一种L-ATC水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102433313 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102433313 A *CN102433313A* (21)申请号 201110365111.9 (22)申请日 2011.11.17 CGMCC No.5315 2011.10.10 C12N 9/14(2006.01) C12N 15/55(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12P 13/12(2006.01) (71)申请人 天津启仁医药科技有限公司 。

2、地址 300457 天津市滨海新区海通街与洞 庭路交口国际生物医药联合研究院 S1006 室 (72)发明人 高智慧 刘磊 姚瑞娟 王文芳 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 (54) 发明名称 一种 L-ATC 水解酶和编码基因及其重组表达 蛋白质的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种 L-ATC 水解酶和编码 基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应 用。本发明所提供的来源于假单胞菌 （保藏 号 CGMCCNo.5315）的 L-ATC 水解酶是序列表中 SEQIDNo.1 的氨基酸残基序列或将 SEQIDNo.1 的 氨基酸残基序列经过一个或几个。

3、氨基酸残基的 替代、 缺失或添加具有与 SEQIDNo.1 相同活性的 由 SEQIDNo.1 衍生的蛋白质。编码基因序列是序 列表中 SEQIDNo.2 的核苷酸序列。本发明将来源 于假单胞菌的 L-ATC 水解酶基因克隆并表达制备 重组酶， 可用于生物法水解 L-ATC 生产 N- 氨甲 酰 -L- 半胱氨酸 (L-NCC)， 进一步用于酶法生产 L- 半胱氨酸。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 3 页 附图 3 页 CN 102433317 A1/1 页 2 1. 一种 。

4、L-ATC 水解酶， 其特征在于， 它具有序列表中 SEQ ID No.1 氨基酸残基序列或 将SEQID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、 替代或添加且具有与 SEQNo.1 相同活性的由 SEQ ID No.1 衍生的蛋白质。 2. 一种权利要求 1 所述的 L-ATC 水解酶的编码基因， 它是下列核苷酸序列之一 ： 1) 是序列表 SEQ ID No.2 的核苷酸序列 ； 2) 编码序列表中的 SEQ ID No.1 蛋白质序列的多核苷酸序列。 3. 一种含有权利要求 2 所述基因的表达载体。 4. 一种含有权利要求 2 所述基因的细胞体系。 5. 根据权利要求 。

5、4 所述的基因的细胞体系， 其特征在于， 所述的细胞体系为原核细胞 系统。 6. 权利要求 1 所述的 L-ATC 水解酶在微生物酶法生产 L- 半胱氨酸中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102433313 A CN 102433317 A1/5 页 3 一种 L-ATC 水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及来源于假单胞菌的一种 L-ATC 水解酶的编码基 因， 以及重组蛋白质的表达与应用。 背景技术 0002 L-ATC水解酶(L-ATC hydrolyse)是一种催化L-ATC(L-2-氨基2-噻唑啉-4-羧 酸， L-2-ami。

6、no-2-thiazoline-4-carboxylic acid) 水解产生 N- 氨甲酰 -L- 半胱氨酸 (N-carbamyl-L-cysteine， L-NCC) 的酶。因为 L-NCC 可作为中间产物， 经 N- 氨甲酰 -L- 半 胱氨酸酰胺水解酶 (L-NCC 酰胺水解酶 ) 催化生成终产物 L- 半胱氨酸， 所以 L-ATC 水解酶 是参与酶法转化生产 L- 半胱氨酸的重要成员之一。具体过程参见附图 1。 0003 L- 半胱氨酸 (L-cysteine) 是组成蛋白质的 20 种氨基酸之一， 是一种 氨基酸， 它的存在可以保持蛋白质的稳定性， 同一条或不同多肽链两个 L- 。

7、半胱氨酸残基间以二硫 键 (-S-S-) 连接， 使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L- 半胱氨酸在医药、 食品、 饲料、 化 妆品等行业具有广泛的用途， 日益受到重视。目前 L- 半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解 后还原法、 化学合成法、 发酵法和酶法合成法等。 近年来， 以微生物为酶源， 采用酶法制备氨 基酸的技术有了快速的发展。 微生物酶法具有特异性强、 生产工艺简单、 副反应和副产物少 等优点。特别是近年来， 以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸， 有了显著的进步。目 前， 有 3 种微生物酶法转化合成 L- 半胱氨酸的工艺路线 ： (1) 以 3- 氯 L- 丙氨酸为前体物 的 L-。

8、 半胱氨酸酶法合成 ； (2) 以 O- 乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成 L- 半胱氨酸 ； (3) 以 DL-ATC 为前体物的酶法生产 L- 半胱氨酸。 0004 DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。 日本学者Sano等于1977年以 添加甘油和DL-ATC的极限培养基进行筛选， 从388个土样中筛选到一株嗜硫氮杂环戊烯假 单胞菌 AJ3854， 该菌株可以以 DL-ATC 为底物合成 L- 半胱氨酸。以培养 18h 的 AJ3854 细胞 为酶源， 添加 1 DL-ATC 3H2O、 1 KH2PO4和 0.14盐酸羟胺的缓冲液为底物溶液， 二者按 一定比例混合后在 30反应。

9、 24h 后， 在反应液中可产生 6.1g/L 的 L- 半胱氨酸 ( 反应过程 中有部分 L- 半胱氨酸氧化为 L- 胱氨酸， 均以 L- 半胱氨酸计 )。Sano 又以其实验室中 37 个属的 463 株菌株为实验对象， 研究了这些菌株以 DL-ATC 为底物的 L- 半胱氨酸合成能力， 研究发现， 除了假单胞菌之外， 其余 22 株菌 ( 分属 13 个属 ) 也可以以 DL-ATC 为底物合成 L- 半胱氨酸， 这些属的代表菌株及其转化能力如表 1 所列。 0005 表 1 不同细菌转化 DL-ATC 合成 L- 半胱氨酸的产量 0006 说 明 书 CN 102433313 A CN。

10、 102433317 A2/5 页 4 0007 对 DL-ATC 酶法合成 L- 半胱氨酸转化途径的研究最早开始于 1979 年， 日 本学者 Sano 提出了完成该转化过程的两种假设 ： 一种是以 S- 氨甲酰 -L- 半胱氨酸 (S-carbamyl-L-cysteine， L-SCC) 为中间产物的 S- 代途径 ； 另一种是以 L-NCC 为中间产物 的 N- 代途径， 反应过程和酶系如附图 1 所示。其中以 N- 氨甲酰 -L- 半胱氨酸为中间产物 的转化途径最初于 1998 年由 Tamura 报道。该学者对 L- 半胱氨酸合成菌株假单胞菌 ON-4a 和 AJ3865 进行研究。

11、， 诱导实验发现， 如果分别以 DL-ATC、 L-NCC 和 L-SCC 为诱导物进行细胞 培养， 诱导后的细胞加入不同的底物进行酶活测定， 仅 DL-ATC 诱导后的细胞具有 L-ATC 水 解酶活性 ； 而且各种细胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而无L-SCC酰胺水解酶活性， 而且各种 细胞均不能够利用 N- 氨甲酰 -D- 半胱氨酸、 S- 氨甲酰 -L- 半胱氨酸和 S- 氨甲酰 -D- 半胱 氨酸为底物进行酶促反应生成L-半胱氨酸。 Tamura还对中间产物进行了纯化， 纯化后的产 物经过红外光谱扫描、 质谱分析、 核磁共振分析和元素分析， 结果与标准的N-氨甲酰-L-半 胱氨酸完全。

12、相同， 因此证明了这两株菌进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途 径。 0008 目前， 有关酶法合成 L- 半胱氨酸相关酶系的报道不多。 发明内容 0009 本发明的目的是提供一种新的 L-ATC 水解酶及其编码基因， 获得活力较高的重组 酶， 并且这种 L-ATC 水解酶可在制备 L-NCC 及进一步酶法生产 L- 半胱氨酸中应用。 0010 本发明申请人从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌 Pseudomonas sp.QR-101， 于 2011 年 10 月 10 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏号CG。

13、MCC No.5315， 它进行以L-NCC为中间产物的 L-半 胱氨酸合成代谢途径， 涉及 ATC 消旋酶、 L-ATC 水解酶和 L-NCC 酰胺水解酶等 3 个酶的协同 催化作用。 说 明 书 CN 102433313 A CN 102433317 A3/5 页 5 0011 本发明提供的 L-ATC 水解酶， 来源于假单胞菌 Pseudomonas sp.QR-101， 是序列表 中 SEQ IDNo.1 的氨基酸残基序列或将 SEQ ID No.1 的氨基酸残基序列经过一个或几个氨 基酸残基的缺失、 替代或添加且具有与 SEQ ID No.1 相同活性的由 SEQ ID No.1 衍。

14、生的蛋 白质。 0012 序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列是由173个氨基酸残基组成的蛋白质。 0013 本发明所提供的 L-ATC 水解酶的编码基因， 是下列核苷酸序列之一 ： 0014 (1) 序列表中 SEQ ID No.2 的 DNA 序列， 由 519 个碱基组成 ； 0015 (2) 编码序列表中 SEQ ID No.1 蛋白质序列的多核苷酸序列。 0016 含本发明基因的表达载体及细胞体系均属于本发明的保护范围。 所述的细胞体系 为原核细胞体系。 0017 本发明重组 L-ATC 水解酶蛋白可以通过以下方法获得 ： 培养含有 L-ATC 水解酶表 达载体的宿主菌 E。

15、.coli BL21/pET-21a(+)-atcB， 该细胞体系为原核细胞体系， 在所规定的 蛋白质表达条件下， 获得表达产物 L-ATC 水解酶。 0018 本发明的 L-ATC 水解酶及其变法基因可在制备 L-NCC 及进一步微生物酶法生产 L- 半胱氨酸中应用。 0019 本发明的有益效果 ： 0020 本发明从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的 L-ATC 水解酶基因并进行了表 达 / 重组酶的制备和转化等研究， 本发明涉及的 L-ATC 水解酶的氨基酸序列通过 GenBank Blast 发现， 与来自 Pseudomonas sp.StrainBS 的 atcB(GenBank 。

16、： BAD15359.1) 的同源性为 90， 它们的核苷酸序列同源性为 88。利用高效表达 L-ATC 水解酶的大肠杆菌 E.coli BL21/pET-21a(+)-atcB， 水解 L-ATC 生产 L-NCC， 催化效率高， 发酵成本低， 且反应液中成分 单一， 后续分离纯化方便， 生成的 L-NCC 可作为 L- 半胱氨酸的中间体， 因此本发明在 L- 半 胱氨酸和 L- 胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。 附图说明 0021 图 1 ： 是酶法转化 DL-ATC 合成 L- 半胱氨酸的 S- 代和 N- 代途径示意图 ； 0022 图 2 ： 是 Pseudomonas 。

17、sp.QR-101 的 L-ATC 水解酶与数据库中已知序列 L-ATC 水 解酶 (GenBank ： BAD15359.1) 的核苷酸序列比对。 0023 图 3 ： 是重组质粒 pET-21a(+)/atcB 的图谱。 0024 图 4 ： 是基因工程菌 E.coliBL21/pET-21a(+)-atcB 的酶切鉴定图。其中 ： 泳道 M ： DNAMarker15000 ； 泳道 1 ： Bam HI 单酶切质粒 ； 泳道 2 ： Bam HI 和 Hind III 双酶切质 粒 pET-21a(+)-atcB(+) ； 泳道 3 ： Bam HI 和 Hind III 双酶切质粒 。

18、pET-21a(+) ； 泳道 4 ： 以 Pseudomonas sp.QR-101 的基因组 DNA 为模板的 PCR 产物 ； 以质粒 pET-21a(+)-atcB 为模 板的 PCR 产物。 0025 图 5 ： 是基因工程菌 E.coliBL21/pET-21a(+)-atcB 表达蛋白的 SDS-PAGE 电泳图。 其中， 泳道1 ： Pseudomonas sp.QR-101 ； 泳道2 ： 基因工程菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcB ； 泳道 3 ： E.coli BL21/pET-21a(+)。 0026 图 6 ： 是酶催化 L-ATC 生成 L-NC。

19、C 的薄层层析图谱。其中， 第 1 道 ： L-ATC 标准品 ； 第 2 道 ： L-NCC 标准品 ； 第 3 道 ： 酶催化反应液。 说 明 书 CN 102433313 A CN 102433317 A4/5 页 6 具体实施方式 0027 实施例 1 0028 L-ATC 水解酶的克隆及一级结构特征 0029 本发明人从假单胞菌 Pseudomonas sp.QR-101 中提取基因组 DNA， 然后用 Hind III 酶切基因组 DNA， 用胶回收试剂盒从 1.2的琼脂糖凝胶上分别回收 2-9kb 的 HindIII 酶切片段， 将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的 pUC18。

20、 载体上， 转入 E.coli JM109 中， 在涂有 X-gal 和 IPTG 的平板上进行蓝白初筛。 0030 将含有插入片段的重组白色单菌落， 分别挑入每孔含50uL LB培养基， 37过夜培 养后， 加入100L 0.6L-ATC作为底物， 同时加入L-NCC酰胺水解酶(其基因序列见序列 表SEQ IDNo.3)0.5U， 于35振荡30min， 分别加入150uL酸性茚三酮进行显色反应， 以不加 培养液的空白作为对照。 0031 通过微孔板复筛较高活性的重组子， 并抽提质粒， 然后进行 DNA 序列测定， 结果 显示阳性重组子 PU113 中含有插入片段为 2630bp， 在其中位。

21、于 230-748bp 间有一个完 整的读码框， 为 519bp(SEQ ID No.2)， G+C 含量为 61.46， 编码 173aa， 其计算分子量为 19.25kD。将该 DNA 序列通过 GenBankBlast 发现， 与来自 Pseudomonas sp.StrainBS 的 atcB(GenBank ： BAD15359.1) 的同源性为 92， 它们的核苷酸序列同源性为 88。因此， 本 发明的 L-ATC 水解酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列， 它是一个新基因。 0032 实施例 2 0033 大肠杆菌基因工程菌的构建及重组 L-ATC 水解酶的表达 0034 。

22、根据测序结果， 按照该蛋白质编码基因的两末端序列设计引物 P1 和 P2， 其中上游 P1 ： 5 -CCCGGA TCC ATG AGT GAT AAG CCA GTC CAC AG-3 含有 Bam HI 酶切位点 ； 下游引 物 P2 ： 5 -CCC AAGCTT TCATTT CTGGCC ACC CTGTTGTT-3 含有 HindIII 酶切位点。 0035 以假单胞菌 Pseudomonas sp.QR-101 的基因组为模板， 按如下 PCR 程序进行 DNA 扩增 ： 0036 94变性 1min， 66复性 1min， 72延伸 1min， 扩增反应进行 30 个循环。 。

23、0037 PCR 扩增产物经 Bom HI 和 HindIH 双酶切后， 连接到经相同酶切后的载体 pET-21a(+)， 构建重组子 pET-21a(+)/atcB。 0038 获得的重组子pET-21a(+)/atcB采用CaCl2法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)， 经 鉴定后获得 BL21(pET-21a(+)/atcB) 工程菌。 0039 将 BL21(pET-21a(+)/atcB) 工程菌于 37活化过夜， 按 1 100 转接到 100mL 含 100g/mL氨苄青霉素的LB培养基中， 37培养至对数生长期 ； 加入终浓度为1mM的IPTG， 37继续培养3h ； 4， 。

24、6,000r/min离心10min， 收集菌体， 加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0) 悬浮洗涤后， 6,000r/min 离心 10min， 收集菌体， 重复洗涤一次， 加入磷酸钾缓冲液制 成酶源细胞悬液。 0040 实施例 3 0041 L-ATC 水解酶活力的测定方法 0042 (1) 原理 ： 采用酸性茚三酮法。L-ATC 水解酶水解 L-ATC 生成 L-NCC， L-NCC 能被 L-NCC酰胺水解酶分解生成L-半胱氨酸， L-半胱氨酸在煮沸的条件下与酸性茚三酮试剂生 说 明 书 CN 102433313 A CN 102433317 A5/5 页 7 成红色物质， 在。

25、 560nm 下有最大吸收， 其颜色深浅与 L- 半胱氨酸的量成正比。 0043 (2) 方法 ： 在 1的 L-ATC 的溶液中加入 6的 K2HPO4至 pH 值 7.5 配成底物终浓 度为 0.75的溶液， 然后取 1mL 的底物溶液， 加入 0.5mL 实施例 2 制备的酶源细胞悬液， 同 时加入 50UL-NCC 酰胺水解酶， 于 37水浴中反应 10min。 0044 反应液中L-半胱氨酸含量测定采用酸性茚三酮法， 取反应液0.2mL， 加入0.2mL冰 醋酸， 再加入 0.2mL 酸性茚三酮试剂 ( 称取 250mg 茚三酮， 溶于 6mL 乙酸和 4mL 浓盐酸的混 合液中 )。

26、， 于沸水浴中反应 10min， 然后立即在冷水中冷却， 最后加入 2.4mL 工业酒精， 总体 积 3mL， 放置 10min 后于 560nm 下比色， 以不加酶源细胞悬液的反应液作空白对照。 0045 L- 半胱氨酸测定标准曲线的建立 ： 精确配制 1mmol/L L- 半胱氨酸标准溶液， 分别 用蒸馏水稀释至以下浓度 ： 0， 0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8， 0.9， 1mmol/L。分别取 0.2mL 不同稀释度的溶液加入 0.2mL 冰醋酸， 再加入 0.2mL 酸性茚三酮试剂， 于沸水浴中反 应 10min， 然后立即在冷水中冷却，。

27、 最后加入 2.4mL 工业酒精， 总体积 3mL， 放置 10min 后于 560nm 下比色， 以 L- 半胱氨酸的浓度为横坐标、 以 A560nm为纵坐标绘制标准曲线。 0046 酶活力定义 ： 在上述反应条件下， 每分钟生成 1 微摩尔 L- 半胱氨酸产物所需的酶 量定为一个酶活力单位。 0047 测定相应的 L-ATC 水解酶活力， 大肠杆菌基因工程菌酶源细胞的酶活可达 1045U/ g。 0048 取 150g/L 的酶源细胞悬液 20mL， 加入 6.25g/L 的 L-ATC 底物溶液 80mL 混合， 在 35下进行催化反应 2h， 反应完毕后的反应液经三氯乙酸去除蛋白后进行。

28、薄层层析 ( 展层 液配比为 ： 异丙醇浓氨水 1 1)， 与标准品进行对照， 结果见图 6。从图中可以看出， 在 第 3 展层道， 酶催化 L-ATC 后的产物为 L-NCC( 图中所示还有少部分底物 L-ATC 未转化成产 物 L-NCC)。 0049 实施例 4 0050 以重组大肠杆菌的发酵菌体为酶源细胞， 转化 L-ATC 生产 L- 半胱氨酸 0051 L-NCC是酶法转化DL-ATC(或L-ATC)合成L-半胱氨酸过程的中间产物。 L-ATC水 解酶能够催化水解 L-ATC 生成 L-NCC， L-NCC 再经 L-NCC 酰胺水解酶催化生成终产物 L- 半 胱氨酸， L- 半胱。

29、氨酸是一种重要的含硫氨基酸， 广泛应用于医药、 食品、 化妆品以及饲料工 业。 0052 反应体系组成 ： 0053 底物 ： 5g/L 的 L-ATC 0054 反应温度 ： 35 0055 PH ： 8.0 0056 酶源细胞悬液 ： 8g/L 0057 L-NCC 酰胺水解酶 ： 500U/L 0058 转化率 ： 0059 酶源细胞悬液为8g/L， 底物L-ATC的浓度为5g/L， 反应体系为3L， 35反应2h后， 在上述条件下， 底物转化率约为 85。 说 明 书 CN 102433313 A CN 102433317 A1/3 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102433313 A CN 102433317 A2/3 页 9 0003 序 列 表 CN 102433313 A CN 102433317 A3/3 页 10 序 列 表 CN 102433313 A CN 102433317 A1/3 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102433313 A CN 102433317 A2/3 页 12 图 2 说 明 书 附 图 CN 102433313 A CN 102433317 A3/3 页 13 图 3 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102433313 A 。