《线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法.pdf（9页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102433295 A (43)申请公布日 2012.05.02 CN 102433295 A *CN102433295A* (21)申请号 201110243564.4 (22)申请日 2011.08.24 C12N 5/07(2010.01) (71)申请人 中国科学院东北地理与农业生态研 究所 地址 150081 黑龙江省哈尔滨市南岗区哈平 路 138 号 (72)发明人 王云彪 武海涛 吴东辉 (74)专利代理机构 哈尔滨市松花江专利商标事 务所 23109 代理人 金永焕 (54) 发明名称 线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法 (57) 摘要 线虫卵活体纯化提。
2、取剂及其使用方法。它解 决了现有线虫虫卵获取方法存在卵萌发率低、 用 时长和效率低的问题。线虫卵活体纯化提取剂由 试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由氯化钠、 氢氧 化钠、 磷酸氢二钠、 次氯酸钠、 硫酸镁、 氢氧化钾、 磷酸二氢钾和蒸馏水组成 ； 试剂 B 由氯化钾、 氯 化钠、 磷酸钠和蒸馏水组成。方法 ： 一、 取同种成 熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂 A 中， 震荡后离心， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中 加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂 B， 离心后取 沉淀即完成。本发明线虫用量减少了 50， 虫卵 获取率平均提高 30， 线虫虫卵萌发率平均提高 了 20以。
3、上 ； 本发明虫卵获取率高达自然繁殖的 60 ； 虫卵孵化率达 92.6。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 CN 102433299 A1/1 页 2 1.线虫卵活体纯化提取剂， 其特征在于线虫卵活体纯化提取剂由试剂A和试剂B组成 ； 其中试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化钠、 1 1.5g 的氢氧化钠、 0.3 0.5g 的磷酸氢二钠、 1 1.5g 的次氯酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的磷酸二氢 钾和 100mL 的蒸馏水组成。
4、 ； 试剂 B 由 0.3 0.4g 的氯化钾、 0.2 0.3g 的氯化钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。 2. 根据权利要求 1 所述的线虫卵活体纯化提取剂， 其特征在于线虫卵活体纯化提取剂 由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.33g 的氯化钠、 1.10g 的氢氧化钠、 0.40g 的磷酸氢 二钠、 1.11g 的次氯酸钠、 0.01g 的硫酸镁、 1.34g 的氢氧化钾、 0.20g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.30g 的氯化钾、 0.25g 的氯化钠、 2.68g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏 水组成。 3。
5、. 权利要求 1 所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法， 其特征在于线虫卵活体纯化 提取剂的使用方法如下 ： 一、 取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂 A 中， 震荡310min， 然后以900013000r/min的转速离心13min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂B， 然后以900013000r/min的转速离心1 3min， 重复离心 1 4 次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用 ； 其中步骤一中线 虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成， 试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化钠、 1 1.5g 的 氢氧化钠、 0.。
6、3 0.5g 的磷酸氢二钠、 1 1.5g 的次氯酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3 0.4g 的氯化钾、 0.2 0.3g 的氯化钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫 ； 步骤一中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同 种成熟雌性线虫。 4. 根据权利要求 3 所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法， 其特征在于步骤一中震 荡 4 9min， 然后以 10000 12000r/。
7、min 的转速离心 1.5 2.5min。 5. 根据权利要求 3 所述的线虫卵活体纯化提取剂的使用方法， 其特征在于步骤一中震 荡 5min， 然后以 11000r/min 的转速离心 2min。 权 利 要 求 书 CN 102433295 A CN 102433299 A1/4 页 3 线虫卵活体纯化提取剂及其使用方法 技术领域 0001 本发明涉及提取剂及其使用方法。 背景技术 0002 线虫属于线形动物门 (Nematoda)， 已知 1.5 万种， 为地球上数量最大的动物类群。 线虫生境广布， 营养结构复杂， 生活史周期短， 且分离方法简便高效， 并易于分类鉴定， 在分 子生物学领。
8、域被广泛而深入研究， 因其具备作为指示生物的优势和潜质可在农学和环境生 态学领域被应用为生物标志物。线虫作为模式生物和进行室内模拟试验， 要求对目标线虫 进行种源维持、 继代和同龄化培养。 0003 作为线虫室内研究的基础， 获取足量且高质的线虫虫卵以进行控制培养的方法一 直在不断探究。线虫虫卵的获取多是利用物理工具或单一化学药品， 尚缺乏辅以生物化学 试剂的虫卵提取配剂。如植物根结线虫一般用针挑法在线虫附着物上直接获取虫卵 ； 土壤 线虫虫卵常用网筛过滤获得 ； 秀丽隐杆线虫虫卵常用高浓度碱液和氧化剂获得， 并逐渐应 用于其他种属线虫虫卵的获取。 0004 目前， 常用线虫虫卵获取方法存在很。
9、多不足， 首先， 针挑法和筛选法虽然可保证线 虫虫卵的大量获取， 但由于线虫种类繁多生态位相近而不同种属线虫卵差异较小， 无法保 证纯种线虫虫卵的获取， 且线虫虫卵通过针挑或筛触容易受到损伤， 难以保证正常发育。 因 此传统的针挑法和筛选法不能高质量和高效率的获取纯种线虫虫卵 ； 其次， 利用秀丽隐杆 线虫虫卵提取方法进行其他种类的线虫虫卵获取， 当裂解液浓度过高会伤及虫卵， 使得获 取的虫卵不萌发 ； 而裂解液浓度过低， 用时可长达几十个小时， 且虫体分解不完全， 不能保 证足量虫卵的获得， 且无法分离的大量残体会影响卵的萌发。 发明内容 0005 本发明目的是为了解决现有线虫虫卵获取方法存。
10、在杂种培养、 卵萌发率低、 残体 和杂菌干扰、 工作量大、 用时长和效率低的问题， 而提供线虫卵活体纯化提取剂及其使用方 法。 0006 线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化 钠、 1 1.5g 的氢氧化钠、 0.3 0.5g 的磷酸氢二钠、 1 1.5g 的次氯酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3 0.4g 的氯化钾、 0.2 0.3g 的氯化钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。 0007 线虫卵。
11、活体纯化提取剂的使用方法如下 ： 一、 取同种成熟雌性线虫加入到线虫卵 活体纯化提取剂的试剂 A 中， 震荡 3 10min， 然后以 9000 13000r/min 的转速离心 1 3min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂 B， 然后以 9000 13000r/min 的转速离心 1 3min， 重复离心 1 4 次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提 取剂的使用 ； 其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化钠、 1 1.5g 的氢氧化钠、 0.3 0.5g 的磷酸氢二钠、 1 1.5g 的。
12、次氯 说 明 书 CN 102433295 A CN 102433299 A2/4 页 4 酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3 0.4g 的氯化钾、 0.2 0.3g 的氯化钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫 ； 步骤一 中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫。 0008 本发明已在科研工作中进行了应用， 通过对国家自然科学基金 “线虫 HSPs 对重金 属胁。
13、迫的响应机制” 的研究中进行的实际操作， 取得了较好的试验效果。 本发明与传统的线 虫虫卵获取方法相比， 工作效率大幅度提高， 线虫用量减少了50。 经过对提取虫卵的统计 检验表明， 虫卵获取率平均提高 30。线虫虫卵萌发率平均提高了 20以上。 0009 本发明解决了传统的线虫虫卵获取方法中杂种培养、 卵萌发率低、 残体和杂菌干 扰、 工作量大、 用时长、 效率低的问题。本发明中的线虫卵活体纯化提取剂及提取方法以单 种甚至单条成熟雌性线虫为裂解对象， 短时间内可对成虫进行充分高效的裂解， 而不伤及 腹内虫卵。 0010 本发明线虫卵活体纯化提取剂中的碱剂、 氧化剂和缓冲剂比例适当， 对线虫表。
14、皮 和肌体进行充分裂解而不伤害虫卵， 而虫卵获取率高达自然繁殖的 60。在线虫裂解过程 中， 成虫虫体裂解完全， 对后期卵的孵化无干扰， 解决了母体残留出现的腐烂、 生长杂菌等 情况 ； 而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小， 虫卵孵化率达 92.6， 与线虫自然产卵孵 化率相当。传统方法对线虫的裂解需要过夜， 本发明用时短， 操作便捷， 提高了线虫虫卵的 获取效率和质量。 附图说明 0011 图 1 为具体实施方式十一中每条成熟雌性线虫产卵个数的柱状图 ； 图 2 为具体实 施方式十一中获得线虫卵的萌发率的柱状图 ； 图 3 为具体实施方式十二中每条成熟雌性线 虫产卵个数的柱状图 ； 图 4 。
15、为具体实施方式十二中获得线虫卵的萌发率的柱状图 ； 图 5 为 具体实施方式十三中每条成熟雌性线虫产卵个数的柱状图 ； 图 6 为具体实施方式十三中获 得线虫卵的萌发率的柱状图。 具体实施方式 0012 具体实施方式一 ： 本实施方式线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其 中试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化钠、 1 1.5g 的氢氧化钠、 0.3 0.5g 的磷酸氢二钠、 1 1.5g 的次氯酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的磷酸二氢 钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3 0.4g 的氯化钾、。
16、 0.2 0.3g 的氯化钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。 0013 具体实施方式二 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是线虫卵活体纯化提取剂 由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.3g 的氯化钠、 1g 的氢氧化钠、 0.3g 的磷酸氢二钠、 1g 的次氯酸钠、 0.005g 的硫酸镁、 1g 的氢氧化钾、 0.1g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组 成 ； 试剂 B 由 0.3g 的氯化钾、 0.2g 的氯化钠、 2g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。其它与 具体实施方式一相同。 0014 具体实施方式三 ： 本实施方式与具体实施方式一。
17、不同的是线虫卵活体纯化提取剂 由试剂 A 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.4g 的氯化钠、 1.5g 的氢氧化钠、 0.5g 的磷酸氢二 说 明 书 CN 102433295 A CN 102433299 A3/4 页 5 钠、 1.5g 的次氯酸钠、 0.02g 的硫酸镁、 1.5g 的氢氧化钾、 0.3g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸 馏水组成 ； 试剂 B 由 0.4g 的氯化钾、 0.3g 的氯化钠、 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。 其它与具体实施方式一相同。 0015 具体实施方式四 ： 本实施方式与具体实施方式一不同的是线虫卵活体纯化提取剂 由试剂 A。
18、 和试剂 B 组成 ； 其中试剂 A 由 0.33g 的氯化钠、 1.10g 的氢氧化钠、 0.40g 的磷酸氢 二钠、 1.11g 的次氯酸钠、 0.01g 的硫酸镁、 1.34g 的氢氧化钾、 0.20g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.30g 的氯化钾、 0.25g 的氯化钠、 2.68g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏 水组成。其它与具体实施方式一相同。 0016 具体实施方式五 ： 本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下 ： 一、 取同 种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂A中， 震荡310min， 然后以9000 13000r/min。
19、的转速离心13min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取 剂的试剂B， 然后以900013000r/min的转速离心13min， 重复离心14次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提取剂的使用 ； 其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试 剂 B 组成， 试剂 A 由 0.3 0.4g 的氯化钠、 1 1.5g 的氢氧化钠、 0.3 0.5g 的磷酸氢二 钠、 1 1.5g 的次氯酸钠、 0.005 0.02g 的硫酸镁、 1 1.5g 的氢氧化钾、 0.1 0.3g 的 磷酸二氢钾和100mL的蒸馏水组成 ； 试剂B由0.30.4g的氯化钾、 0.20.3g的氯化。
20、钠、 2 3g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 的用量为 1mL 处理 100 只同种成 熟雌性线虫 ； 步骤一中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫。 0017 具体实施方式六 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡 3min， 然后以 9000r/min 的转速离心 3min。其它与具体实施方式一至五之一相同。 0018 具体实施方式七 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡 10min， 然后以 13000r/min 的转速离心 1min。其它与具体实施方式一至五之一相同。 0019 具体实施方式。
21、八 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡 4 9min， 然后以 10000 12000r/min 的转速离心 1.5 2.5min。其它与具体实施方式一 至五之一相同。 0020 具体实施方式九 ： 本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤一中震荡 5min， 然后以 11000r/min 的转速离心 2min。其它与具体实施方式一至五之一相同。 0021 具体实施方式十 ： 本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是步骤一中线虫 卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成， 试剂 A 由 0.35g 的氯化钠、 1.3g 的氢氧化钠、 0.38g 的磷酸氢二钠。
22、、 1.4g 的次氯酸钠、 0.015g 的硫酸镁、 1.2g 的氢氧化钾、 0.2g 的磷酸二 氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.35g 的氯化钾、 0.25g 的氯化钠、 2.5g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成。其它与具体实施方式一至九之一相同。 0022 具体实施方式十一 ： 本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下 ： 一、 取 同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂 A 中， 震荡 5min， 然后以 13000r/ min 的转速离心 2min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂 B， 然后以 13000r。
23、/min 的转速离心 2min， 重复离心 2 次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提取 剂的使用 ； 其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成， 试剂 A 由 0.33g 的 氯化钠、 1.1g的氢氧化钠、 0.4g的磷酸氢二钠、 1.11g的次氯酸钠、 0.01g的硫酸镁、 1.34g的 氢氧化钾、 0.2g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3g 的氯化钾、 0.25g 的氯 说 明 书 CN 102433295 A CN 102433299 A4/4 页 6 化钠、 2.68g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 。
24、的用量为 1mL 处理 100 只同 种成熟雌性线虫 ； 步骤一中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫。 0023 本实施方式中结果如图 1 所示， 线虫表皮和肌体充分裂解， 虫卵获取率高达自然 繁殖的 60 ； 在线虫裂解过程中， 成虫虫体裂解完全， 对后期卵的孵化无干扰， 解决了母体 残留出现的腐烂、 生长杂菌等情况 ； 而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小， 虫卵孵化率达 92.6， 与线虫自然产卵孵化率相当 ( 见图 2)。 0024 具体实施方式十二 ： 本实施方式线虫卵活体纯化提取剂的使用方法如下 ： 一、 取 同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂。
25、 A 中， 震荡 10min， 然后以 13000r/ min 的转速离心 3min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂 B， 然后以 13000r/min 的转速离心 3min， 重复离心 4 次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提取 剂的使用 ； 其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成， 试剂 A 由 0.35g 的 氯化钠、 1.2g的氢氧化钠、 0.4g的磷酸氢二钠、 1.2g的次氯酸钠、 0.01g的硫酸镁、 1.2g的氢 氧化钾、 0.2g 的磷酸二氢钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.35g 的氯化钾、 0.2。
26、5g 的氯 化钠、 2.5g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 的用量为 1mL 处理 100 只同 种成熟雌性线虫 ； 步骤一中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫。 0025 本实施方式中结果如图 3 所示， 线虫表皮和肌体充分裂解， 虫卵获取率高达自然 繁殖的 60 ； 在线虫裂解过程中， 成虫虫体裂解完全， 对后期卵的孵化无干扰， 解决了母体 残留出现的腐烂、 生长杂菌等情况 ； 而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小， 虫卵孵化率达 92.6， 与线虫自然产卵孵化率相当 ( 见图 4)。 0026 具体实施方式十三 ： 本实施方式线虫卵活。
27、体纯化提取剂的使用方法如下 ： 一、 取 同种成熟雌性线虫加入到线虫卵活体纯化提取剂的试剂 A 中， 震荡 8min， 然后以 13000r/ min 的转速离心 3min， 弃上清液留沉淀 ； 二、 向沉淀中加入线虫卵活体纯化提取剂的试剂 B， 然后以9000r/min的转速离心3min， 重复离心3次后取沉淀， 即完成线虫卵活体纯化提取剂 的使用 ； 其中步骤一中线虫卵活体纯化提取剂由试剂 A 和试剂 B 组成， 试剂 A 由 0.33g 的氯 化钠、 1.1g的氢氧化钠、 0.4g的磷酸氢二钠、 1.11g的次氯酸钠、 0.01g的硫酸镁、 1.34g的氢 氧化钾、 0.2g 的磷酸二氢。
28、钾和 100mL 的蒸馏水组成 ； 试剂 B 由 0.3g 的氯化钾、 0.25g 的氯化 钠、 2.68g 的磷酸钠和 100mL 的蒸馏水组成 ； 步骤一中试剂 A 的用量为 1mL 处理 100 只同种 成熟雌性线虫 ； 步骤一中试剂 B 的用量为 1mL 处理 100 只同种成熟雌性线虫。 0027 本实施方式中结果如图 5 所示， 线虫表皮和肌体充分裂解， 虫卵获取率高达自然 繁殖的 60 ； 在线虫裂解过程中， 成虫虫体裂解完全， 对后期卵的孵化无干扰， 解决了母体 残留出现的腐烂、 生长杂菌等情况 ； 而对从成虫体内裂解出的虫卵损伤极小， 虫卵孵化率达 92.6， 与线虫自然产卵孵化率相当 ( 见图 6)。 说 明 书 CN 102433295 A CN 102433299 A1/3 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102433295 A CN 102433299 A2/3 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102433295 A CN 102433299 A3/3 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102433295 A 。