技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒。
背景技术
CRISPR(clustered regularly interspaced short palin-dromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是一些细菌及古细菌中特有的获得性免疫系统，这个系统通过特定序列的RNA引导，特异性切割降解外源性DNA。CRISPR/Cas系统可分为三种类型,其中II型CRISPR/Cas系统由于其组成简单，被改造成为基因组靶向编辑的工具。而通过人工设计并在体外转录RNA，可以合成具有引导作用的sgRNA(single guide RNA)，sgRNA引导Cas蛋白特异性切割目的DNA序列。通过对Cas蛋白的改造，在sgRNA的引导下，CRISPR/Cas系统在研究中可以达成多种目的，比如对基因进行切割、修饰、沉默、敲除、调整表达等操作。CRISPR/Cas已经成为基因编辑和研究的有力工具，具有十分光明而广泛的应用前景。
作为CRISPR/Cas系统中不可或缺的sgRNA，其合成方法非常重要，如何以较低的成本获得可用的sgRNA成为科研工作者的关注目标。化学合成RNA法时间周期为7～14天，而且费用很高，不适合sgRNA合成。构建质粒载体在体内转录RNA的方法需要繁琐费时的载体构建工作，而且不够灵活，每个载体只能对应少量特定的RNA。
而目前传统的sgRNA体外转录法有很多繁琐的步骤，通常是1、PCR扩增模板DNA，2、胶回收PCR产物，3、将PCR产物作为模板转录sgRNA。其操作费时费力，整个流程需要5～6小时。其间需要使用PCR仪、电泳槽、离心机等多种仪器，涉及的试剂有PCR 扩增酶、胶回收试剂盒、T7RNA酶等，因此平均费用不低。
因此本领域迫切地需要开放一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。
发明内容
本发明提供了一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。
本发明第一方面提供了一种sgRNA合成体系，包括：
(a)核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：
Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)
其中，
Y1为RNA聚合酶启动区；
L1为无或连接序列；
Y2为靶DNA序列；
L2为无或连接序列；
Y3为下游引物结合区；
Y4为无或核苷酸序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
(b) 下游引物；
(c) DNA聚合酶；和
(d) RNA聚合酶。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶选自下组：T7 RNA聚合酶、Sp6 RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、或其组合。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶启动区为T7RNA聚合酶启动区。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列结构为：NX-TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO.:1的第2-18位)-GY，其中N为A、T、C或G，X为1-6的整数，Y为0-2的整数。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的长度为17-40bp，较佳地，18-25bp。
在另一优选例中，所述元件Y2的长度为0-100bp，较佳地，0-90bp。
在另一优选例中，所述元件Y3的长度为5-30bp，较佳地，10-20bp。
在另一优选例中，所述元件Y4的长度为5-30bp，较佳地8-20bp。
在另一优选例中，所述连接序列的长度为1-30nt。
在另一优选例中，所述L2和/或Y3中的一部分或全部可作为barcode序列使用。
在另一优选例中，所述L2和/或Y3含有barcode序列。
在另一优选例中，所述L2为barcode序列。
在另一优选例中，所述Y3为通用引物结合区。
在另一优选例中，所述下游引物包括特异性引物、通用引物、barcode引物。
在另一优选例中，所述下游引物被用作通用引物或barcode引物。
在另一优选例中，所述组分(d)与组分(a)中的RNA聚合酶启动区相对应。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系还包括选自下组的一种或多种组分：
(e) DTT；
(f) 亚精胺；
(g) 甘油；
(h)无RNA酶的水（RNase Free water）；
(i) Triton-X100；
(j) RNA酶抑制剂；
(k) 硫酸铵；
(l) 吐温20
(m) 用于合成RNA的底物；
(n) 用于合成DNA的底物；
(o) 镁离子；
(p) 缓冲剂。
在另一优选例中，所述的合成RNA的底物包括：核苷单磷酸、核苷三磷酸、或其组合。
在另一优选例中，所述合成DNA的底物包括：脱氧核苷单磷酸、脱氧核苷三磷酸、或其组合。
在另一优选例中，所述DNA聚合酶选自下组：Klenow聚合酶、Taq酶、Pfu酶、KOF酶、Bst酶、Phi29酶、或其组合。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶选自下组：T7 RNA聚合酶、Sp6 RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、或其组合。
在另一优选例中，所述镁离子来源于镁离子源，所述镁离子源选自下组：氯化镁、醋酸镁、谷氨酸镁、磷酸镁、或其组合。
在另一优选例中，所述缓冲剂选自下组：Tris-HCl、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、三羟甲基氨基甲烷、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、或其组合。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(a)的质量浓度(wt%)为0.0008%-0.006%，较佳地，0.001%-0.005%，更佳地，0.0013%-0.00438%，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(a)的摩尔浓度(mol/L)为0.3umol/L-2umol/L，较佳地，0.5umol/L-1.5umol/L，更佳地，0.8umol/L-1.2umol/L，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(b)的质量浓度(wt%)为0.00024%-0.0011%，较佳地，0.0003%-0.00093%，更佳地，0.00039%-0.00081%，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(c)的酶活 (U/uL)为0.05U/uL-0.4U/uL，较佳地，0.08U/uL-0.25U/uL，更佳地，0.1U/uL-0.2U/uL，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(d)的酶活(U/uL)为1U/uL-6U/uL，较佳地，2U/uL-5U/uL，更佳地，3U/uL-4U/uL，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(e)的摩尔浓度(mol/L)为0.1mmol/L-3mmol/L，较佳地，0.3mmol/L-2mmol/L，更佳地，0.5mmol/L-1.5mmol/L，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(f)的摩尔浓度(mol/L)为0.8mmol/L-4mmol/L，较佳地，1.2mmol/L-3mmol/L，更佳地，1.5mmol/L-2.5mmol/L，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(g)的体积浓度(v/v)为15%-35%，较佳地，18%-32%，更佳地，20%-30%，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(j)的体积浓度(v/v)为5%-15%，较佳地，6%-13%，更佳地，8%-11%，以所述sgRNA合成体系的总体积计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(l)的体积浓度(v/v)为0.2%-0.7%，较佳地，0.3%-0.6%，更佳地，0.4%-0.6%，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(m)的摩尔浓度(mol/L)为1mmol/L-1.5mmol/L，较佳地，1.1mmol/L-1.4mmol/L，更佳地，1.2mmol/L-1.3mmol/L，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(n)的摩尔浓度(mol/L)为0.3mmol/L-0.7mmol/L，较佳地，0.35mmol/L-0.6mmol/L，更佳地，0.4mmol/L-0.5mmol/L，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述组分(m)/组分(n)为10:1-4:1，较佳地，8:1-3:1，更佳地，5:1-2:1。
在另一优选例中，所述sgRNA合成体系中，组分(o)的摩尔浓度(mol/L)为3.5mmol/L-7mmol/L，较佳地，4mmol/L-6.5mmol/L，更佳地，5mmol/L-6mmol/L，以所述sgRNA合成体系的总重计。
在另一优选例中，所述的sgRNA合成体系具有以下性能：
在合成体系（5ul－200ul，较佳地，10-100ul）里，sgRNA合成总量≥1ug（1-10ug，较佳地，1-5ug）。
本发明第二方面提供了一种体外合成sgRNA的方法，包括步骤：
(i) 提供本发明第一方面所述的sgRNA合成体系；
(ii) 在适合的条件下，孵育步骤(i)的合成体系一段时间T1，从而合成所述的sgRNA。
另一优选例中，所述的方法还包括：(iii) 任选地从所述sgRNA合成体系中，分离或检测所述的sgRNA。
在另一优选例中，所述步骤(ii)中，反应温度为25℃-42℃，较佳地，35℃-40℃ 。
在另一优选例中，所述步骤(ii)中，反应时间T1为0.5h-8h，较佳地，0.5-3h，较佳地，0.8h-1h。
本发明第三方面提供了一种用于sgRNA合成的试剂盒，包括：
(k1) 第一容器，以及位于第一容器内的核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：
Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)
其中，
Y1为RNA聚合酶启动区；
L1为无或连接序列；
Y2为靶DNA序列；
L2为无或连接序列；
Y3为下游引物结合区；
Y4为无或核苷酸序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；
(k2) 第二容器，以及位于第二容器内的下游引物；和
(kt) 标签或说明书。
在另一优选例中，所述的第一容器、第二容器是同一容器或不同容器。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括任选的选自下组的一个或多个容器：
(k3) 第三容器，以及位于第三容器内的DNA聚合酶；
(k4) 第四容器，以及位于第四容器内的RNA聚合酶；
(k5) 第五容器，以及位于第五容器内的用于合成RNA的底物；
(k6) 第六容器，以及位于第六容器内的用于合成DNA的底物；
(k7) 第七容器，以及位于第七容器内的镁离子；
(k8) 第八容器，以及位于第八容器内的缓冲剂。
本发明第四方面提供了一种核酸构建物，所述核酸构建物具有5’-3’的式I所示的结构：
Y1-L1-Y2-L2-Y3-Y4 (I)
其中，
Y1为RNA聚合酶启动区；
L1为无或连接序列；
Y2为靶DNA序列；
L2为无或连接序列；
Y3为下游引物结合区；
Y4为无或核苷酸序列；
并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶选自下组：T7 RNA聚合酶、Sp6 RNA聚合酶、U6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、或其组合。
在另一优选例中，所述RNA聚合酶启动区为T7RNA聚合酶启动区。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列结构为：NX-TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO.:1的第2-18位)-GY，其中N为A、T、C或G，X为1-6的整数，Y为0-2的整数。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中，所述元件Y1的长度为17-40bp，较佳地，18-25bp。
在另一优选例中，所述元件Y2的长度为0-100bp，较佳地，0-90bp。
在另一优选例中，所述元件Y3的长度为5-30bp，较佳地，10-20bp。
在另一优选例中，所述元件Y4的长度为5-30bp，较佳地8-20bp。
在另一优选例中，所述连接序列的长度为1-30nt。
在另一优选例中，所述L2和/或Y3中的一部分或全部可作为barcode序列使用。
在另一优选例中，所述L2和/或Y3含有barcode序列。
在另一优选例中，所述L2为barcode序列。
在另一优选例中，所述Y3为通用引物结合区。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了A、B方案体外转录合成sgRNA电泳图。A、B分别代表方案A、B实验体系；泳道1为Marker；泳道2-5分别为0.5h、1h、1.5h、2h反应时长。
图2显示了C、D方案体外转录合成sgRNA电泳图。C、D分别代表方案C、D实验体系；泳道1为Marker；泳道2-5分别为0.5h、1h、1.5h、2h反应时长。
图3显示了：E方案体外转录合成sgRNA电泳图。泳道5为Marker；泳道1-4分别为0.5h、1h、1.5h、2h反应时长。
图4显示了F方案与C方案sgRNA体外转录对比电泳图。泳道2为DNA Marker 2000；泳道1为方案F；泳道3为方案C。
图5显示了阳性代表CRISPR/Cas切割体系中加入阳性对照sgRNA；MK为DNA Ladder 2000；A1、A2、A3、A4分别代表CRISPR/Cas切割体系中加入A方案中四个反应时长所得的sgRNA，即0.5h，1h，1.5h，2h；B1-4，C1-4，D1-4以此类推为加入B、C、D方案四个反应时长所得的sgRNA；F1、F2为F方案sgRNA扩增时长分别为3h、2h。
具体实施方式
经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次意外地发现了一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。具体地，本发明的sgRNA合成体系可显著提高sgRNA的合成产量，产量≥1ug（1-10ug，较佳地，1-5ug），并且可以将整个流程时间大幅缩短（如降低到1小时以内），步骤简便，平均费用也大大下降(下降约50%)。在此基础上，本发明人完成了本发明。
本发明的构建物
本发明提供了一种核酸构建物，其是通过将RNA聚合酶启动区(如T7RNA聚合酶启动区)、靶DNA序列、下游引物结合区(如特异性引物、通用引物、barcode引物或可被用作通用引物、barcode引物的下游引物)以及任选的额外的核苷酸序列通过连接序列连接起来，从而可简单、方便、省时、高效的体外合成sgRNA，并且成本很低。本发明的构建物如本发明第一方面所述。
本发明的构建物中所用的各种元件都是本领域中已知的，因此本领域技术人员可以用常规方法，如PCR方法、全人工化学合成法、酶切方法获得相应的元件，然后通过熟知的DNA连接技术连接在一起，就形成了本发明的构建物。
在本发明中，RNA聚合酶启动区的序列结构为：NX-TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO.:1的第2-18位)-GY，其中N为A、T、C或G，X为1-6的整数，Y为0-2的整数。
在一优选实施方式中，RNA聚合酶启动区为T7 聚合酶启动区，序列如SEQ ID NO.:1所示。
在一优选实施方式中，RNA聚合酶启动区为SP6 聚合酶启动区，序列如SEQ ID NO.:2所示。
在一优选实施方式中，RNA聚合酶启动区为T3 聚合酶启动区，序列如SEQ ID NO.:3所示。
sgRNA合成体系
本发明提供了一种体外的sgRNA合成体系，包括：
(a) 本发明第一方面所述的核酸构建物；
(b) 下游引物；
(c) DNA聚合酶；和
(d) RNA聚合酶。
在一优选实施方式中，所述体外的sgRNA合成体系还包括：
(e) DTT；
(f) 亚精胺；
(g) 甘油；
(h) 无RNA酶的水（RNase Free water）；
(i) Triton-X100；
(j) RNA酶抑制剂；
(k) 硫酸铵；
(l) 吐温20
(m) 用于合成RNA的底物；
(n) 用于合成DNA的底物；
(o) 镁离子；
(p) 缓冲剂。
在本发明中，所述下游引物没有特别限制，可以包括通用引物或barcode引物，或可被用作通用引物或barcode引物。通常，下游引物的浓度为1uM。
在本发明中，RNA聚合酶没有特别限制，可以选自一种或多种RNA聚合酶，典型的RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。通常，RNA聚合酶的浓度为3.5U/ul。
在本发明中，DNA聚合酶没有特别限制，可以选自一种或多种DNA聚合酶，包括(但并不限于)：Klenow聚合酶、Taq酶、Pfu酶、KOF酶、Bst酶、和/或Phi29酶。一种典型的DNA聚合酶为Taq酶。通常，DNA聚合酶的浓度为0.15U/ul。
在本发明中，所述sgRNA合成体系中的核苷三磷酸混合物为腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸。在本发明中，各种单核苷酸的浓度没有特别限制，通常每种单核苷酸的浓度为0.1mM-0.5mM，较佳地为0.25mM-0.35mM。
在本发明中，所述sgRNA合成体系中的脱氧核苷三磷酸混合物为腺嘌呤脱氧核苷三磷酸、鸟嘌呤脱氧核苷三磷酸、胞嘧啶脱氧核苷三磷酸和胸腺嘧啶脱氧核苷三磷酸。在本发明中，各种单脱氧核苷酸的浓度没有特别限制，通常每种单脱氧核苷酸的浓度为0.05mM-0.15mM，较佳地为0.1mM-0.13mM。
在本发明中，组分(e)-(p)的浓度没有特别限制，合成sgRNA可用常用浓度的组分(e)-(p)。
在一特别优选的实施方式中，所述sgRNA合成体系包括：
试剂盒
本发明提供了用于sgRNA合成的试剂盒，包括：
(k1) 第一容器，以及位于第一容器内的本发明第一方面所述的核酸构建物；
(k2) 第二容器，以及位于第二容器内的下游引物；和
(kt) 标签或说明书。
在一优选实施方式中，所述的第一容器、第二容器是同一容器或不同容器。
一种特别优选的体外sgRNA合成的试剂盒包含一个体外sgRNA合成体系，该合成体系包括：Tris-HCl 40mM，MgCl2 6mM，DTT 1mM，亚精胺 2mM，A组分1uM，B组分1uM，dNTPs 0.5mM，NTPs 1.25mM，T7 RNA 聚合酶 3.5U/ul,Taq DNA 聚合酶 0.15U/ul。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明首次开发一种简单、方便、省时、高效又节省的sgRNA体外合成方法。
(2) 本发明的方法可以将整个流程时间大幅降低（如降低到1小时以内），步骤简便，其平均费用也大大下降(降了约50%)。
(3) 本发明的方法去除了传统RNA体外转录法的PCR扩增及胶回收步骤，将整个流程的时长从4～6小时降低到1小时。本发明还减少了所需添加的试剂，令整个操作更加简便。
(4) 本发明的方法在省去了PCR扩增后，转录生成的RNA量远超传统转录法，在减少了总时长的情况下，一步法的产量还超过了传统的RNA体外转录法，产量≥1ug（1-10ug，较佳地，1-5ug）。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
在本发明中，sgRNA体外一步转录合成反应用的反应缓冲液，其具体成分为： Tris-HCl，MgCl2，DTT，亚精胺，sgRNA-R，dNTPs，NTP。
优选的，Buffer具体为：
在本发明中，还提供一种sgRNA体外一步转录合成反应用的Enzyme Mix，Mix是两种酶的混合物，一种是DNA聚合酶(Klenow聚合酶，Taq酶，Pfu酶，KOF酶，Bst酶，Phi29酶中的一种)，第二种是RNA聚合酶(T7酶，Sp6酶，U6酶中的一种)。
优选的，Enzyme Mix为Taq酶与T7RNA聚合酶的组合。
本发明的实施步骤为：
I. sgRNA模板引物设计
1.sgRNA的正向(F)引物设计
选取Target DNA序列PAM(NGG)的5’端20bp进行正向(F)引物设计，引物结构包含T7 promoter(20bp)、Target DNA片段(20bp)和实际与反向引物结合的片段(10～25bp)。
引物设计示意图如下所示：
例如，假设Target DNA片段为
5’-TCCCCGCTGCAGCATAGTGAGCCCAGAANGGCATT-3’（SEQ ID NO.:4），则引物设计的示意图如下所示：
II. sgRNA体外转录体系
按照引物设计要求设计并合成正向引物，按如下体系配制，并在37°C反应1h：
Ⅲ. sgRNA纯化
3.1 模板DNA的去除：
向转录产物中加1μl DNaseⅠ，37°C反应10min，以去除DNA模板，将反应产物放入75℃反应10min，得到的sgRNA置于-20℃保存。
3.2 sgRNA纯化(可选)：
1.转录体系20μl用RNase Free Water补至300μl，加入等体积酚•氯仿•异戊醇(25:24:1)，充分混合后，12000rpm，4°C离心15min。
2.取上清，加入300μl氯仿，充分混匀后，12000rpm，4℃离心5min。
3. 取上清约200μl，为提高回收量，下层可再加入100μl RNase Free Water，充分混合后，4℃离心5min，取上清。
4. 将两次取的上清合并，总体积约300～350μl，加入2倍体积的异丙醇和1/10体积的用RNase Free Water配制的3M NaAc，-80°C沉淀过夜。
5. 离心取沉淀，加入1ml RNase Free Water配制的75%乙醇，洗涤两次。
6. 用20μl RNase Free Water溶解RNA，电泳检测质量并进行浓度测定。
实施例1 设计A、B、C、D、E五个体外转录体系，另设计F为传统体外转录体系，比较方案优劣。
设计sgRNA正向引物(sgRNA-F)：
5’-TTAATACGACTCACTATAGGGCAGCATAGTGAGCCCAGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCA-3’（SEQ ID NO.:5）
设计sgRNA反向引物(sgRNA-R):
5’-TGCTATTTCTAGCTCTAAAAC-3’（SEQ ID NO.:6）
将sgRNA-F与sgRNA-R溶于RNase Free Water，配制成5uM浓度。
1、A与B方案实验体系，将除了引物以外的所有组分混合到一起，配制成反应缓冲液 1，其各组分如下：
A、B方案按照如下配制20μL反应体系：
反应总体积 20μL
反应缓冲液 1 10μL
sgRNA-F 2μL
sgRNA-R 2μL
RNase Free Water 6μL
使用A、B方案分别各设置4次重复，置于PCR仪，37℃条件下反应，4次重复分别反应时长为0.5h、1h、1.5h、2h。反应结束后加入1μl DNaseⅠ，37°C反应10min，以去除DNA模板，将产物进行电泳，其结果如图1。
结果表明，随着反应时间从0.5h到2h，产量提高；A方案的产量高于B方案，其中，A方案的产量为1.2ug(2h)，B方案的产量为1ug(2h)。
2、C与D方案实验体系，将除了正向引物和两种酶之外的其他组分混合，配制成 反应缓冲液 2，其各组分如下：
将Taq酶和T7 RNA酶混合在一起，配制成Enzyme Mix：
C、D方案按照如下配制20μL反应体系：
反应总体积 20μL
反应缓冲液 2 10μL
sgRNA-F 2μL
酶混合物
（Enzyme Mix） 2μL
RNase Free Water 6μL
使用C、D方案分别各设置4次重复，置于PCR仪，37℃条件下反应，4次重复分别反应时长为0.5h、1h、1.5h、2h。反应结束后加入1μl DNaseⅠ，37°C反应10min，以去除DNA模板，将产物进行电泳，其结果如图2。
结果表明，随着反应时间从0.5h到2h，产量提高；C方案的产量远远高于D方案，其中C方案的产量为2ug(2h)，D方案的产量为400ng(2h)。
3、E方案，分别配制 Transcription Mix：
和模板扩增混合物（Template Amplification Mix）：
E方案按照如下配制20μL反应体系：
反应总体积 20μL
Transcription Mix 10μL
Template Amplification Mix 4μL
sgRNA-F 2μL
sgRNA-R 2μL
RNase Free Water 2μL
使用E方案做4次重复，置于PCR仪，37℃条件下反应，4次重复反应时长分别为0.5h、1h、1.5h、2h。反应结束后加入1μl DNaseⅠ，37°C反应10min，以去除DNA模板，将产物进行电泳，其结果如图3。
结果表明，随着反应时间从0.5h到2h，产量提高，E方案的产量很低，E方案的产量为200ng(2h)。
4、 F方案, 分别配制 Transcription Mix：
和Template Amplification Mix：
将正向引物、反向引物和Template Amplification Mix配制成如下20μL PCR反应体系：
反应总体积 20μL
Template Amplification Mix 4μL
sgRNA-F 2μL
sgRNA-R 2μL
RNase Free Water 12μL
将反应体系放入PCR仪，按照如下程序进行PCR扩增：
1 95℃ 1min
2 95℃ 20s
3 68℃ 20s 返回2，25个循环
4 68℃ 1min
将PCR扩增产物配制如下20μL反应体系：
PCR产物 10μL
Transcription Mix 10μL
37 ℃，反应2小时，其sgRNA合成结果与C方案比较如图4。
结果表明，方案C效果最佳，其合成的sgRNA产量最高，可达1ug-2ug。并且意外的，其产量远超传统sgRNA合成法（传统合成法的sgRNA产量约为100ng-200ng），提高了5-10倍。
实施例2 检测一步法体外转录合成的sgRNA在CRISPR/Cas系统内的活性效果
配制19个体系，1个体系中加入阳性对照sgRNA，其余的分别加入体外转录所得的sgRNA， 37℃反应1h，70℃反应10min，10℃反应10min。
反应结束后电泳结果如图5所示。
结果表明，当反应体系中的NTP/dNTP为10:1-4:1,较佳地，8:1－3:1，更佳地，5:1-2:1时，本发明合成的sgRNA具有引导Cas9切割特异位点的活性。
并且，除了D方案0.5h转录时长所得的sgRNA因为量太少，无法引导Cas9蛋白切割DNA之外，其他所有DNA均被sgRNA引导的Cas9蛋白切割。这进一步表明通过本发明一步体外转录法合成的sgRNA具有引导Cas9切割特异位点的活性。
C方案与D方案的对比：
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海欣百诺生物科技有限公司
<120>一种sgRNA的体外合成方法及其试剂盒
<130>P2018-1147
<150>CN 201810271411.2
<151>2018-03-29
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>1
ttaatacgac tcactatagg 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>2
atttaggtga cactataga 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>3
aattaaccct cactaaagg 19
<210>4
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<220>
<221>misc_feature
<222>(29)..(29)
<223>n is a, c, g, or t
<400>4
tccccgctgc agcatagtga gcccagaang gcatt 35
<210>5
<211>61
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
ttaatacgac tcactatagg gcagcatagt gagcccagaa gttttagagc tagaaatagc 60
a 61
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tgctatttct agctctaaaa c 21