取代苯基罗丹明噁二唑类化合物制备方法与用途.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102627637 A (43)申请公布日 2012.08.08 CN 102627637 A *CN102627637A* (21)申请号 201210091291.0 (22)申请日 2012.03.31 C07D 413/10(2006.01) C09K 11/06(2006.01) C09B 57/00(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 天津师范大学 地址 300387 天津市西青区宾水西道 393 号 (72)发明人 史学芳 马媛 柴璐 侯志爱 郭萍 胡灵敏 (74)专利代理机构 。

2、天津市杰盈专利代理有限公 司 12207 代理人 朱红星 (54) 发明名称 取代苯基罗丹明噁二唑类化合物制备方法与 用途 (57) 摘要 本发明公开了取代苯基罗丹明噁二唑化合物 的合成与用途， 包括 ： 噁二唑化合物 I、 化合物 II 以及化合物 III， 它们都是罗丹明 B 染料的衍生 物， 不同的是这三种化合物噁二唑环的另一侧连 着不同的 4- 取代苯基。化合物 I、 II 以及 III 在 水溶液中表现出强烈的荧光， 并且具有很好的耐 光性， 具有细胞荧光染色剂的用途。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (。

3、12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 3 页 1/2 页 2 1. 具有结构式 I 的化合物 ： 其中 R 分别为氢原子、 氯原子或硝基。 2. 权利要求 1 所述的结构式 U 化合物， 其中典型的化合物为 ： R 为氢原子时， 2- 苯基 -5- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -1,3,4- 噁二唑化合物 I ； R 为氯原子时， 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对氯苯基 -1,3,4- 噁二唑化 合物 II ； R 为硝基时， 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对硝基苯基 -1,3,4- 噁二唑化 合物。

4、 III ： 。 3. 权利要求 1 或 2 所述化合物的制备方法， 其特征在于按如下的步骤进行 ： （1） 将罗丹明 B 的乙醇溶液与 85% 的水合肼反应制备罗丹明 B 酰肼 ； 其中罗丹明 B 与 85% 的水合肼的摩尔比 1 : 1.55 ； 权 利 要 求 书 CN 102627637 A 2 2/2 页 3 （2） 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明 B 酰肼与苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 加热回流， 反 应， 经柱色谱分离， 得到目标化合物I， 其中罗丹明B酰肼 : 苯甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比为 1 : 1 : 0.55 ； （3） 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明 B 酰肼与对氯。

5、苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 加热回 流， 反应， 经柱色谱分离， 得到目标化合物II， 其中罗丹明B酰肼 : 对氯苯甲酸 : 三氯氧磷 的摩尔比 1 : 1 : 0.55 ； （4） 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明 B 酰肼与对硝基苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 加热回 流， 反应， 经柱色谱分离， 得到目标化合物 III， 其中罗丹明 B 酰肼 : 对硝基苯甲酸 : 三氯 氧磷的摩尔比 1 : 1 : 0.55。 4. 权利要求 1 所述化合物在制备作为细胞荧光染料方面的应用。 5. 权利要求 2 所述化合物 I、 II 和 III 在作为细胞荧光染料方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 1。

6、02627637 A 3 1/7 页 4 取代苯基罗丹明噁二唑类化合物制备方法与用途 0001 本发明是在天津师范大学开发基金 （基金号为 52XK1102） 的资助下进行的。 技术领域 0002 本明发属于化学传感技术应用领域， 涉及 2- 苯基 -5- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲 酰 ) 基 -1,3,4- 噁二唑 I、 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对氯苯基 -1,3,4- 噁 二唑 II 以及 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对硝基苯基 -1,3,4- 噁二唑 III 的 制备方法， 及其作为细胞染料的生物染色剂的用途。 背景。

7、技术 0003 光学探针作为分析化学、 有机化学、 光物理化学和超分子化学等多学科交叉的重 要研究领域， 在生化检测、 环境监控、 疾病诊断和药物筛选等领域发挥着重要的作用。 0004 随着 21 世纪生命科学的迅猛发展和相关技术的发展与普及， 荧光染料分子探针 以其实现细胞内活性小分子 “可视化” 检测并它们在生物体内的动态变化进行实时监控的 本领在生物技术方面被广泛的应用。 0005 罗丹明类化合物因其较大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率， 更受到了广泛关 注， 发展了很多基于罗丹明的化学传感器。它们能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和 组织内各种结构进行定性、 定量和定位的测量， 功能强。

8、大， 可操作性强， 特别是在活细胞研 究方面具有巨大的的优势。 0006 我们利用罗丹明结构上的特点， 运用直接合成的方法在母体上引入了噁二唑的杂 环， 设计并合成了新型的罗丹明类生物荧光探针。由于 1,3,4- 噁二唑本身缺电子的特性， 达到了改变罗丹明类荧光染料分子探针在生物亲和性、 水溶性和热稳定性方面的特点。 0007 如目标化合物结构式所示， 化合物 I、 II 和 III 均是未见报道的新化合物。 发明内容 0008 本发明的第一个目的是提供了具有通式 U 的化合物及其活性成分化合物 I、 化合 物 II 以及化合物 III 的制备方法。 0009 本发明的第二个目的是提供了包含化。

9、合物 I、 化合物 II 和化合物 III 用于活体细 胞荧光染料方面的用途。 0010 为实现上述目的发明公开了如下的技术内容 ： 具有结构式 U 的化合物 ： 说 明 书 CN 102627637 A 4 2/7 页 5 其中 R 分别为氢原子、 氯原子或硝基。 0011 典型的化合物为 ： 具有结构式 I 的 2- 苯基 -5- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -1,3,4- 噁二唑化合 物 ： 具有结构式 II 的 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对氯苯基 -1,3,4- 噁二唑 化合物 ： 具有结构式 III 的 2- 罗丹明 B-9 -(2 -。

10、 苯甲酰 ) 基 -5- 对硝基苯基 -1,3,4- 噁 二唑化合物 ： 说 明 书 CN 102627637 A 5 3/7 页 6 本发明进一步公开了这三个化合物的制备方法， 它是按如下的步骤进行 ： 化合物 I 的合成步骤 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将罗丹明类化合物用乙醇溶解， 然后将 85% 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合 体系中， 滴加完毕后将混合物加热强回流 3-10 小时， 反应完成后， 冷却至室温， 减压除去溶 剂， 抽滤， 蒸馏水洗涤产物 3-5 次。 0012 （2） 目标化合物 I 的合成 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明酰肼与苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 。

11、加热回流， 反应完成 后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯甲烷萃取， 无水硫酸镁干燥， 经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 10020 : 1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 I。 0013 化合物 II 的合成步骤 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将罗丹明类化合物用乙醇溶解， 然后将 85% 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合 体系中， 滴加完毕后将混合物加热强回流 3-10 小时， 反应完成后， 冷却至室温， 减压除去溶 剂， 抽滤， 蒸馏水洗涤产物 3-5 次。 0014 （2） 目标化合物 II 的合成 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明酰肼与对氯苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 加热回流， 。

12、反应 完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯甲烷萃取， 无水硫酸镁干燥， 经体积比为二氯甲 烷 / 甲醇 10020:1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 II。 0015 化合物 III 的合成步骤 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将罗丹明类化合物用乙醇溶解， 然后将 85% 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合 体系中， 滴加完毕后将混合物加热强回流 3-10 小时， 反应完成后， 冷却至室温， 减压除去溶 剂， 抽滤， 蒸馏水洗涤产物 3-5 次。 0016 （2） 目标化合物 III 的合成 将上述步骤 （1） 制备的罗丹明酰肼与对硝基苯甲酸混合溶于三氯氧磷中， 加热回流， 反 应。

13、完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯甲烷萃取， 无水硫酸镁干燥， 经体积比为二氯 甲烷 / 甲醇 10020:1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 III。 0017 本发明进一步公开了化合物 I、 II 和 III 在作为细胞荧光染料方面的应用。 0018 本发明所设计的 I、 II、 III 化合物的分子结构特征在于 ： 此类不对称的噁二唑化 合物的一侧都连有罗丹明 B 取代， 另一侧连有不同的芳香取代基。本发明利用原料罗丹明 说 明 书 CN 102627637 A 6 4/7 页 7 酰肼中的活性部分内酰肼结构与不同取代的芳香酸反应， 同时利用三氯氧磷使其脱水环 合， 在结构中引入一。

14、个新的噁二唑杂环。 新化合物具有良好的水溶性， 并且有对活体细胞进 行荧光染色的用途。 0019 本发明公开的化合物 I、 化合物 II 以及化合物 III 荧光染料探针化合物与现有技 术相比所具有的积极效果为 ： （1） 优化了罗丹明 B 类类荧光染料性能， 阻断了类似的染料中普遍存在的因其内酯与 羧酸构造互变导致的荧光猝灭现象的发生 ； （2） 在化合物 I、 II、 III 中增加了缺电子的噁二唑杂环， 增加了罗丹明母体结构的电子 传输性能 ； （3） 在原来染料的大 共轭体系中合成了噁二唑杂环， 利于在染色时与客体产生弱相 互作用、 提高染色与荧光检测效果， 并利于荧光或裸眼识别与检测。

15、 ； （4） 本专利中， 在染料分子中苯环的 4 位， 分别是氢原子、 氯原子、 硝基取代， 原子及取 代基的种类不同， 调整了染料分子之间的若相互作用力、 电子效应及光谱特征， 以利于生物 染色标记的不同需要。 0020 附图说明 ： 图 1. 化合物 U 的结构式 ； 图 2 化合物 I 的结构式 ； 图 3 化合物 II 的结构式 ； 图 4. 化合物 III 的结构式 ； 图 5 化合物 I 荧光光谱图 （激发波长 530nm） ； 图 6. 化合物 II 荧光光谱图 （激发波长 530nm） ； 图 7. 化合物 III 荧光光谱图 （激发波长 530nm） ； 图 8. 化合物 I。

16、II 的细胞荧光染色成像实验一 ： 活细胞组荧光染色成像 ； 图 9. 化合物 III 的细胞荧光染色成像实验二 ： 固定细胞组荧光染色成像。 具体实施方式 0021 为了更充分的解释本发明的实施， 提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅 仅是解释、 而不是限制本发明的范围。 为简单和清楚的目的， 以下论述中对公知的技术方法 的描述、 溶液的配制过程进行不再赘述。其中罗丹明 B、 水合肼、 苯甲酸、 对氯苯甲酸和对硝 基苯甲酸均为试剂公司直接购买。其他有机溶剂经无水处理。 0022 实施例 1. 2- 苯基 -5- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ：。

17、 化合物 I 的合成通过以下主要反应制备 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 mL 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 0.63 mL 85 % （10.4mmol） 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热强回流 3 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 3 次。得产物 3.0 g， 产率 ： 64.2%。 说 明。

18、 书 CN 102627637 A 7 5/7 页 8 0023 （2） 目标化合物 I 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 mmol） 和 0.54 g 苯甲酸 （4.4 mmol） 混合溶于 2 mL 三氯氧磷中， 加热回流 6 小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯甲烷萃 取， 无水硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 = 100 : 1, 柱 色谱分离， 得到目标化合物(0.36 g, 收率15%)。 1H NMR: (CDCl 3, 400 MHz) 1.322(12H, t), 2.403(3H, s), 3.652。

19、(8H, d, J=6.8Hz), 6.846(2H, s), 6.924(2H, d, J=9.2Hz), 7.160(2H, d, J=9.6Hz), 7.448(3H, m), 7.535(1H, t), 7.854(2H, d, J=8.0Hz), 7.870(2H, t,), 8.400(1H, t)。质谱理论值 ：m/z M+, 543.3, 测定值 , 543.7。 0024 实施例 2. 2- 苯基 -5- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 m。

20、L 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 8 mL 85%（138.6 mmol） 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热回流 10 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 5 次。得产物 4.25 g， 产率 ： 89.7%。 0025 （2） 目标化合物 I 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 mmol） 和 0.54 g 苯甲酸 （4.4 mmol）。

21、 混合溶 于 5 mL 三氯氧磷中， 加热回流 10 小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯甲 烷萃取， 硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 20 : 1, 柱色谱 分离， 得到目标化合物 I 为 0.93 g, 收率 39%。 0026 实施例 3. 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对氯苯基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 mL 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 0.63 mL 85 % （10.4mmol）。

22、 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热强回流 3 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 3 次。得产物 3.05 g， 产率 ： 64.3%。 0027 （2） 目标化合物 II 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 mmol） 和 0.69 g 对氯苯甲酸 （4.4 mmol） 混 合溶于 2 mL 三氯氧磷中， 加热回流 6 小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰。

23、水中， 二 氯甲烷萃取， 无水硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 =100 : 1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 (0.37 g, 收率 14.7%)。1H NMR: (CDCl3, 400 MHz) 1.317(12H, t), 3.632(8H, q), 6.832(2H, s), 6.941(2H, d, J=9.2Hz), 7.147(2H, d, J=9.6Hz), 7.456(2H, d, J=8.4Hz), 7.475(1H, s), 7.829(2H, d, J=8.8Hz), 7.869(2H, t), 8.387(1H, t)。质谱理论值 。

24、：m/z M+, 577.2, 测定值 , 577.5。 0028 实施例 4. 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对氯苯基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ： 说 明 书 CN 102627637 A 8 6/7 页 9 （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 mL 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 8 mL 85%（138.6 mmol） 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热回流 10 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶。

25、剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 5 次。得产物 4.3 g， 产率 ： 90.5%。 0029 （2） 目标化合物 II 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 mmol） 和 0.69 g 对氯苯甲酸 （4.4 mmol） 混合 溶于 5 mL 三氯氧磷中， 加热回流 10 小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二氯 甲烷萃取， 硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇 = 20 : 1, 柱 色谱分离， 得到目标化合物 II 为 0.99 。

26、g, 收率 39%。 0030 实施例 5. 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对硝基苯基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 mL 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 0.63 mL 85 % （10.4mmol） 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热强回流 3 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到。

27、 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 3 次。得产物 3.2 g， 产率 ： 68%。 0031 （2） 目标化合物 III 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 mmol） 和 0.73 g 对硝基苯甲酸 （4.4 mmol） 混合溶于2 mL三氯氧磷中， 加热回流6小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二 氯甲烷萃取， 无水硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 = 100 : 1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 (0.38 g, 收率 14.6%)。1H NMR: (CD3Cl, 400 MHz) 1.327(12H, t)。

28、, 3.660(8H, d, J=5.2Hz), 6.836(2H, s), 6.989(2H, d, J=9.6Hz), 7.165(2H, d, J=9.2Hz), 7.492(1H, t), 7.909(2H, t), 8.152(2H, d, J=6.8Hz), 8.357(2H, d, J=8.0Hz), 8.473(1H, d, J=6.0Hz)。 质谱理论值 ：m/z M+, 588.3, 测定值, 588.5。 0032 实施例 6. 2- 罗丹明 B-9 -(2 - 苯甲酰 ) 基 -5- 对硝基苯基 -1,3,4- 噁二唑的合成 ： （1） 罗丹明 B 酰肼的合成 将 5 。

29、g（10.4 mmol） 的罗丹明 B 用 100 mL 的乙醇溶解， 放入 250 mL 的烧瓶中， 然后将 8 mL 85%（138.6 mmol） 的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中， 滴加完毕后将 混合物加热回流 10 小时， 当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕， 冷却至室温， 减 压除去溶剂， 将 1M HCl 加入蒸干的混合物中， 然后将 1M NaOH 调节混合物 pH 到 9， 抽滤， 15 mL 蒸馏水洗涤产物 5 次。得产物 4.2 g， 产率 ： 88.5%。 0033 （2） 目标化合物 III 的合成 将上述步骤 （1） 中合成的酰肼 2 g（4.4 m。

30、mol） 和 0.73 g 对硝基苯甲酸 （4.4 mmol） 混 合溶于 5 mL 三氯氧磷中， 加热回流 10 小时， 反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中， 二 说 明 书 CN 102627637 A 9 7/7 页 10 氯甲烷萃取， 硫酸镁干燥， 减压除去溶剂， 所得粗品经体积比为二氯甲烷 / 甲醇 = 20 : 1, 柱色谱分离， 得到目标化合物 III 为 1.0 g, 收率 38.9%。 0034 实施例 7. 化合物 III 的细胞染色及其荧光成像实验 ： 细胞染色及其染色荧光成像实验材料与方法 : 1.1 细胞及其培养的方法 ： （a） 试验的细胞 ： 选用 NIH-3T。

31、3 细胞 （小鼠成纤维细胞， 为南开大学生命科学学院生物 活体材料实验室培养） ； （b） 细胞的培养 ： DMEM（高糖） 培养基 ； 10 % 胎牛血清 ； （c） 细胞铺板过程 （24 孔） ： 取生长状态良好的 NIH-3T3 细胞， 制成 5x104 / mL 细胞悬 液 ； 24孔板每孔加入1.0 mL 细胞悬液。 37 oC， 5% CO2条件下培养48小时， 分别进行活细胞 组、 固定后细胞组的细胞染色和荧光成像观察。 0035 1.2 试验用荧光染料样品化合物 III 溶液配制 ： 依标准方法， 化合物III用1%的醋酸溶液配制成4.0 mg/mL溶液作为试验用样品溶液。 0。

32、036 1.3. 细胞荧光染色成像 ： （一） 活细胞组实验 ： （1） 吸取经培养 48 小时后的各孔培养基 ； （2） 加入 200L/ 孔试验用化合物 III 样品溶液， 在室温下静置 15 分钟 ； （3） 吸取样品溶液， 用 1% 醋酸溶液洗 5 遍 ； （4） 使用荧光倒置显微镜观察、 照像， 荧光激发光波长 570 nm。 0037 （二） 固定后细胞组 ： （1） 吸取经培养 48 小时后的各孔培养基 ； （2） 于每孔加入 10% 的醋酸溶液 0.5 mL 进行固定 ； （3） 在 4 oC 条件下静置 1 小时 ； （4） 使用 PBS 溶液洗 5 遍 ； （5） 加入 2。

33、00L/ 孔试验用化合物 I 样品溶液， 于室温下静置 15 分钟 ； （6） 吸取样品溶液， 使用 1% 醋酸溶液洗 5 遍 ； （7） 在荧光倒置显微镜下观察、 照像， 荧光激发光波长为 570 nm。 0038 2. 化合物 III 的细胞染色与荧光成像实验结果与分析 ： 2.1 荧光成像试验结果显示样品化合物 III 具有红色荧光成像效果 ； 参见转化为灰度 模式的荧光成像照片附图 5 ； 2.2 荧光染色结果表明， 固定后细胞组荧光染色成像效果优于活细胞组的染色效果， 参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图 6。 0039 3. 化合物I、 化合物II、 化合物III具有类似的荧光光谱， 对光谱性质影响的主要 因素来源于罗丹明和噁二唑。因此， 化合物 III 的荧光染色认为可以代表化合物 I 和化合 物 II。 说 明 书 CN 102627637 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102627637 A 11 2/3 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102627637 A 12 3/3 页 13 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102627637 A 13 。