购自Sigma公司，Trizol购自Invitrogen公司。Wizard DNA纯化试剂盒购自Promega公司。PCR扩增试剂盒购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、组织标本
标本均来自无锡市人民医院生物标本库2015年5月至2017年5月间的肾癌手术患者，共45例，年龄52～70岁，中位年龄63岁。全部患者术前均未经化疗和放疗，该研究中所有研究对象均签署知情同意书，并经医院伦理委员会批准同意。每例患者均取原发灶组织和距癌组织边缘大于5cm处的癌旁正常组织，每例采集的标本一部分于液氮保存，另一部分标本用10％中性甲醛溶液固定，常规制作蜡块切片行HE染色进行组织形态学鉴定。根据2004年世界卫生组织(WHO)泌尿系统和男性生殖器官肿瘤病理学与遗传学标准，本次研究的组织标本中，透明细胞癌15例，乳头状癌13例，嫌色细胞癌9例，囊性肾细胞癌8例。
二、实验方法
1、甲基化特异性PCR(MSP)方法检测目标lncRNA在不同亚型肾癌中的甲基化状态
采用常规酚/氯仿抽提法，提取45例肾癌患者原发灶组织和癌旁正常组织中DNA后，用紫外分光光度法进行定量，每个样本中取2μg DNA，用2mol/LNaOH变性处理，于10mmol/L氢醌和3mol/L亚硫酸氢钠中50℃反应12～16h，处理后的DNA用Wizard DNA纯化试剂进行纯化。经亚硫酸氢盐处理后，DNA中的C转变为U，而甲基化的C则不能发生这种改变，根据此原理设计相应的引物，检测该基因在目标检测位点是否发生甲基化。
各目标lncRNA、目标检测位点及用于检测该位点甲基化的甲基化引物、非甲基化引物如下表1所示。PCR反应条件为：95℃预变性10min后，95℃变性45s，退火45s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸7min。MSP扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用UV凝胶电泳成像及图像分析系统进行图像分析。
表1目标lncRNA、目标检测位点及检测该位点甲基化的甲基化引物、非甲基化引物
2、统计学处理
采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
MSP结果会出现3种情况：①完全甲基化：甲基化引物扩增出目的条带，而非甲基化引物没有扩增出目的条带；②不完全甲基化：甲基化引物和非甲基化引物均扩增出目的条带；③非甲基化：甲基化引物未扩增出目的条带，非甲基化引物扩增出目的条带。
MSP结果如图1和表2所示。
表2不同亚型肾癌原发灶组织和癌旁正常组织中目标lncRNA的目标位点MSP结果
结论：
1、透明细胞癌原发灶中ENST00000567236在10bp～175bp、254bp～392bp、513bp～685bp位点完全甲基化，而透明细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可以通过检测ENST00000567236在10bp～175bp、254bp～392bp、513bp～685bp位点是否完全甲基化诊断透明细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
2、乳头状癌原发灶中ENST00000558905在125bp～263bp、338bp～495bp位点完全甲基化，而乳头状癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000558905在125bp～263bp、338bp～495bp位点是否完全甲基化诊断乳头状癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
3、嫌色细胞癌原发灶中ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化，而嫌色细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000571911在74bp～165bp位点是否完全甲基化诊断嫌色细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％；
4、囊性肾细胞癌原发灶中ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化，而囊性肾细胞癌癌旁正常组织和其他三种亚型的原发灶及癌旁正常组织均为非甲基化，因此可通过检测ENST00000547387在92bp～205bp位点是否完全甲基化诊断囊性肾细胞癌亚型，本实验45例样本的诊断准确率为100％。
实施例2：不同亚型肾癌的基因检测试剂盒
1、一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000567236在10bp～175bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.1所示，引物下游序列如Sequence NO.2所示。
上游：5′-GTACGTTACTGCTATGACTCGTGCG-3′(Sequence NO.1)
下游：5′-ACGACGATTCCGAACTGTACACG-3′(Sequence NO.2)
2、一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000567236在254bp～392bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.3所示，引物下游序列如Sequence NO.4所示。
上游：5′-TAGCGTGGATTCGATATTCATGCT-3′(Sequence NO.3)
下游：5′-CCGATCAGCATCGACGCTGTACTCG-3′(Sequence NO.4)
3、一种诊断肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000567236在513bp～685bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.5所示，引物下游序列如Sequence NO.6所示。
上游：5′-TGGATCGATCGAGTCGTTAGTCTCA-3′(Sequence NO.5)
下游：5′-CCGATGTATGACAACGCTACATGCG-3′(Sequence NO.6)
4、一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000558905在125bp～263bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.7所示，引物下游序列如Sequence NO.8所示。
上游：5′-GTCGTAGTATCGGTCGTAGTATGAG-3′(Sequence NO.7)
下游：5′-AACTAGATATTCGAATCCTACTGCG-3′(Sequence NO.8)
5、一种诊断肾癌中乳头状癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000558905在338bp～495bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.9所示，引物下游序列如Sequence NO.10所示。
上游：5′-CTCGTACGTAAGTATTCAAGTGTCG-3′(Sequence NO.9)
下游：5′-ATACACCTCCTCTACGACGAGCGTC-3′(Sequence NO.10)
6、一种诊断肾癌中嫌色细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000571911在74bp～165bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.11所示，引物下游序列如Sequence NO.12所示。
上游：5′-TCGTGTCGATATTTGATGCATACTCGA-3′(Sequence NO.11)
下游：5′-ACACTCGACAGATCATCTAGACGAGA-3′(Sequence NO.12)
7、一种诊断肾癌中囊性肾细胞癌亚型的基因检测试剂盒，含有用于检测ENST00000547387在92bp～205bp位点完全甲基化的引物，引物上游序列如Sequence NO.13所示，引物下游序列如Sequence NO.14所示。
上游：5′-AGTAGTTCGGTCGTATTTCGTATTGTC-3′(Sequence NO.13)
下游：5′-CTACGACGAACGCTAACCGTACCCCGGA-3′(Sequence NO.14)
当然，上述试剂盒中还含有PCR反应所需的酶和试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
序列表
<110> 蒋灵锋
<120> 一种用于检测肾癌中透明细胞癌亚型的基因检测试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtacgttact gctatgactc gtgcg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgacgattc cgaactgtac acg 23
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tagcgtggat tcgatattca tgct 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgatcagca tcgacgctgt actcg 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggatcgatc gagtcgttag tctca 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgatgtatg acaacgctac atgcg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgtagtat cggtcgtagt atgag 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactagatat tcgaatccta ctgcg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcgtacgta agtattcaag tgtcg 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atacacctcc tctacgacga gcgtc 25
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcgtgtcgat atttgatgca tactcga 27
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
acactcgaca gatcatctag acgaga 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtagttcgg tcgtatttcg tattgtc 27
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctacgacgaa cgctaaccgt accccgga 28