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检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102424844 B (45)授权公告日 2013.04.17 CN 102424844 B *CN102424844B* (21)申请号 201110438771.5 (22)申请日 2011.12.23 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (73)专利权人北京同仁堂股份有限公司地址 100176 北京市北京经济技术开发区西环南路 8 号专利权人北京同仁堂科技发展股份有限公司北京中研同仁堂医药研发有限公司 (72)发明人李志猛曹梦姚璐彭鹏张晓楠张丽娟 (74)专利代理机构北京三友知识产权代理有。

2、限公司 11127 代理人韩蕾李峰等 .羚羊角及伪品的凝胶电泳鉴别 .中草药 .2001, 第 32 卷 ( 第 5 期 ), 第 454 456 页 . 孙宝森 .动物角类的药用研究概况 .中医药信息 .2004, 第 21 卷 ( 第 3 期 ), 第 25 26 页 . 徐敏等 . DNA 分子遗传标记技术在中药鉴定中的应用 .中华中医药学刊 .2008, 第 26 卷 ( 第 10 期 ), 第 2280 2282 页 . (54) 发明名称检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物 (57) 摘要本发明提供了一种检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物，所述的方法主要包。

3、括：从待测混合物中提取总 DNA ；以所提取的总 DNA 为模板，利用特异性引物进行 PCR 扩增；所述特异性引物为选自： SEQ ID Nos.1和2、 SEQ ID Nos.3和4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 中的一对、两对或三对引物；对扩增结果进行分析判断。本发明进一步提供了包含上述引物的检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒。本发明的引物具有较高的特异性和灵敏性。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员张硕颖权利要求书 1 页说明书 10 页序列表 4 页。

4、附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 10 页序列表 4 页附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括：从待测混合物中提取总 DNA ；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自： SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 中的一对、两对或三对引物；对上述扩增结果进行分析判断。 2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括如下步。

5、骤：待测混合物经煮沸法处理 20 40 分钟；加入 CTAB 提取缓冲液 60 70消化 2 4 小时；用酚仿法抽提；加入异丙醇沉淀富集 DNA ；利用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总 DNA。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法，其中，所述 PCR 扩增反应条件如下：反应体系为15l，其中10PCR缓冲液15.5l， 2.5mM dNTPs0.51.8l， 10M 上下游引物各 0.5 1.5l， 5U/l Taq DNA 聚合酶 0.2 1.2l， 50ng/l DNA 模板 0.8 3l，无菌超纯水补至 15l ；扩增条件： 95预。

6、变性5min ； 95变性30s， 4868退火30s， 72延伸30s， 3540 个循环；最后 72延伸 7 10min。 4. 根据权利要求 3 所述的方法，其中，所述 SEQ ID Nos.1 和 2 的退火温度为 52，所述 SEQ ID Nos.3 和 4 的退火温度为 50，所述 SEQ ID Nos.5 和 6 的退火温度为 58。 5. 根据权利要求 1 所述的方法，其中，所述对上述扩增结果进行分析判断的过程包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。 6. 根据权利要求 1 所述的方法，其中，所述待测混合物为需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品。

7、入药的中药制剂。 7. 根据权利要求 1 所述的方法，该方法还包括：将待测混合物样品的扩增结果与从山羊角中提取 DNA 进行 PCR 扩增的结果进行对照，分析判断所测混合物中是否存在山羊角成分。 8. 根据权利要求 1 或 7 所述的方法，其中，以 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 分别进行 PCR 扩增，扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则所测混合物中存在山羊角成分。 9. 用于实现权利要求 1 8 任一项所述检测混合物中山羊角成分的方法的引物，该引物为选自 SEQ ID Nos.1 和。

8、 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 中的一对、两对或三对引物。 10. 权利要求 9 所述的引物在检测混合物中是否存在山羊角成分中的应用。 11. 根据权利要求 10 所述的应用，其中，所述待测混合物为需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂。 12. 一种检测混合物中山羊角成分的试剂盒，该试剂盒包含权利要求 9 所述的引物。 13. 根据权利要求 12 所述的试剂盒，该试剂盒还进一步包括 PCR 缓冲液、 dNTPs 和 DNA 聚合酶。权利要求书 CN 102424844 B 2 1/10 页。

9、3 检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物技术领域 0001 本发明涉及应用分子生物学技术检测混合物特别是药材中山羊角成分的方法，具体地涉及检测药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的方法，以及该方法中所用到的特异性引物。背景技术 0002 山羊角为牛科动物青羊、背山羊的角，具有与羚羊角相似的镇痛和解热作用，可作为羚羊角的替代品，其资源丰富，有利于降低成本，保护珍稀动物。但目前对于山羊角的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。 0003 另一方面，脊椎动物线粒体基因组大小为 16kb。

10、左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。 0004 在含山羊角成分的混合物例如药材、或者以山羊角入药的中药制剂等的生产加工过程中，山羊角中的部分 DNA 通常能够保留于其中，因此，混合物中的山羊角成分可以从其携带的 DNA 检测中获得鉴定。 0005 然而，在混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分鉴定的研究技术上，由于混合物中山羊角 DNA 含量很低，并且含有多种抑制 PCR 反应的成分，因此，如何能够有效提取其中的 D。

11、NA 是分子生物学技术鉴定山羊角成分的一个关键；同时，含山羊角的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，如何设计山羊物种特异性引物也成为鉴定技术的另一关键。发明内容 0006 本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法，以准确、有效地鉴别混合物中是否含有山羊角成分。 0007 本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中的特异性引物。 0008 本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角。

12、或其替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。 0009 为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括： 0010 从待测混合物中提取总 DNA ； 0011 以所提取的总 DNA 为模板，利用特异性引物进行聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction， PCR) 扩增； 0012 对上述扩增结果进行分析判断。说明书 CN 102424844 B 3 2/10 页 4 0013 如前所述，通常，含山羊角的混合物特别是混合药材、或者以山羊角入药的中药制剂中，。

13、山羊角成分含量很低，并还含有较多的其它动植物物种，还可能含有多种抑制 PCR 反应的成分，在此情况下，设计山羊物种特异性引物是本发明的分子生物学检测技术的关键之一。 0014 根据本发明的具体实施方案，本案发明人从山羊角中提取了总 DNA，根据 NCBI 中公布的山羊线粒体 DNA 与核 DNA 序列设计引物，经扩增、测序，提交 blastn 比对、分析等，设计了本发明的山羊特异性引物。所设计的山羊特异性引物为选自如下 SEQ ID Nos.1 和 2( 本发明中亦将该引物对命名为 G1F/R)、 SEQ ID Nos.3 和 4( 本发明中亦将该引物对命名为 G。

14、2F/R)、以及 SEQ ID Nos.5 和 6( 本发明中亦将该引物对命名为 G3F/R) 中的一对、两对或三对引物： 0015 G1F/R ： 5 -ACAATAACAGCATTTTC-3 (SEQ ID NO ： 1)/ 0016 5 -ATAGACCTCGTCCGATA-3 (SEQ ID NO ： 2) ； 0017 G2F/R ： 5 -ACAGCATTCATAGGCTATGTTT-3 (SEQ ID NO ： 3)/ 0018 5 -TTTCGTGGAGGAAGAGC-3 (SEQ ID NO ： 4) ； 0019 G3F/R ： 5 -CGGAGACCCAGACAA。

15、CTATATC-3 (SEQ ID NO ： 5)/ 0020 5 -TGTGGAGGAAGGGTACA-3 (SEQ ID NO ： 6)。 0021 如前所述，通常含山羊角的混合物特别是药材、或者以山羊角入药的中药制剂中山羊角 DNA 成分的含量是很低的，如何能够有效提取其中的 DNA，是本发明检测山羊角成分技术的另一个关键。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述从待测混合物中提取总 DNA 的过程包括以下步骤： 0022 待测混合物经煮沸法处理 20 40 分钟； 0023 加入 CTAB 提取缓冲液 60 70消化 2 4 小时； 0024 用酚仿法抽。

16、提； 0025 加入异丙醇沉淀富集 DNA ； 0026 利用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总 DNA。 0027 根据本发明的具体实施方案，本发明的上述方法特别适合于对以山羊角入药的药材混合物或中药制剂中山羊角总 DNA 进行提取，即使药材混合物或中药制剂中山羊角成分含量含量低至 3wt ( 除特别注明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例 )，或是药材或中药制剂中含有其他多种动植物成分 ( 例如，山羊角方或羚羊角方的羚羊清肺丸，含有二十四味药；牛黄清心丸，含有二十九味药；等)，也能有效提取其中的DNA。根据本发明的具体实施方案，上。

17、述从待测混合物中提取总 DNA 的过程中： 0028 所述煮沸法处理待测混合物样品主要是破碎细胞，具体操作时可根据需要向待测混合物中加入适量的水 ( 通常，每 3 5g 总固含量的待测样品加 10ml 水 )，煮沸通常是可以在常压下进行 (100左右 )，煮沸时间 20 40 分钟，优选 30 分钟 40 分钟。 0029 所述向煮沸后的待测样品中加入 CTAB 提取缓冲液进行消化处理，主要是破坏混合物中的多糖多酚类物质。根据本发明的优选具体实施方案，所用 CTAB 提取缓冲液的组成为： 3 CTAB， 100mM Tris-HCl pH 8.0， 20mM EDTA。

18、 pH 8.0， 2.5M NaCl。最优选的消化处理条件为：等体积混合， 65， 3 小时。 0030 所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白质、色素等溶于有机物的杂质。酚仿法说明书 CN 102424844 B 4 3/10 页 5 抽提的具体操作可以按照所属领域的常规操作进行。根据本发明的优选实施方案，本发明中所述酚仿法抽提的操作为：经 CTAB 缓冲液消化后的样品冷却至室温后加入等体积苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 24 1)，混匀， 12000rpm 离心 20 分钟，取上清；再加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24 1)，混匀， 12000rpm 离心。

19、 20 分钟，取上清。 0031 本发明中，向上述经酚仿法抽提得到的上清中加入异丙醇主要是沉淀富集DNA。根据本发明的优选实施方案，具体操作为：加入等体积预冷的异丙醇，混匀， 4 12000rpm 离心20分钟，弃上清，沉淀用75酒精洗涤。为便于后续纯化步骤，可将洗涤后的提取物用适量双蒸水溶解。 0032 所述利用PCR纯化试剂盒进行纯化的步骤主要是去除DNA中残留的色素等水溶性杂质。 PCR纯化试剂盒可以采用所属领域常用的商购产品，具体操作可以按照纯化试剂盒的说明书进行。 0033 根据本发明的具体实施方案，当待测混合物中含有较多多糖类物质时，在提取总。

20、DNA 的过程中，在经酚仿法抽提得到的上清中，还可加入 LiCl 过夜处理，以去除残留多糖类物质，之后再加入异丙醇沉淀富集 DNA。此外，对于利用 PCR 纯化试剂盒所纯化得到的总 DNA，还可进行琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 提取情况。 0034 在本发明的一具体实施方案中，所述的待测混合物为以山羊角或其替代品 ( 例如黄羊角或其他物种伪品 ) 入药的中药制剂或混合药材，其中除山羊角或其替代品外，还含有其他多种动植物成分，例如，羚羊清肺丸含有二十四味药，牛黄清心丸含有二十九味药等，本发明的方法是用于检测该中药制剂或混合药材中是否是真正以山羊角入药。在该具体实。

21、施方案中，为有效提取其中的总 DNA，是按照以下操作进行：将待测混合物样品粉碎，加适量水 ( 通常每 3 5g 总固含量的样品加 10ml 水 )，常压煮沸 30 分钟 40 分钟；向煮沸处理后的待测样品中加入等体积 CTAB 提取缓冲液 (3 CTAB， 100mMTris-HCl pH 8.0， 20mMEDTApH 8.0， 2.5MNaCl)， 65消化处理 3 小时；之后冷却至室温，加入等体积苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 24 1)，混匀， 12000rpm 离心 20 分钟，取上清；再加入等体积氯仿 / 异戊醇 (24 1)，混匀， 12。

22、000rpm 离心 20 分钟，取上清；加入 1/4 体积 10M LiCl，混合后 4 过夜；然后样品在 4 12000rpm 离心 30 分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，混匀后 4 12000rpm 离心 20 分钟，弃上清；用 75酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解，溶解的 DNA 经 PCR 纯化试剂盒纯化，得到提取的总 DNA( 具体可采用康为世纪 PCR 产物纯化试剂盒 50T，货号 CW0521，在其说明书指导的操作基础上，可适当增加去杂质缓冲液洗涤体积及次数，以达到更好的纯化效果 )。纯化后的 DNA 可用 0.7琼脂糖凝胶电泳检测提。

23、取情况。按照本发明的该提取方法，即使待测混合物中山羊角成分含量低至 3左右，也能有效提取其 DNA，用于后续 PCR 扩增。 0035 根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂等中山羊角成分的方法中，所述 PCR 扩增反应条件如下： 0036 反应体系为15l，其中10PCR缓冲液15.5l， dNTPs(2.5mM)0.51.8l，上下游引物 (10M) 各 0.5 1.5l， Taq DNA 聚合酶 (5U/l)0.2 1.2l， DNA 模板 (50ng/l)0.8 3l，无菌超纯水补至 15l ； 0037 扩增条件： 9。

24、5预变性 5min ； 95变性 30s， 48 68退火 30s， 72延伸 30s，共 35 40 个循环；最后 72延伸 7 10min。说明书 CN 102424844 B 5 4/10 页 6 0038 本发明中，是以所述的引物对分别以所提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增，即，单重 PCR 扩增。所述 PCR 扩增反应条件中，优选的退火温度为 50 58。最优选地，其中，所述引物对 SEQ ID Nos.1 和 2 的最佳退火温度为 52，所述引物对 SEQ ID Nos.3 和 4 的最佳退火温度为 50，所述引物对 SEQ ID Nos.5 。

25、和 6 的最佳退火温度为 58。 0039 根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中，所述对扩增结果进行分析判断主要是进行定性分析，定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如，该分析过程可包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物，根据是否扩增出目的片段，以定性检测待测混合物中是否存在相应的山羊角成分。 0040 本发明中，所述的待测混合物可以是指含有或可能含有山羊角成分的任何混合物，包括药材、中药制剂等。具体地，当需要鉴别某一药材是否为山羊角时，或者需要鉴别某一中药制剂是以山羊角或是其他物种的替代品入药。

26、时，本发明的检测方法特别适用。可以理解，本发明的方法所适用的待测混合物中并不含有山羊物种除山羊角外的其它组织成分，或者已通过其它方法排除含有山羊的其它组织成分，即，本发明的方法是特别针对以山羊角入药或以山羊角的替代品入药的中药制剂进行检测，判别其中是否含有山羊角成分。 0041 根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法还包括： 0042 将待测混合物样品的扩增结果与从山羊角中提取DNA进行PCR扩增的结果进行对照，分析判断所测混合物中是否存在山羊角成分。从山羊角中提取 DNA 的具体操作可以按照生物技术领域从。

27、单一物种中提取 DNA 的常规操作进行。 0043 根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中，是以引物对 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 分别进行 PCR 扩增，如果扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则初步判断所测混合物中存在山羊角成分。特别是以引物对 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 分别进行 PCR 扩增，均能扩增相应的目的片段，则所测混合物中存在山羊角。

28、成分。 0044 另一方面，本发明还提供了用于实现本发明所述检测混合物中山羊角成分的方法的引物，该引物包括选自： SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 中的一对、两对或三对引物。 0045 本发明的上述引物对，在检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、以山羊角或替代品入药的中药制剂中是否存在山羊角成分中具有应用前景，能够特异性检测待测混合物中是否含有山羊角成分，并且，检测灵敏度高，当混合物中包含的山羊角成分含量为 3 ( 质量百分比 ) 时，也能有效提取并特异性地检测出来。 0046 另。

29、一方面，本发明还提供了一种检测混合物中山羊角成分的试剂盒，该试剂盒中包含本发明所述的引物，优选还可进一步包括相应的 PCR 缓冲液、 dNTPs、 DNA 聚合酶等。具体地，其中所述的引物是本发明所述的引物对 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 中的一对、两对或三对引物。 0047 有益效果 0048 综上所述，本发明从含山羊角成分的混合物中提取了总 DNA，设计了山羊物种特异说明书 CN 102424844 B 6 5/10 页 7 性引物，分别以所述山羊物种特异性引物 PCR 扩增含有山羊。

30、角或伪品成分的混合物 DNA。本发明所设计的扩增引物以及扩增方法具有较高的特异性，且检测灵敏度高，可单独作为一种快速检测方法应用于对含有山羊角或伪品成分的混合物特别是药材、中药制剂进行检测，准确地定性检测混合物中山羊角成分的存在情况。附图说明 0049 图 1 显示按照本发明实施例 1 的方法从不同药材中提取总 DNA 的琼脂糖电泳检测结果。图中， M 为 100bp DNALadder，泳道 1 ：山羊角粉，泳道 2 ：羚羊角粉，泳道 3 ：塞隆骨，泳道 4 ：豹骨。 0050 图 2 显示从一些半成品或成品中药制剂中提取总 DNA 的琼脂糖电泳检测结果。。

31、其中，泳道1 ：同仁堂再造丸半成药(豹骨方) ；泳道2 ：同仁堂再造丸成药(豹骨方) ；泳道3 ：同仁堂再造丸半成药 ( 塞隆骨方 ) ；泳道 4 ：同仁堂再造丸成药 ( 塞隆骨方 ) ；泳道 5 ：羚羊清肺丸半成药 ( 羚羊角方 ) ；泳道 6 ：羚羊清肺丸成药 ( 羚羊角方 ) ；泳道 7 ：羚羊清肺丸半成药 ( 山羊角方 ) ；泳道 8 ：羚羊清肺丸成药 ( 山羊角方 ) ； M 为 DL2000。 0051 图 3 显示利用通用引物对 SEQ ID Nos.7 和 8 以从山羊角中提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增的产物测序结果。图中，上。

32、方序列为山羊 (Capra hircus) 序列，下方序列是以赛加羚羊 (Saiga tatarica) 序列做对照。 0052 图4显示依据山羊物种特异分子标记(SNP)特征设计用于山羊物种检测的特异引物结果。其中，上方序列为山羊序列，下方序列为羚羊序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。 0053 图 5 为用本发明的山羊物种特异性引物 PCR 扩增不同混合物样品 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道 1 为羚羊清肺丸成药 ( 羚羊角方 )，泳道 2 为牛黄清心丸成药 ( 羚羊角方 )，泳道 3 为羚羊清肺丸成药 ( 山羊角方 )，泳道 4 为牛黄清心丸成。

33、药 ( 山羊角方 )，泳道 5 为羚羊角药材，泳道 6 为山羊角药材，泳道 7 为空白对照。具体实施方式 0054 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。 0055 实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件； 0056 实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，各试剂除标注外，均购自北京化学试剂公司； 0057 所用引物委托 Invitrogen 公司合成。 0058 实施例 1 羚羊清肺丸 ( 山羊角方 ) 中山羊角成分检测 0059 1、山羊。

34、角总 DNA 的提取 0060 该提取步骤可以按照所属领域的常规操作进行。本实施例的具体操作如下：山羊角经液氮研磨成粉状，取 200g 加入 1ml 裂解液 B(10mM Tris-HCl pH8.0， 0.1M EDTApH8.0， 0.5 SDS， 200g/ml 蛋白酶 K， 0.4M DTT)， 55消化过夜，消化样品 100煮 10min，冰浴 5min， 12000rpm 离心 15min 取上清进行酚仿抽提。之后用 2 倍体积无水乙醇沉说明书 CN 102424844 B 7 6/10 页 8 淀 DNA，再用 75乙醇洗沉淀两遍，适量双蒸水溶解。样品 DNA。

35、经 PCR 纯化试剂盒 ( 康为世纪 PCR 产物纯化试剂盒 50T，货号 CW0521，具体操作按照说明书进行 ) 纯化，得 DNA 提取样品。经 0.7琼脂糖凝胶电泳检测，结果请参见图 1 所示。 0061 另，按照上述方法以羚羊角药材为原料提取得到 DNA。此外还分别以塞隆骨、豹骨为原料，按照传统方法，均分别提取得到 DNA。各原料所提取的 DNA 的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图 1 所示。 0062 2、羚羊清肺丸 ( 山羊角方 ) 中总 DNA 的提取 0063 选用 3 批次 (10 丸 / 批次 ) 同仁堂羚羊清肺丸成药 ( 山羊角方 ) 为待测样品。每。

36、份样品取所述羚羊清肺丸 ( 山羊角方 ) 成药 ( 二十四味 )4g( 约 1 丸 )，其中山羊角成分约占 3 ( 质量百分比 )。将药丸切碎，用 10ml 双蒸水充分溶解后， 100水浴 30 分钟，冰浴 10 分钟冷却， 4 12000rpm 离心 20 分钟，取上清；加入等体积 (10ml)CTAB 提取缓冲液 (3 CTAB， 100mM Tris-HCl pH 8.0， 20mM EDTA pH 8.0， 2.5M NaCl)， 65水浴3小时；样品冷却至室温后加入等体积苯酚 / 氯仿 / 异戊醇 (25 24 1)，缓慢颠倒混匀， 12000rpm 离心 2。

37、0 分钟，取上清；加入等体积氯仿/异戊醇(241)，缓慢颠倒混匀， 12000rpm离心20分钟，取上清；加入 1/4 体积 10M LiCl，缓慢颠倒混合后 4过夜；样品 4 12000rpm 离心 30 分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀后 4 12000rpm 离心 20 分钟，弃上清；用 75 酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解。溶解的 DNA 经 PCR 纯化试剂盒 ( 康为世纪 PCR 产物纯化试剂盒 50T，货号 CW0521，按照说明书的操作进行，并增加去杂质缓冲液洗涤体积至 350l、洗涤次数增为 2 次纯化，得到纯化的。

38、DNA。纯化的 DNA 经 0.7琼脂糖凝胶电泳检测提取情况，结果请参见图 2(3 批次共 30 例样品提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况 )。 0064 另，分别以同仁堂羚羊清肺丸半成药 ( 山羊角方 )(3 批次， 10 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4g)、羚羊清肺丸半成药 ( 羚羊角方 )(3 批次， 10 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4g)、羚羊清肺丸成药 ( 羚羊角方 )(3 批次， 10 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4g)、同仁堂再造丸半成药 ( 豹骨方 )(3 批次， 5 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4。

39、g)、同仁堂再造丸成药 ( 豹骨方 )(3 批次， 5 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4g)、同仁堂再造丸半成药 ( 塞隆骨方 ) (3 批次， 5 丸 / 批次，每丸为一例样品，约 4g)、同仁堂再造丸成药 ( 塞隆骨方 )(3 批次， 5 丸 /批次，每丸为一例样品，约4g)为待测样品，按照上述方法，均分别提取得到了总DNA，各种待测样品的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图 2 所示 ( 同样的，由于每种样品的多例提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况 )。 0065 本发明中，所述的 “山羊角方” 是指该中药中确实是以山羊角入药 ( 例如，所。

40、述的羚羊清肺丸 ( 山羊角方 ) 是指该羚羊清肺丸中确实是以山羊角入药 ) ；所述的 “羚羊角方” 是指与相应的山羊角方的中药相比，差异主要在于其中是以羚羊角入药而非以山羊角入药，其它组分基本相同；所述羚羊清肺丸中并不含除山羊角之外的其它山羊组织成分； 0066 所述的 “豹骨方” 是指该中药中确实是以豹骨入药 ( 例如，所述的再造丸 ( 豹骨方 ) 是指该再造丸中确实是以豹骨入药 ) ；所述的 “塞隆骨方” 是指与相应的豹骨方的中药相比，差异主要在于其中是以塞隆骨替代豹骨入药，其它组分基本相同；所述再造丸中并不含有山羊或是羚羊组织成分。 0067 3、物种。

41、特异性引物及 PCR 反应条件说明书 CN 102424844 B 8 7/10 页 9 0068 (1) 山羊角特异性引物的设计： 0069 根据 NCBI 上提供的山羊线粒体基因组序列 (NC_005044)、赛加羚羊线粒体基因组序列部分序列 (CYTB ： AF064487) 以及相近物种 ( 藏羚羊 DQ191826 等 ) 线粒体基因组全序列，通过 DNAstar 在 cytb 区域设计通用引物。引物信息见表 1 所示，利用该引物对 SEQ ID Nos.7和8，对前述 “1、山羊角总DNA的提取” 过程中提取得到的纯化的DNA为模版，进行PCR 扩增 ( 反。

42、应体系为 15l，其中 10PCR 缓冲液 ( 商业化产品，内含 Tris-HCl pH8.5100mM、 KCl 500mM、 MgCl215mM)1.5l， dNTPs(2.5mM)1.5l，上下游引物 (10M) 各 0.5l， Taq DNA 聚合酶 (5U/l)0.3l， DNA 模板 (50ng/l)1l，无菌超纯水补至 15l。扩增条件： 95预变性 5min ； 95 30s， 55 30s， 72 30s， 40 个循环； 72延伸 10min)，扩增产物经 DNA 测序 ( 测序结果参见图 3)，提交 blastn(http:/blast.ncbi.nl。

43、m.nih.gov/Blast. cgi)在线比对，分析，获得山羊物种特异分子标记(SNP)，依据物种特异SNP特征，设计本发明的用于山羊物种检测的特异引物，引物设计结果参见图 4 所示，其中，上方序列为山羊序列，下方序列为羚羊序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。 0070 表 1 用于山羊 Cytb 区扩增的引物信息 0071 0072 (2) 参见图 4 所示，本发明所设计的山羊角特异性引物名称及序列如下： 0073 G1F/R ： 5 -ACAATAACAGCATTTTC-3 (SEQ ID NO ： 1)/ 0074 5 -ATAGACCTCGTCCGA。

44、TA-3 (SEQ ID NO ： 2) ； 0075 G2F/R ： 5 -ACAGCATTCATAGGCTATGTTT-3 (SEQ ID NO ： 3)/ 0076 5 -TTTCGTGGAGGAAGAGC-3 (SEQ ID NO ： 4) ； 0077 G3F/R ： 5 -CGGAGACCCAGACAACTATATC-3 (SEQ ID NO ： 5)/ 0078 5 -TGTGGAGGAAGGGTACA-3 (SEQ ID NO ： 6)。 0079 (3)PCR 反应体系及反应条件 0080 以前述 “2、羚羊清肺丸 ( 山羊角方 ) 中总 DNA 的提取” 中所提取的待测样。

45、品的 DNA 为模板，利用引物 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 分别进行 PCR 扩增。 0081 PCR 反应体系为 15l，其中 10PCR 缓冲液 (Tris-HCl pH8.5100mM、 KCl 500mM、 MgCl215mM)1.5l， dNTPs(2.5mM)1.5l，上下游引物 (10M) 各 0.5l， Taq DNA 聚合酶 (5U/l)0.3l， DNA 模板 (50ng/l)1l，无菌超纯水补至 15l。 0082 扩增条件： 95预变性5min ； 9530s，退火温度30。

46、s， 7230s， 40个循环； 72延伸 10min。 0083 各引物对退火温度参见下表， PCR 扩增所得片段经测序，所测长度及具体序列如下表所示：说明书 CN 102424844 B 9 8/10 页 10 0084 引物名称退火温度扩增片段长度 G1F/R 52 133bp(SEQ ID NO ： 9) G2F/R 50 232bp(SEQ ID NO ： 10) G3F/R 58 176bp(SEQ ID NO ： 11) 0085 G1 ： 0086 ACAATAACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGGCT。

47、GAATCATCCGATAC ATACACGCAAACGCAGCATCAATATTCTTTATCTGCCTATTCATACATATCGGACGAGGTCTAT(SEQ ID NO ： 9) 0087 G2 ： 0088 ACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTTTGAGGGGCAACAGTCATCACTAAT CTTCTTTCAGCAATCCCATATATTGGCACAAACCTAGTCGAATGAATCTGAGGGGGGTTCTCAGTAGACAAAGCCAC TCTCACCCGATTCTTCGCCTTCCACTTTATCCTCCCATTCAT。

48、CATCACAGCCCTCGCCATAGTCCACCTGCTCTTCC TCCACGAAA(SEQ ID NO ： 10) 0089 G3 ： 0090 CGGAGACCCAGACAACTATATCCCAGCAAATCCACTCAATACACCCCCTCACATTAAACCTGAGTGGTA TTTCCTATTTGCATACGCAATCCTACGATCAATCCCCAACAAACTAGGAGGAGTCCTAGCCCTAGTCCTCTCAATCC TAATCTTAGTACTTGTACCCTTCCTCCACA(SEQ ID NO ： 11) 0091 (4) 琼脂糖凝胶电泳检测 0092 配制 2。

49、琼脂糖凝胶，将 5l 上述 (3) 的 PCR 扩增产物和 1l 上样缓冲液 (0.25溴酚蓝、 40蔗糖 ) 混匀上样， 1TAE 为电泳缓冲液， 5V/cm 电泳 20 分钟，凝胶放入 1g/mlEB中染色20分钟后紫外灯下观察拍照。结果见图5(以一份样品实验结果为例，其余同 )，山羊物种特异性引物能从相应成药中扩增出目的片段。 0093 实施例 2 牛黄清心丸 ( 山羊角方 ) 中山羊角成分的鉴别 0094 选用 3 批次 (10 丸 / 批次 ) 同仁堂生产的牛黄清心丸成药 ( 山羊角方 )共二十九味药，其中山羊角成分约占 9 ( 质量百分比 ) 作为待测样品，提取总 DNA，并分别以所述的引物对 SEQ ID Nos.1 和 2、 SEQ ID Nos.3 和 4、以及 SEQ ID Nos.5 和 6 分别进行单重 PCR 扩增。待测样品总 DNA 提取过程以及 PCR 扩增及对扩增结果的分析过程同实施例 1。 0095 结果参见图5(以一份样品实验结果为例，其余同)，利用本发明的DNA提取方法以及所设计的山羊物种特异性引物能从相应成药中有效扩增出目的片段。 0096 图 5 中：泳道 1 代表以羚羊清肺丸成。

摘要
申请专利号：	CN201110438771.5	申请日：	20111223
公开号：	CN102424844B	公开日：	20130417
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/68,C12N15/11	主分类号：	C12Q1/68,C12N15/11
申请人：	北京同仁堂股份有限公司,北京同仁堂科技发展股份有限公司,北京中研同仁堂医药研发有限公司
发明人：	李志猛,曹梦,姚璐,彭鹏,张晓楠,张丽娟
地址：	100176 北京市北京经济技术开发区西环南路8号
优先权：	CN201110438771A
专利代理机构：	北京三友知识产权代理有限公司	代理人：	韩蕾
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内容摘要

本发明提供了一种检测混合物中山羊角成分的方法及所用引物，所述的方法主要包括：从待测混合物中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自：SEQ?ID?Nos.1和2、SEQ?ID?Nos.3和4、以及SEQ?ID?Nos.5和6中的一对、两对或三对引物；对扩增结果进行分析判断。本发明进一步提供了包含上述引物的检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒。本发明的引物具有较高的特异性和灵敏性。

权利要求书

1.一种检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括：从待测混合物中提取总DNA；以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增；所述特异性引物为选自：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一对、两对或三对引物；对上述扩增结果进行分析判断。 2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括如下步骤：待测混合物经煮沸法处理20～40分钟；加入CTAB提取缓冲液60℃～70℃消化2～4小时；用酚仿法抽提；加入异丙醇沉淀富集DNA；利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述PCR扩增反应条件如下：反应体系为15μl，其中10×PCR缓冲液1～5.5μl，2.5mM dNTPs0.5～1.8μl，10μM上下游引物各0.5～1.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.2～1.2μl，50ng/μl DNA模板0.8～3μl，无菌超纯水补至15μl；扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，35～40个循环；最后72℃延伸7～10min。 4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述SEQ ID Nos.1和2的退火温度为52℃，所述SEQ ID Nos.3和4的退火温度为50℃，所述SEQ ID Nos.5和6的退火温度为58℃。 5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述对上述扩增结果进行分析判断的过程包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物。 6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述待测混合物为需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂。 7.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括：将待测混合物样品的扩增结果与从山羊角中提取DNA进行PCR扩增的结果进行对照，分析判断所测混合物中是否存在山羊角成分。 8.根据权利要求1或7所述的方法，其中，以SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行PCR扩增，扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则所测混合物中存在山羊角成分。 9.用于实现权利要求1～8任一项所述检测混合物中山羊角成分的方法的引物，该引物为选自SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一对、两对或三对引物。 10.权利要求9所述的引物在检测混合物中是否存在山羊角成分中的应用。 11.根据权利要求10所述的应用，其中，所述待测混合物为需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂。 12.一种检测混合物中山羊角成分的试剂盒，该试剂盒包含权利要求9所述的引物。 13.根据权利要求12所述的试剂盒，该试剂盒还进一步包括PCR缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶。

说明书

技术领域

本发明涉及应用分子生物学技术检测混合物特别是药材中山羊角成分的方法，具体地涉及检测药材、或者以山羊角或替代品入药的中药制剂中山羊角成分的方法，以及该方法中所用到的特异性引物。

背景技术

山羊角为牛科动物青羊、背山羊的角，具有与羚羊角相似的镇痛和解热作用，可作为羚羊角的替代品，其资源丰富，有利于降低成本，保护珍稀动物。但目前对于山羊角的鉴别主要采用传统形态学方法，依赖鉴别人员经验，主观性高，因此需要一种能够准确、有效的鉴别方法。

另一方面，脊椎动物线粒体基因组大小为16kb左右，呈闭合环状结构，在细胞中呈多拷贝形式存在于线粒体中(依细胞类型不同而异)。动物线粒体基因在进化上保守，且遵循严格的母系遗传特性，因此被广泛用于起源进化分析和物种鉴定。

在含山羊角成分的混合物例如药材、或者以山羊角入药的中药制剂等的生产加工过程中，山羊角中的部分DNA通常能够保留于其中，因此，混合物中的山羊角成分可以从其携带的DNA检测中获得鉴定。

然而，在混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分鉴定的研究技术上，由于混合物中山羊角DNA含量很低，并且含有多种抑制PCR反应的成分，因此，如何能够有效提取其中的DNA是分子生物学技术鉴定山羊角成分的一个关键；同时，含山羊角的混合物特别是中药制剂中通常还具有较多的其它动植物物种，如何设计山羊物种特异性引物也成为鉴定技术的另一关键。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法，以准确、有效地鉴别混合物中是否含有山羊角成分。

本发明的另一目的在于提供一种用于分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中的特异性引物。

本发明的另一目的在于提供了一种用于分子生物学技术检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、或者以山羊角或其替代品入药的中药制剂中山羊角成分的试剂盒，其中包含本发明所述的引物。

为达上述目的，一方面，本发明提供了一种利用分子生物学技术检测混合物中山羊角成分的方法，该方法主要包括：

从待测混合物中提取总DNA；

以所提取的总DNA为模板，利用特异性引物进行聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增；

对上述扩增结果进行分析判断。

如前所述，通常，含山羊角的混合物特别是混合药材、或者以山羊角入药的中药制剂中，山羊角成分含量很低，并还含有较多的其它动植物物种，还可能含有多种抑制PCR 反应的成分，在此情况下，设计山羊物种特异性引物是本发明的分子生物学检测技术的关键之一。

根据本发明的具体实施方案，本案发明人从山羊角中提取了总DNA，根据NCBI中公布的山羊线粒体DNA与核DNA序列设计引物，经扩增、测序，提交blastn比对、分析等，设计了本发明的山羊特异性引物。所设计的山羊特异性引物为选自如下SEQ ID Nos.1和2(本发明中亦将该引物对命名为G1F/R)、SEQ ID Nos.3和4(本发明中亦将该引物对命名为G2F/R)、以及SEQ ID Nos.5和6(本发明中亦将该引物对命名为G3F/R) 中的一对、两对或三对引物：

G1F/R：5’-ACAATAACAGCATTTTC-3’(SEQ ID NO：1)/

5’-ATAGACCTCGTCCGATA-3’(SEQ ID NO：2)；

G2F/R：5’-ACAGCATTCATAGGCTATGTTT-3’(SEQ ID NO：3)/

5’-TTTCGTGGAGGAAGAGC-3’(SEQ ID NO：4)；

G3F/R：5’-CGGAGACCCAGACAACTATATC-3’(SEQ ID NO：5)/

5’-TGTGGAGGAAGGGTACA-3’(SEQ ID NO：6)。

如前所述，通常含山羊角的混合物特别是药材、或者以山羊角入药的中药制剂中山羊角DNA成分的含量是很低的，如何能够有效提取其中的DNA，是本发明检测山羊角成分技术的另一个关键。根据本发明的具体实施方案，本发明的方法中，所述从待测混合物中提取总DNA的过程包括以下步骤：

待测混合物经煮沸法处理20～40分钟；

加入CTAB提取缓冲液60℃～70℃消化2～4小时；

用酚仿法抽提；

加入异丙醇沉淀富集DNA；

利用PCR纯化试剂盒进行纯化，得到所提取的总DNA。

根据本发明的具体实施方案，本发明的上述方法特别适合于对以山羊角入药的药材混合物或中药制剂中山羊角总DNA进行提取，即使药材混合物或中药制剂中山羊角成分含量含量低至3wt％(除特别注明外，本发明中所述含量与比例均为重量含量与比例)，或是药材或中药制剂中含有其他多种动植物成分(例如，山羊角方或羚羊角方的羚羊清肺丸，含有二十四味药；牛黄清心丸，含有二十九味药；等)，也能有效提取其中的DNA。根据本发明的具体实施方案，上述从待测混合物中提取总DNA的过程中：

所述煮沸法处理待测混合物样品主要是破碎细胞，具体操作时可根据需要向待测混合物中加入适量的水(通常，每3～5g总固含量的待测样品加10ml水)，煮沸通常是可以在常压下进行(100℃左右)，煮沸时间20～40分钟，优选30分钟～40分钟。

所述向煮沸后的待测样品中加入CTAB提取缓冲液进行消化处理，主要是破坏混合物中的多糖多酚类物质。根据本发明的优选具体实施方案，所用CTAB提取缓冲液的组成为：3％CTAB，100mM Tris-HCl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，2.5M NaCl。最优选的消化处理条件为：等体积混合，65℃，3小时。

所述酚仿法抽提主要是去除混合物中蛋白质、色素等溶于有机物的杂质。酚仿法抽提的具体操作可以按照所属领域的常规操作进行。根据本发明的优选实施方案，本发明中所述酚仿法抽提的操作为：经CTAB缓冲液消化后的样品冷却至室温后加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，12000rpm离心20分钟，取上清；再加入等体积氯仿 /异戊醇(24∶1)，混匀，12000rpm离心20分钟，取上清。

本发明中，向上述经酚仿法抽提得到的上清中加入异丙醇主要是沉淀富集DNA。根据本发明的优选实施方案，具体操作为：加入等体积预冷的异丙醇，混匀，4℃12000rpm 离心20分钟，弃上清，沉淀用75％酒精洗涤。为便于后续纯化步骤，可将洗涤后的提取物用适量双蒸水溶解。

所述利用PCR纯化试剂盒进行纯化的步骤主要是去除DNA中残留的色素等水溶性杂质。PCR纯化试剂盒可以采用所属领域常用的商购产品，具体操作可以按照纯化试剂盒的说明书进行。

根据本发明的具体实施方案，当待测混合物中含有较多多糖类物质时，在提取总 DNA的过程中，在经酚仿法抽提得到的上清中，还可加入LiCl过夜处理，以去除残留多糖类物质，之后再加入异丙醇沉淀富集DNA。此外，对于利用PCR纯化试剂盒所纯化得到的总DNA，还可进行琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取情况。

在本发明的一具体实施方案中，所述的待测混合物为以山羊角或其替代品(例如黄羊角或其他物种伪品)入药的中药制剂或混合药材，其中除山羊角或其替代品外，还含有其他多种动植物成分，例如，羚羊清肺丸含有二十四味药，牛黄清心丸含有二十九味药等，本发明的方法是用于检测该中药制剂或混合药材中是否是真正以山羊角入药。在该具体实施方案中，为有效提取其中的总DNA，是按照以下操作进行：将待测混合物样品粉碎，加适量水(通常每3～5g总固含量的样品加10ml水)，常压煮沸30分钟～40分钟；向煮沸处理后的待测样品中加入等体积CTAB提取缓冲液(3％CTAB，100mM Tris-HCl pH 8.0，20mMEDTApH 8.0，2.5MNaCl)，65℃消化处理3小时；之后冷却至室温，加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，混匀，12000rpm离心20分钟，取上清；再加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，12000rpm离心20分钟，取上清；加入1/4 体积10M LiCl，混合后4℃过夜；然后样品在4℃12000rpm离心30分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃12000rpm离心20分钟，弃上清；用75％酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解，溶解的DNA经PCR纯化试剂盒纯化，得到提取的总DNA (具体可采用康为世纪PCR产物纯化试剂盒50T，货号CW0521，在其说明书指导的操作基础上，可适当增加去杂质缓冲液洗涤体积及次数，以达到更好的纯化效果)。纯化后的DNA可用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测提取情况。按照本发明的该提取方法，即使待测混合物中山羊角成分含量低至3％左右，也能有效提取其DNA，用于后续PCR扩增。

根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂等中山羊角成分的方法中，所述PCR扩增反应条件如下：

反应体系为15μl，其中10×PCR缓冲液1～5.5μl，dNTPs(2.5mM)0.5～1.8μl，上下游引物(10μM)各0.5～1.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2～1.2μl，DNA模板(50ng/μl) 0.8～3μl，无菌超纯水补至15μl；

扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，48～68℃退火30s，72℃延伸30s，共 35～40个循环；最后72℃延伸7～10min。

本发明中，是以所述的引物对分别以所提取的DNA为模板进行PCR扩增，即，单重PCR扩增。所述PCR扩增反应条件中，优选的退火温度为50℃～58℃。最优选地，其中，所述引物对SEQ ID Nos.1和2的最佳退火温度为52℃，所述引物对SEQ ID Nos.3 和4的最佳退火温度为50℃，所述引物对SEQ ID Nos.5和6的最佳退火温度为58℃。

根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中，所述对扩增结果进行分析判断主要是进行定性分析，定性分析方法可以是本领域普通技术人员已知的，例如，该分析过程可包括用凝胶电泳显示所述扩增的产物，根据是否扩增出目的片段，以定性检测待测混合物中是否存在相应的山羊角成分。

本发明中，所述的待测混合物可以是指含有或可能含有山羊角成分的任何混合物，包括药材、中药制剂等。具体地，当需要鉴别某一药材是否为山羊角时，或者需要鉴别某一中药制剂是以山羊角或是其他物种的替代品入药时，本发明的检测方法特别适用。可以理解，本发明的方法所适用的待测混合物中并不含有山羊物种除山羊角外的其它组织成分，或者已通过其它方法排除含有山羊的其它组织成分，即，本发明的方法是特别针对以山羊角入药或以山羊角的替代品入药的中药制剂进行检测，判别其中是否含有山羊角成分。

根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法还包括：

将待测混合物样品的扩增结果与从山羊角中提取DNA进行PCR扩增的结果进行对照，分析判断所测混合物中是否存在山羊角成分。从山羊角中提取DNA的具体操作可以按照生物技术领域从单一物种中提取DNA的常规操作进行。

根据本发明的具体实施方案，本发明的分子生物学技术检测混合物特别是药材、中药制剂中山羊角成分的方法中，是以引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行PCR扩增，如果扩增出一个、二个或三个相应的目的片段，则初步判断所测混合物中存在山羊角成分。特别是以引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行PCR扩增，均能扩增相应的目的片段，则所测混合物中存在山羊角成分。

另一方面，本发明还提供了用于实现本发明所述检测混合物中山羊角成分的方法的引物，该引物包括选自：SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5 和6中的一对、两对或三对引物。

本发明的上述引物对，在检测混合物特别是需要鉴别是否为山羊角的药材、以山羊角或替代品入药的中药制剂中是否存在山羊角成分中具有应用前景，能够特异性检测待测混合物中是否含有山羊角成分，并且，检测灵敏度高，当混合物中包含的山羊角成分含量为3％(质量百分比)时，也能有效提取并特异性地检测出来。

另一方面，本发明还提供了一种检测混合物中山羊角成分的试剂盒，该试剂盒中包含本发明所述的引物，优选还可进一步包括相应的PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶等。具体地，其中所述的引物是本发明所述的引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6中的一对、两对或三对引物。

有益效果

综上所述，本发明从含山羊角成分的混合物中提取了总DNA，设计了山羊物种特异性引物，分别以所述山羊物种特异性引物PCR扩增含有山羊角或伪品成分的混合物 DNA。本发明所设计的扩增引物以及扩增方法具有较高的特异性，且检测灵敏度高，可单独作为一种快速检测方法应用于对含有山羊角或伪品成分的混合物特别是药材、中药制剂进行检测，准确地定性检测混合物中山羊角成分的存在情况。

附图说明

图1显示按照本发明实施例1的方法从不同药材中提取总DNA的琼脂糖电泳检测结果。图中，M为100bp DNALadder，泳道1：山羊角粉，泳道2：羚羊角粉，泳道3：塞隆骨，泳道4：豹骨。

图2显示从一些半成品或成品中药制剂中提取总DNA的琼脂糖电泳检测结果。其中，泳道1：同仁堂再造丸半成药(豹骨方)；泳道2：同仁堂再造丸成药(豹骨方)；泳道3：同仁堂再造丸半成药(塞隆骨方)；泳道4：同仁堂再造丸成药(塞隆骨方)；泳道5：羚羊清肺丸半成药(羚羊角方)；泳道6：羚羊清肺丸成药(羚羊角方)；泳道 7：羚羊清肺丸半成药(山羊角方)；泳道8：羚羊清肺丸成药(山羊角方)；M为DL2000。

图3显示利用通用引物对SEQ ID Nos.7和8以从山羊角中提取的DNA为模板进行 PCR扩增的产物测序结果。图中，上方序列为山羊(Capra hircus)序列，下方序列是以赛加羚羊(Saiga tatarica)序列做对照。

图4显示依据山羊物种特异分子标记(SNP)特征设计用于山羊物种检测的特异引物结果。其中，上方序列为山羊序列，下方序列为羚羊序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。

图5为用本发明的山羊物种特异性引物PCR扩增不同混合物样品DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。其中，泳道1为羚羊清肺丸成药(羚羊角方)，泳道2为牛黄清心丸成药(羚羊角方)，泳道3为羚羊清肺丸成药(山羊角方)，泳道4为牛黄清心丸成药 (山羊角方)，泳道5为羚羊角药材，泳道6为山羊角药材，泳道7为空白对照。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。

实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件；

实施例中所用到的各种化学试剂均可商购获得，各试剂除标注外，均购自北京化学试剂公司；

所用引物委托Invitrogen公司合成。

实施例1羚羊清肺丸(山羊角方)中山羊角成分检测

1、山羊角总DNA的提取

该提取步骤可以按照所属领域的常规操作进行。本实施例的具体操作如下：山羊角经液氮研磨成粉状，取200μg加入1ml裂解液B(10mM Tris-HCl pH8.0，0.1M EDTA pH8.0，0.5％SDS，200μg/ml蛋白酶K，0.4M DTT)，55℃消化过夜，消化样品100℃ 煮10min，冰浴5min，12000rpm离心15min取上清进行酚仿抽提。之后用2倍体积无水乙醇沉淀DNA，再用75％乙醇洗沉淀两遍，适量双蒸水溶解。样品DNA经PCR纯化试剂盒(康为世纪PCR产物纯化试剂盒50T，货号CW0521，具体操作按照说明书进行) 纯化，得DNA提取样品。经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，结果请参见图1所示。

另，按照上述方法以羚羊角药材为原料提取得到DNA。此外还分别以塞隆骨、豹骨为原料，按照传统方法，均分别提取得到DNA。各原料所提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图1所示。

2、羚羊清肺丸(山羊角方)中总DNA的提取

选用3批次(10丸/批次)同仁堂羚羊清肺丸成药(山羊角方)为待测样品。每份样品取所述羚羊清肺丸(山羊角方)成药(二十四味)4g(约1丸)，其中山羊角成分约占3％(质量百分比)。将药丸切碎，用10ml双蒸水充分溶解后，100℃水浴30分钟，冰浴10分钟冷却，4℃12000rpm离心20分钟，取上清；加入等体积(10ml)CTAB提取缓冲液(3％CTAB，100mM Tris-HCl pH 8.0，20mM EDTA pH 8.0，2.5M NaCl)， 65℃水浴3小时；样品冷却至室温后加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，缓慢颠倒混匀，12000rpm离心20分钟，取上清；加入等体积氯仿/异戊醇(24∶1)，缓慢颠倒混匀，12000rpm离心20分钟，取上清；加入1/4体积10M LiCl，缓慢颠倒混合后4℃过夜；样品4℃12000rpm离心30分钟，取上清加入等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀后4℃ 12000rpm离心20分钟，弃上清；用75％酒精洗涤沉淀三遍后取适量双蒸水溶解。溶解的DNA经PCR纯化试剂盒(康为世纪PCR产物纯化试剂盒50T，货号CW0521，按照说明书的操作进行，并增加去杂质缓冲液洗涤体积至350μl、洗涤次数增为2次纯化，得到纯化的DNA。纯化的DNA经0.7％琼脂糖凝胶电泳检测提取情况，结果请参见图2(3 批次共30例样品提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况)。

另，分别以同仁堂羚羊清肺丸半成药(山羊角方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸半成药(羚羊角方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、羚羊清肺丸成药(羚羊角方)(3批次，10丸/批次，每丸为一例样品，约 4g)、同仁堂再造丸半成药(豹骨方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、同仁堂再造丸成药(豹骨方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、同仁堂再造丸半成药(塞隆骨方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)、同仁堂再造丸成药(塞隆骨方)(3批次，5丸/批次，每丸为一例样品，约4g)为待测样品，按照上述方法，均分别提取得到了总DNA，各种待测样品的琼脂糖凝胶电泳检测请参见图 2所示(同样的，由于每种样品的多例提取结果电泳图基本类似，图中仅示意性给出其中一例情况)。

本发明中，所述的“山羊角方”是指该中药中确实是以山羊角入药(例如，所述的羚羊清肺丸(山羊角方)是指该羚羊清肺丸中确实是以山羊角入药)；所述的“羚羊角方”是指与相应的山羊角方的中药相比，差异主要在于其中是以羚羊角入药而非以山羊角入药，其它组分基本相同；所述羚羊清肺丸中并不含除山羊角之外的其它山羊组织成分；

所述的“豹骨方”是指该中药中确实是以豹骨入药(例如，所述的再造丸(豹骨方) 是指该再造丸中确实是以豹骨入药)；所述的“塞隆骨方”是指与相应的豹骨方的中药相比，差异主要在于其中是以塞隆骨替代豹骨入药，其它组分基本相同；所述再造丸中并不含有山羊或是羚羊组织成分。

3、物种特异性引物及PCR反应条件

(1)山羊角特异性引物的设计：

根据NCBI上提供的山羊线粒体基因组序列(NC_005044)、赛加羚羊线粒体基因组序列部分序列(CYTB：AF064487)以及相近物种(藏羚羊DQ191826等)线粒体基因组全序列，通过DNAstar在cytb区域设计通用引物。引物信息见表1所示，利用该引物对SEQ ID Nos.7和8，对前述“1、山羊角总DNA的提取”过程中提取得到的纯化的 DNA为模版，进行PCR扩增(反应体系为15μl，其中10×PCR缓冲液(商业化产品，内含Tris-HCl pH8.5100mM、KCl 500mM、MgCl215mM)1.5μl，dNTPs(2.5mM)1.5μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，DNA模板(50ng/μl) 1μl，无菌超纯水补至15μl。扩增条件：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s， 40个循环；72℃延伸10min)，扩增产物经DNA测序(测序结果参见图3)，提交blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线比对，分析，获得山羊物种特异分子标记 (SNP)，依据物种特异SNP特征，设计本发明的用于山羊物种检测的特异引物，引物设计结果参见图4所示，其中，上方序列为山羊序列，下方序列为羚羊序列，方框内所标示部分为所设计的引物部分。

表1用于山羊Cytb区扩增的引物信息

(2)参见图4所示，本发明所设计的山羊角特异性引物名称及序列如下：

G1F/R：5’-ACAATAACAGCATTTTC-3’(SEQ ID NO：1)/

5’-ATAGACCTCGTCCGATA-3’(SEQ ID NO：2)；

G2F/R：5’-ACAGCATTCATAGGCTATGTTT-3’(SEQ ID NO：3)/

5’-TTTCGTGGAGGAAGAGC-3’(SEQ ID NO：4)；

G3F/R：5’-CGGAGACCCAGACAACTATATC-3’(SEQ ID NO：5)/

5’-TGTGGAGGAAGGGTACA-3’(SEQ ID NO：6)。

(3)PCR反应体系及反应条件

以前述“2、羚羊清肺丸(山羊角方)中总DNA的提取”中所提取的待测样品的DNA 为模板，利用引物SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行PCR扩增。

PCR反应体系为15μl，其中10×PCR缓冲液(Tris-HCl pH8.5100mM、KCl 500mM、 MgCl215mM)1.5μl，dNTPs(2.5mM)1.5μl，上下游引物(10μM)各0.5μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.3μl，DNA模板(50ng/μl)1μl，无菌超纯水补至15μl。

扩增条件：95℃预变性5min；95℃30s，退火温度30s，72℃30s，40个循环；72℃ 延伸10min。

各引物对退火温度参见下表，PCR扩增所得片段经测序，所测长度及具体序列如下表所示：

引物名称退火温度扩增片段长度 G1F/R 52℃ 133bp(SEQ ID NO：9) G2F/R 50℃ 232bp(SEQ ID NO：10) G3F/R 58℃ 176bp(SEQ ID NO：11)

G1：

ACAATAACAGCATTTTCCTCTGTAACTCACATTTGTCGAGATGTAAATTATGG CTGAATCATCCGATACATACACGCAAACGCAGCATCAATATTCTTTATCTGCCTAT TCATACATATCGGACGAGGTCTAT(SEQ ID NO：9)

G2：

ACAGCATTCATAGGCTATGTTTTACCATGAGGACAAATATCATTTTGAGGGGC AACAGTCATCACTAATCTTCTTTCAGCAATCCCATATATTGGCACAAACCTAGTCG AATGAATCTGAGGGGGGTTCTCAGTAGACAAAGCCACTCTCACCCGATTCTTCGCC TTCCACTTTATCCTCCCATTCATCATCACAGCCCTCGCCATAGTCCACCTGCTCTTC CTCCACGAAA(SEQ ID NO：10)

G3：

CGGAGACCCAGACAACTATATCCCAGCAAATCCACTCAATACACCCCCTCAC ATTAAACCTGAGTGGTATTTCCTATTTGCATACGCAATCCTACGATCAATCCCCAA CAAACTAGGAGGAGTCCTAGCCCTAGTCCTCTCAATCCTAATCTTAGTACTTGTAC CCTTCCTCCACA(SEQ ID NO：11)

(4)琼脂糖凝胶电泳检测

配制2％琼脂糖凝胶，将5μl上述(3)的PCR扩增产物和1μl上样缓冲液(0.25％溴酚蓝、40％蔗糖)混匀上样，1×TAE为电泳缓冲液，5V/cm电泳20分钟，凝胶放入1μg/ml EB中染色20分钟后紫外灯下观察拍照。结果见图5(以一份样品实验结果为例，其余同)，山羊物种特异性引物能从相应成药中扩增出目的片段。

实施例2牛黄清心丸(山羊角方)中山羊角成分的鉴别

选用3批次(10丸/批次)同仁堂生产的牛黄清心丸成药(山羊角方)——共二十九味药，其中山羊角成分约占9％(质量百分比)作为待测样品，提取总DNA，并分别以所述的引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行单重PCR扩增。待测样品总DNA提取过程以及PCR扩增及对扩增结果的分析过程同实施例1。

结果参见图5(以一份样品实验结果为例，其余同)，利用本发明的DNA提取方法以及所设计的山羊物种特异性引物能从相应成药中有效扩增出目的片段。

图5中：泳道1代表以羚羊清肺丸成药(羚羊角方)为待测样品的检测结果；

泳道2代表以牛黄清心丸成药(羚羊角方)为待测样品的检测结果；

泳道3代表实施例1的羚羊清肺丸成药(山羊角方)的检测结果；

泳道4代表实施例2的牛黄清心丸(山羊角方)的检测结果；

泳道5代表以按照实施例1的方法从羚羊角药材中提取的总DNA为模板、利用本发明的引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行单重PCR扩增的扩增产物检测结果；

泳道6代表以实施例1中从山羊角药材中提取的总DNA为模板、利用本发明的引物对SEQ ID Nos.1和2、SEQ ID Nos.3和4、以及SEQ ID Nos.5和6分别进行单重PCR 扩增的扩增产物检测结果；

泳道7为空白对照。

如图5所示，本发明设计的山羊物种特异性引物能够从山羊角方中有效扩增出目的片段，但不会从替代品方(伪品方)中扩增出结果，同时山羊角阳性对照、阴性对照以及空白对照结果表明扩增结果真实可信。

本发明中，利用实施例1的方法，分别以不同批次的同仁堂羚羊清肺丸半成药(山羊角方)、羚羊清肺丸半成药(羚羊角方)、羚羊清肺丸成药(羚羊角方)、牛黄清心丸半成药(山羊角方)、牛黄清心丸成药(羚羊角方)、牛黄清心丸成药(羚羊角方)、同仁堂再造丸半成药(豹骨方)、同仁堂再造丸成药(豹骨方)、同仁堂再造丸半成药 (塞隆骨方)、同仁堂再造丸成药(塞隆骨方)为待测样品，分别提取总DNA，并以本发明的特异性引物进行扩增，定性鉴定样品中是否存在羚羊角成分。部分检测结果记录于下表，可表明本发明检测方法的正确性。