本申请是2002年4月5日提交的申请号为02807711.3(PCT/GB02/01479)，发明名称为“改进的基因表达”申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及一种多核苷酸，这种多核苷酸包括一个遍在染色质开放元件(UCOE)和一个选择标记。当可操作地连接到可表达核酸上，并将其置于侧翼时，这种元件组合提供高的且可再现的基因表达水平。本发明也涉及到包含多核苷酸序列的载体，包含该载体的宿主细胞，以及多核苷酸，载体或宿主细胞在治疗上的应用，或涉及细胞培养中的蛋白表达的应用。
发明背景
高等真核生物染色质结构的当今模型假设，基因是以“结构域”形式被组织的(Dillon，N.& Grosveld，F.，染色质结构域作为真核基因功能的潜在单元(Chromatin domain as potential units of eukaryotic gene function，Curr.Opin.Genet.Dev.4，260-264(1994)；Higgs，D.R.LCR开放染色质结构域吗？(Do LCRs open chromatindomains？)Cell，95，299-302(1998))。可以想象，染色质区域既以一种凝聚的，“密闭的”，转录沉默的状态存在，也以一种解凝聚，“开放的”和具转录活性的构型存在。开放的染色质结构的确立特征在于DNaseⅠ敏感性增加，DNA甲基化不足和组蛋白超乙酰化作用，它被认为是基因表达开始的前提。
染色质区域的开放和密闭状态可以通过转基因的行为反映出来，这些转基因随机地整合到宿主细胞基因组中。完全相同的构造当整合进小鼠基因组的不同位点时，会产生不同模式的组织特异和发育期特异的表达(Palmiter，R.D.& Brinster，R.L.Ann.Ref.Genet.20，465-499(1986)；Allen，N.D等，Nature 333，852-855(1988)；Bonnerot，C.，Grimber，G.，Briand，P.& Nicolas，J.F.Proc Natl.Acad.Sci.USA 87：6331-6335(1990))。
给定转基因小鼠组织中的花斑表达模式，已知是位置效应花斑(PEV)，也可以频繁地被观察到(Kioussis，D.& Festenstein，R.Curr.Opin.Genet.Dev 7，614-619(1997))。当外源基因整合进体外培养的哺乳动物细胞的染色体时，许多整合事件会导致转基因的快速沉默，而其它的则会在表达水平上产生很大的变化(Pikaart，M.J.，Recillas-Targa，F & Felsenfield，G.，Genes Dev.12，2852-2862(1998)；Fussenegger，M.，Bailey，J.E.，Hauser，H & Mueller，P.P.Trends Biotech，17，35-42(1999)。这些位置效应使得转基因表达无效，这会牵连到基础研究和生物技术应用。
基因结构的染色质结构域模型表明，能够确立和保持具转录活性的开放染色质结构的基因控制元件应该和基因组活性区域相联系。
基因座控制区(LCR)是一类具长范围染色质重塑能力的转录调节元件。在转基因小鼠中，LCR根据它们的能力在功能上定义，所述能力是给予顺式连接的基因，尤其是单拷贝转基因定点整合独立的，转基因拷贝数依赖的生理表达水平，(Fraser，P & Grosveld，F.Curr.Opin.Cell Biol.，10，361-365(1998)；Li，Q，Harju，S & Peterson，K.P.Trends Genet.15：403-408(1999)。关键是这种表达是组织特异性的。LCR能够阻断异染色质的扩散，预防PEV(Kioussis，D & Festenstein，R.Curr.Opin.Genet.Dev.7，614-619(1997))，并且是由一系列DNaseⅠ超敏感位点(HS)组成，这些超敏感位点位于LCR所调节基因的5’或3’端(Li，Q.，Harju，S & Peterson，K.P.Trends Genet.15：403-408(1999))。
LCR看起来包括两个单独的，尽管并不是必须独立的成分。首先是“开放染色质结构域”的确立，其次是给予转基因拷贝数依赖性表达显性转录激活能力(Fraser，P.& Grosveld，F.Curr.Opin.Cell Biol.10，361-365(1998)。LCR发挥功能的分子机制现在仍然是一个争论点(Higgs，D.R.Cell，95，299-302(1998)；Bulger，M.& Groudine，M.Genes Dev.13，2465-2477(1999)；Grosveld，F.Curr.Opin.Genet.Dev.9.152-157(1999)；Bender，M.A.，Bulger，M.，Close，J & Groudine，M.，Mol Cell 5，387-393(2000)。
培养哺乳动物细胞系产生高水平的治疗用蛋白质产品，产生了是一个主要的正在发展的工业。染色质位置效应使得它是一种困难、耗时和昂贵的过程。制造这么一种哺乳动物“细胞工厂”最常用的方法依赖基因扩增，而基因扩增通过药物抗性基因(例如，DHFR，谷氨酰胺合酶(Kaufman RJ.Methods Enzymol 185，537-566(1990))和严谨选择性压力保持的组合来诱导。使用包含来自高表达基因结构域的LCR的载体，并利用源自合适组织的细胞能极大地简化这个过程，从而产生很大比例的表现出稳定高表达水平的克隆细胞系(Needham M，Gooding C，Hudson K，Antoniou M，Grosfeld F和Hollis M.Nucleic Acids Res 20，997-1003(1992)；Needham M，Egerton M，Millest A，Evans S，Popplewell M，Cerillo G，Mcpheat J，Monk A，Jack A，Johnstone D和Hollis M.Protein Expr Purif6，124-131(1995)。
然而，LCR的组织特异性，尽管在某些情况下有用，但在许多应用方面也是一个主要的限制，例如，对需要表达的组织LCR是未知的情况，或需要在许多或全部组织中表达的情况。。
我们在审专利申请PCT/GB99/02357(WO 00/05393)，US09/358082，GB 0022995.5和US 60/252,048，在这里一并引作参考，描述了在自然染色体的情况下负责确立开放染色质结构的元件，，所述开放染色质结构跨过一个专门由遍在表达的看家基因组成的基因座。这些元件并不是源自LCR，而且包括延伸的无甲基化CpG岛。我们用遍在染色质开放元件(UCOE)这个术语来描述这类元件。
在哺乳动物DNA中，二核苷酸CpG岛可以被DNA甲基转移酶识别，这种酶能使胞嘧啶甲基化成5-甲基胞嘧啶。然而，5-甲基胞嘧啶不稳定，并能转变成胸腺嘧啶。结果，CpG二核苷酸出现的频率远低于人们偶然所预期的频率。然而在基因组DNA的一些部分，CpG出现的频率确实更接近于期望的频率，而这些序列已知为“CpG岛”。在这里使用的“CpG岛”被定义为DNA序列，至少长200bp，其GC含量至少为50％，可观察/期望的CpG含量比至少为0.6(即CpG二核苷酸含量是偶然所预计的至少60％)(Gardiner-Green M和Frommer M.J Mol Biol 196，261-282(1987)；Rice P，Longden I和Bleasby A，Trends Genet 16，276-277(2000)。
无甲基化的CpG岛是本领域中众所周知的(Bird等(1985)Cell 40：91-99；Tazi和Bird(1990)Cell 60：909-920)，并被定义为CpG岛，在CpG岛中，大量比例的胞嘧啶残基没被甲基化，并通常延伸到两个在空间上紧连的趋异转录基因的5’端。据报道，这些DNA区域在整个发育期中、在所有组织中都维持甲基化不足(Wise和Pravtcheva(1999)Genomics 60：258-271)。它们经常和遍在表达基因相偶连，同时估计40％的基因表现出组织限制的表达图行(Antequera，F.& Bird，A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1195-1199(1993)；Gross，S.H.& Bird，A.P.Curr.Opin.Genet.Dev.5，309-314(1995)，并且已知定位于活性染色质的区域(Taze，J.& Bird，A.Cell 60，909-920(1990)。
一个“延伸”的无甲基化CpG岛是一个无甲基化的CpG岛，这个CpG岛延伸跨过包括一个以上转录起始位点的区域，和/或延伸了大约300bp，优选超过500bp。延伸的无甲基化CpG岛边界的功能性限定可以通过对这段区域采用PCR，结合使用限制性核酸内切酶，内切酶能在识别序列消化(剪切)DNA，并对出现的任何CpG残基的甲基化状态敏感。HpaⅡ就是这么一种内切酶，它能识别和消化CCGG位点，这个位点经常在CpG岛中被发现，但只有中央的CG残基没有甲基化。因此，假如DNA没有被甲基化，由于HpaⅡ的消化，用HpaⅡ消化的DNA和包含HpaⅡ位点的区域进行PCR将得不到扩增产物。PCR只有DNA甲基化后才能产生扩增产物。因此，在无甲基化区域之外，HpaⅡ将不会消化DNA，一个PCR扩增产物将会被观察到，由此去限定“延伸的无甲基化CpG岛”的边界。
我们已经证明(WO 00/05393)跨越无甲基化CpG岛的区域可以给予可再现的生理水平的基因表达，所述区域包括双重趋异转录的启动子，所述启动子来自人TATA结合蛋白(TBP)/蛋白体成分-B1(PSMB1)和不均一核核糖核蛋白A2/B1(hnRNPA2)/异染色质蛋白1Hsγ(HP1Hsγ)的基因座位，以及证明随着转基因整合到着丝粒异染色质，它们能够防止花斑表达模式和正常发生的沉默。
在这里使用的术语“可再现的表达”意思是指，不管它的染色质环境如何，优选地不管本发明的多核苷酸所在的细胞类型和组织类型如何，本发明的多核苷酸将指导可表达基因基本上以基本上相同的表达水平进行表达。本领域的那些专业人员将会意识到可操作连接的可表达基因的表达水平基本上相同是可以得到的，不管所要求保护的多核苷酸的染色质环境如何，以及优选不管细胞类型如何，前提是这种细胞能激活基因表达。
我们已经表明(WO 00/05393)，和活性转录启动子相连的无甲基化CpG岛具有重塑染色质的能力，因此它们被称为是看家基因座位上开放区域确立和保持的主要决定因素。
随着转基因表达水平和稳定性的改良，UCOE使生产基因传递事件的比例上升。这具有重要的研究和生物技术应用，包括转基因动物和培养细胞中重组蛋白产品的生成。我们已经显示(WO 00/05393)了UCOE在CMV-EGFP报告构建体表达上的有益作用以及UCOE与分泌的药用上有价值的蛋白质促红细胞生成素UCOE的有益作用。UCOE的特点也表明它在基因治疗上的用处，以及它的有效性经常被可生产基因传递事件的低频和表达水平和持续时间的不足所限制(Verma，I.M & Somia，N.Nature 389：239-242(1997)。
尽管意义重大以及应用范围广泛，但仍需要进一步优化表达水平。有必要进一步去提高单独利用UCOE获得的表达水平，特别是在体内基因治疗领域以及为了体外生产重组蛋白。
令人惊奇的是，在表达的核酸3’端存在可选择元件的情况下，可操作地连接到5’UCOE的核酸的表达会进一步提高，以便可表达核酸序列被5’UCOE和3’选择标记置于侧翼。
一个可选择元件在载体中执行一个以上功能，如提供选择标记以及增加可操作连接基因的表达，允许构建更紧凑和更有效的表达载体。
Mei，Kothary和Wall(Mei，Q，Kothary R和Wall L.Exp Cell Research 260，304-312(2000)公开了一种载体，这种载体包括一个可操作连接到LCR上的可表达基因(β-珠蛋白)和一个pgk/嘌呤霉素抗性元件。然而这个工作教导我们，正是可表达基因，LCR和tk/新霉素抗性元件的组合在给基因表达施加位置效应中是重要的，以pgk/嘌呤霉素抗性元件用作阴性对照。这篇论文没有指出从pgkⅠ嘌呤霉素抗性基因使用中获得的有益效果。这篇论文并没有公开包含延伸的无甲基化CpG岛(或UCOE)，可表达基因以及pgk/嘌呤霉素抗性元件的构建体，因为这些构建体包含LCR。同样，这篇论文也没公开可操作地连接到启动子上的可表达基因，而可表达基因并不是天然就连接在这种启动子上的，也没公开可操作地连接到pgk/嘌呤霉素抗性元件上的表达基因，因为在每种情况下，β-珠蛋白基因都是在其内源启动子控制下表达的。
Altelt等人比较了新霉素和嘌呤霉素抗性基因对真核表达载体中顺式连接基因的影响(Artelt P，Grannemann R，Stocking C，Friel J，Bartsch J和Hauser H Gene 99，249-254(1991)。他们的结论认为，新霉素抗性基因对连接基因可能具有沉默作用，但“赋予白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素抗性的基因并不影响邻近的启动子”。因此，这篇论文并没有如本申请所公开的那样，公开或提示抗性基因位置或空间使用的重要性。
我们在审专利申请PCT/GB99/02357(WO 00/05393)，US 09/358082，GB 0022995.5和US 60/252,048公开多核苷酸和载体，所述多核苷酸和载体包括可操作地连接到可表达核酸上的延伸的无甲基化CpG岛和抗生素抗性基因。然而在公开的实施例中，抗生素抗性基因并不和可表达核酸相邻和位于其3’端。这么一种相邻选择标记的惊奇贡献同样没有被公开或暗示。
发明陈述
本发明公开在选择标记的存在下，延伸的非甲基化CpG岛(UCOE)正调节可操作连接的核酸序列的表达的影响可被进一步增强，条件是所述的选择标记位于可表达核酸序列的3’端并和其相邻。
在这里使用的术语5’和3’针对可表达核酸序列的有义链。因此，所述序列的5’端对应转录起始，转录朝3’方向前进。
在这里使用的术语“可操作连接”指的是本发明多核苷酸中，元件之间的可操作性关系。“可操作连接”是一个术语，对本领域专业人员而言众所周知，它描述的是顺式作用DNA序列的功能关系。确切的结构关系可能相关或不相关，而对于不同类型的元件，它们是不同的。对于启动子，“可操作连接”暗指和它驱动的可读框的5’端基本上相邻(通常小于100bp)的位置在延伸的无甲基化CpG岛的情况下，似乎染色质结构的区域效应负责增加基因表达的水平和一致性。在实施例中，包含延伸的无甲基化CpG岛的元件紧靠着可表达基因的5’端放置。然而“可操作连接”包含放在他处的可能性，只要清晰的功能效果可以得到证明。
具体而言，可表达基因的侧翼5’端带有UCOE，而3’端是选择标记，导致表达水平增加大约2倍。在一些情况下，这种表达比单独使用UCOE获得的表达能增加5倍多。
根据本发明，提供了一种分离的多核苷酸，和单独使用可操作连接的UCOE或延伸的无甲基化CpG岛获得的表达相比，这种多核苷酸使得获得的可操作连接的基因的表达水平上升。
分离的多核苷酸包括：一个延伸的无甲基化岛，被聚腺苷酸化信号终止的可表达核酸和可操作连接到启动上的选择标记，其中，CpG岛和选择标记均可操作地连接到可表达核酸上，这些成分按可表达核酸有义链的5’→3’方向依次放置：延伸的无甲基化CpG岛，可表达核酸，选择标记，而可表达核酸3’端的聚腺苷酸化信号在选择标记近端的2000bp以内。
这里使用的“近端”指的是距可表达核酸3’端最近的选择标记基因的末端(包括启动子)，正如被聚腺苷酸化信号标记。可以想象，选择标记可以是任何一个方向，以便相对于可表达核酸的近端既可以在选择标记的5’启动子末端，也可以在选择标记的3’启动子末端，即转录的终止末端，采用5’端和3’端是根据选择标记的有义链确定的。
优选地，选择标记的转录起始位点位于距可表达核酸3’端1500bp以内，正如被可表达核酸的聚腺苷酸化信号所标记。更优选的是位于3’端1000bp以内，最优选的则位于3’端500bp以内。
在本发明的一个方面，可选择元件是一种抗生素抗性基因。优选地，它是一种从链霉菌种中获得的抗生素抗性基因。更优选地，所述抗生素抗性基因可操作地连接到磷酸甘油酸激酶(pgk)基因的启动子上。最优选地，可选择元件是鼠pgk基因的启动子(Adra，CN，Boer PH和McBurney，MW.Gene 60，65-74(1987)。或者，它也可能是另一种哺乳动物pgk的启动子。
在一个优选的实施例中，抗生素抗性基因是来自链霉菌种的嘌呤霉素抗性基因。最优选地，它是来自白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因(Vara JA，Portela A，Ortin J，Jimenez A.Nucleic Acids Res 14，4617-4624(1986)(SEQ ID NO：5)。
或者，抗生素抗性基因是来自白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因的修饰形式。优选地，这个基因通过操作密码子选择而被修饰，为了在哺乳动物宿主细胞中表达细菌基因，以一种常用方式来修饰细菌基因。这样的密码子修饰并没改变编码的氨基酸序列，其结果表达出来的酶和野生型嘌呤霉素N-乙酰基转移酶相比并没有发生改变。最优选地，修饰基因的序列如图14所示(SEQ ID NO：3)。
或者，抗生素抗性基因是衍生自链霉菌种中的新霉素抗性基因。优选地，它是来自弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸转移酶基因(Thompson CJ和Gray GS.Proc Natl Acad Sci USA 80，5190-5197(1983)(SEQ ID NO：4)。
在一个可选择的实施方案中，抗生素抗性基因是潮霉素抗性基因。优选地，这是一个来自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的潮霉素转移酶基因(SEQ ID NO：6)。
在另一可选择的实施方案中，抗生素抗性基因是博来霉素抗性基因。优选地，这是一个来自轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的博来霉素结合蛋白。或者，它是来自轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的博来霉素N-乙酰基转移酶。
在另一个实施方案中，抗生素抗性基因是一个杀稻瘟素抗性基因。优选地，它是来自轮枝链霉菌(Streptomyces verticillus)的杀稻瘟素S-乙酰基转移酶基因。
本发明的另一方面，抗生素抗性基因并不是从链霉菌种中获得的。在一个优选的实施方案中，它是一个来自大肠杆菌(Escherichia coli)的编码氨基环多醇磷酸转移酶的潮霉素抗性基因(SEQ ID N0：7)。
在另一个优选的实施方案中，它是一个原始来自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)转座子Tn5的新霉素磷酸转移酶基因(SEQ ID NO：8)。
在本发明的一个可选择的方面，选择标记并不是抗生素抗性基因。可替代的选择机制涉及使用一些编码胸苷酸合酶，胸腺嘧啶核苷激酶或二氢叶酸还原酶的基因。这样的选择机制在本领域的技术人员中是众所周知的。在一种缺乏甲硫氨酸的培养基中，编码谷氨酰胺合成酶的基因可用作在缺乏内源性谷氨酰胺合成酶的细胞中或在利用抑制剂如methionine sulphoxamine已使它失活的情况下的选择工具(Kaufman RJ，异源基因在哺乳动物细胞中的选择和共扩增(Selection and amplification of heterologous genes in mammalian cells)，Methods Enzymol 185，537-566(1990)。
另一方面，可采用一种筛选标记。例如，编码荧光蛋白，如水母(Aequoria victoria)绿色荧光蛋白(GFP)或它的增强型变体(EGFP)的基因可以用作选择标记。包含本发明多核苷酸的转染子，其中选择标记编码GFP，通过本领域众所周知的方法，根据FACS上荧光的亮度可以加以分类。使用本发明的多核苷酸，并和带选择标记的可表达核酸构建体进行比较，所述选择标记位于UCOE的5’端或3’端，但远离转基因(可表达核酸)，，高水平的转基因表达发现可用于可比较的亮度水平。因此，选择最亮的细胞将允许选择具最高转基因表达水平的细胞。
在本发明的一个方面，延伸的无甲基化CpG岛包含一个跨越人类hnRNP A2基因的16kb DNA片段，该片段5’端和3’端分别有5kb和1.5kb的侧翼序列。优选地，延伸的无甲基化CpG岛包含一个跨越人hnRNP A2基因的8kb DNA片段(WO 00/05393)。
或者，公开的多核苷酸的延伸的无甲基化CpG岛是一种包含人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域或其片段的“人工UCOE”，如在我们在审专利申请GB 0022995.5和US 60/252,048中所公开。优选地，该片段大小在100bp-3.0kb，而且跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域或其片段。优选地，人工UCOE也包含人PDCD2 CpG岛/启动子区域或其片段。更优选地，人PDCD2 CpG岛/启动子区域包括一个大小在100bp-3.0kb的片段。进一步优选地，延伸的无甲基化CpG岛包含一个大小为100bp-3.0kb、跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的DNA片段，此外也包括一个大小为100bp-3.0kb、跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域的DNA片段。
最优选的是，本发明实施方案的要求保护的多核苷酸包括一种人工UCOE，所述人工UCOE包括一个跨越人β-肌动蛋白CpG岛/启动子区域的2.0kb DNA片段和一个跨越人PDCD2 CpG岛/启动子区域的1.8kb DNA片段。
此外也提供一个载体，这种载体包含前述实施方案中任一所述的多核苷酸。这种载体既可以是游离型载体，也可以是整合型载体。根据其目的用途，游离型载体可能是所需的，因为它们能自主复制，而且不必要整合就可以保持。这种游离型载体描述在WO 98/07876中。非复制和非整合型载体也是优选的。
此外还提供一种载体，当其结构线性化并被整合进染色体时，用于传递多核苷酸，所述多核苷酸包括一个延伸的无甲基化CpG岛，一个被聚腺苷酸化信号终止的可表达核酸以及一个可操作地连接到启动子上的选择标记，其中CpG岛和选择标记均可操作地连接到可表达核酸上，这些成分按可表达核酸有义链的5’-3’方向依次放置：延伸的无甲基化CpG岛，可表达核酸，选择标记，而可表达核酸3’端的聚腺苷酸化信号则位于选择标记近端2000bp以内。
优选的载体是质粒。或者，载体也可以是病毒，如腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒，痘苗病毒，慢病毒或其他反转录病毒。
优选地，所述载体是适合真核基因表达的表达载体。通过举例而非限制方式，通常所述适应包括提供介导细胞/组织特异性表达的转录控制序列(启动子序列)。启动子和增强子是本领域众所周知的术语，它们包括下列仅通过举例而非限制方式提供的特征。启动子是5’端的顺式作用调节序列，它直接与转录起始位点连接。启动子元件包括所谓的TATA框和RNA聚合酶起始选择(RIS)序列，它们的功能是选择转录起始位点。这些序列也结合多肽，所述多肽的作用尤其有助于RNA聚合酶的转录起始选择。
增强子元件是顺式作用的核酸序列，通常发现于基因的5’端转录起始位点(增强子也能在基因序列的3’端发现，甚至发现位于内含子序列中，因此它们位置是独立的)。增强子的功能是增强它所连接的基因的转录速率。增强子活性对已显示特异性结合增强子元件的反式作用转录因子(多肽)产生反应。转录因子的结合/活性对许多环境刺激反应，通过举例而非限制方式，这些环境刺激包括中间代谢物(如葡萄糖)，环境效应物(如热)(参见真核转录因子(Eukaryotic Transcription Factors)，David S Latchman，Academic Press Ltd，San Diego)。
适应也包括提供选择标记和自主复制序列，它们均有助于所述载体在真核细胞或原核宿主中的保持。在真核细胞中自动维持的载体被称作游离型载体。其它有助于载体编码基因的表达的适应包括提供转录终止/聚腺苷酸化序列。此外也包括提供内部核糖体进入位点(IRES)，IRES的功能是使以双顺反子或多顺反子表达盒排列的载体编码基因的表达最大化。这些适应在本领域是众所周知的。一般来说，关于表达载体构建和重组DNA技术的文献已出版了很多。请参见Sambrook等(1989)，分子克隆：实验室手册(Molecule Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，NY及其中的参考文献；Marston，F(1987)DNA克隆技术：实用方法(DNA Cloning Techniques：A Practical Approach)，第三卷，IRI出版社，英国牛津；DNA克隆(DNA Cloning)；FM Ausubel等，当代分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
在本发明优选的方法中，所述载体编码一种分泌信号，从而所述多肽拥有分泌信号，以有助于所述多肽的纯化。
或者，其他优选的实施方案进一步包括精制，以有利于表达的重组蛋白纯化，如亲和标记物或表位或酶剪切位点。
优选地，可表达核酸是一种治疗用核酸。
或者，可表达核酸编码一种用于在体外细胞培养系统中表达的重组蛋白。
或者，可表达基因编码非多肽产物，如RNA。这种RNA可以是反义RNA，它能在转录后水平上抑制特定基因的表达，或可具有酶学(核酶)或其它功能，如核糖体RNA。
一个优选的实施方案是一种载体，它包括：一个延伸的无甲基化CpG岛，一个被聚腺苷酸化信号终止的可表达核酸，一个可操作性连接到启动子上的选择标记。其中，CpG岛和选择标记均可操作地连接在可表达核酸上，这些成分按可表达核酸有义链的5’-3’方向依次放置：延伸的无甲基化CpG岛，可表达核酸，选择标记，而可表达核酸3’端的聚腺苷酸化信号则位于选择标记近端2000bp以内。优选地，可表达核酸3’端的聚腺苷酸信号在选择标记近端的1500bp以内。更优选的是1000bp以内，最优选的是500bp。
一个优选的实施方案是一种载体，它包括：一个延伸的无甲基化CpG岛，一个多克隆位点，一个来在链霉菌种的抗生素抗性基因，其中CpG岛和选择标记可操作地连接在多克隆位点上，这些成分按可表达核酸有义链的5’-3’方向依次放置：延伸的无甲基化CpG岛，多克隆位点，选择标记，而多克隆位点则位于选择标记近端2000bp以内。
更优选的是多克隆位点进一步可操作地连接到启动子上。进一步优选地，启动子选自CMV，EF-1α，RSV LTR或HIV2LTR或衍生其中的序列的组合。更优选的启动子是CMV立即/早期启动子。最优选的是鼠CMV立即/早期启动子。在一个优选的实施方案中，载体包括CMV启动子，多克隆位点，聚腺苷酸序列以及在合适控制元件下编码选择标记的基因。
一个载体的优选实施方案包括图10所示序列中第1-10551位的核苷酸(SEQ ID NO：1)。最优选的实施方案是载体CET710。
或者，该载体包含图10所示序列中第1-13545位的核苷酸，而优选的载体是CET720(SEQ ID NO：2)。
载体进一步优选的实施方案是：
CET740，在CET740中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被来自弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)的氨基糖苷磷酸转移酶基因所取代(如图15所示，SEQ ID NO：4)。在CET740多克隆位点插入具有可表达核酸序列的载体也是优选的，如CET741。
CET760，在CET760中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被来自大肠杆菌(Escherichia coli)的氨基环多醇磷酸转移酶基因所取代(如图17所示，SEQ ID NO：7)。在CET760多克隆位点插入具有可表达核酸序列的载体也是优选的，如CET761。
CET780，在CET780中，CET720的嘌呤霉素抗性基因被来自白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶的修饰形式所取代(如图14所示，SEQ ID NO：3)。在CET780多克隆位点插入具有可表达核酸序列的载体也是优选的，如CET781。
CET820，在CET820中，为了驱动其中插入的可表达核酸序列的表达，可操作地连接到多克隆位点上的人IE CMV启动子已经被鼠IECMV启动子所取代。在CET820多克隆位点插入具有可表达核酸序列的载体也是优选的，如CET821。
CET823，在CET823中，包含一个跨越人hnRNP A2基因的8kbDNA片段的延伸的无甲基化CpG岛被包含一个跨越鼠hnRNP A2基因的8kb DNA片段的延伸的无甲基化CpG岛所取代(如图19所示序列显示，SEQ ID NO：15)。在CET823多克隆位点插入具有可表达核酸序列的载体也是优选的，如CET824。
还提供用已公开的载体中的任何实施方案转染的宿主细胞。
或者，所述的多核苷酸，载体或宿主细胞可以用于细胞培养系统中去获得所需基因产物的表达。合适的细胞培养系统是本领域众所周知的，并充分公开在那些本领域技术人员所熟知的文献中。本发明提供生产多核苷酸的方法，其包括：
1)根据本发明，提供一种用核酸分子转化/转染的细胞；
2)在有助于制造所述多肽的条件下生长所述细胞；并且
3)从所述细胞内或其生长环境中纯化所述的多肽。
在本发明一个优选的实施方案中，所述核酸分子是本发明的载体。
本发明也提供用于治疗的多核苷酸，载体或宿主细胞。
本发明还提供多核苷酸，载体或宿主细胞在制备用于基因治疗的组合物中的应用。
本发明也提供一种治疗方法，其包括给需要这种疗法的病人施用药物有效量的本发明的多核苷酸，载体或宿主细胞。优选的是病人正患有一种可用基因治疗的疾病。
本发明也提供一种药物组合物，其包含多核苷酸和/或载体和/或宿主细胞，它们任选与可药用的载体或稀释剂混合，用于治疗疾病或提供具有利蛋白或功能的特定组织的细胞。
本发明的多核苷酸，载体或宿主细胞或药物组合物可以通过一种途径施用，该途径包括全身性肌肉，静脉内，气溶胶，口服(固体或液体形式)，局部，眼睛，直肠，腹膜内和/或鞘内和局部直接注射。
当然，确切的剂量将必须由每个临床医生针对各个病人分别确定，而这又必须由目的基因表达蛋白的确切状态以及用靶向治疗的组织类型来确定。
剂量也将依赖于疾病指征和用药途径。剂量数将依赖疾病以及来自临床试验的功效数据。
根据本发明用于有效基因治疗的多核苷酸或载体DNA的传递量优选在50ng-1000u g载体DNA/kg体重，而更优选的范围则是在1-100μg载体DNA/kg体重。
根据本发明，尽管优选的是给哺乳动物施用多核苷酸，载体或宿主细胞用于体内细胞吸收，但也可利用离体方法，从而从动物中取出细胞，用多核苷酸或载体转导后，再重新植入动物。例如，通过离体方法可以使多核苷酸或载体进入肝，首先从动物中取出肝细胞，在体外转导肝细胞并把转导的肝细胞重新植入动物中(例如，如Chowdhury等人对兔子所述，Science 254：1802-1805，1991，或如Wilson在人中所述，Hum.Gene.Ther.3：179-222，1992)。这样的方法对于在循环系统或淋巴系统中各种不同的细胞群，如红细胞，T细胞，B细胞和造血干细胞的传递也是有效的。
本发明的另一方面是提供了一种分离的多核苷酸，它包含一个可操作地连接在表达基因上的第一种启动子，但这种启动子并不是天然就可操作地连接在表达基因上，也包括一个选择标记，它也是可操作地连接的并位于表达基因的3’端，包含pgk启动子和一个嘌呤霉素抗性基因。利用这种多核苷酸获得所述可表达基因的可再现表达在至少两种组织或细胞类型中得到提供。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种非人的转基因动物，它包括一种人工导入的延伸的无甲基化CpG岛元件和人工导入的选择标记，其中两种元件均是可操作地连接在一个位于它们之间的可表达基因上，而且其中所述可表达基因的可再现表达至少发生两种组织或细胞类型中。制造转基因小鼠的方法(Gordon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：7380(1980)；Harbers等，Nature 293：540(1981)；Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：6376(1981)，绵羊，猪，小鸡(参见Hammer等，Nature 315：680(1985))等是本领域众所周知的，并且根据本发明考虑使用。
这种包含本发明的多核苷酸的转基因动物也可以用作长期生产目的蛋白。
本发明也提供了利用本发明的多核苷酸，载体或宿主细胞用来确定基因治疗功效的哺乳动物模型。这种哺乳动物模型包括一种转基因动物，所述转基因动物的细胞含有本发明的载体。这样的动物测试允许在人的临床试验之前进行。
本发明也提供了本发明的多核苷酸在生产转基因植物上的应用。
产量提高以及对疾病，害虫，干旱或盐的抗性增加的转基因植物的生成是本领域技术人员众所周知的。对于细胞中含有本发明的多核苷酸的转基因植物，本发明也提供。一些或全部包括人工UCOE的细胞可能起源于植物。
本发明也涉及本发明多核苷酸在功能基因组学应用中的用途。功能基因组学主要涉及到对在特定类型的细胞或疾病状态中特异性表达的基因进行鉴定，现在提供了数以千计的用于药物发现或基因治疗目的的潜在目的的新基因序列。使用开发新疗法的信息的主要问题在于怎样决定这些基因的功能。为了决定这些基因序列的功能，本发明的多肽可用于众多功能基因学应用中。本发明的功能基因组学应用包括，但并不局限于：
1)使用本发明的多核苷酸获得基因序列反义形式的持续表达或核酶敲除文库，由此确定使基因失活对细胞表型的影响。
2)使用本发明的多核苷酸制备基因序列的表达文库，以便传递进细胞会导致可靠的，可再现的，持续的基因序列表达。所得的细胞表达基因序列，可以用在许多方法中发挥确定和药物发现的功能。例如，提高针对基因产物的中和抗体，快速纯化基因自身的蛋白产物用于结构、功能或药物筛选研究；或用于以细胞为基础的药物筛选。
3)在一些涉及小鼠胚胎干(ES)细胞和转基因小鼠的方法中使用本发明的多核苷酸。功能基因组学中的一个最有力的方法涉及在构建的小鼠ES细胞中随机插入基因，而构建的小鼠ES细胞只允许在插入表达的基因后进行药物筛选，而且这种细胞也能轻易地被拯救出来用于测序(G.Hicks等，Nature Genetics，16，338-334)。在含新序列基因中带有敲除突变的转基因小鼠能轻易地制备以探测它们的功能。目前，这种技术在小鼠ES细胞中充分表达的小鼠基因中有10％运转良好。把本发明的多核苷酸整合进整合型载体中能使这种技术延伸到用来鉴定所有在小鼠中表达的基因。
发明详述
本发明将只通过实施例方式并参照附图来进行描述，在所述附图中：
图1所示为“空”载体CET200.1，210，710和720的图谱。在多克隆位点插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因分别产生CET230，711和721。所有的载体都包含一个CMV启动子，从CMV启动子开始插入基因被表达。然而，在CET210中(以及它的EGFP-表达衍生物，CET230)，尽管质粒中的插入基因会被UCOE和pgk/嘌呤酶素抗性元件置于侧翼，但后者并不是紧密相邻。更重要的是，质粒在转染前被用来使质粒线性化的PvuⅠ位点分离。在整合进宿主细胞染色体后，其导致基因不再被置于侧翼，因为UCOE和pgk/嘌呤霉素抗性元件均会整合进基因的同一侧。而在质粒CET710(以及它的EGFP-表达衍生物，CET711)和CET720(以及它的EGFP-表达衍生物，CET721)中，PvuⅠ线性化导致基因紧密整合，所述基因的一侧为UCOE，而另一侧为pgk/嘌呤霉素抗性元件。CET210(以及CET230)和CET720(以及CET721)携带hnRNP衍生的UCOE，而CET710(以及CET711)则携带“人工”β-肌动蛋白/PDCD2衍生的UCOE。
图2所示为在转染后的指示日期，如FACS分析的中值荧光所测量，来自各种不同的转染进CHO-K1细胞中的载体的EGFP的表达情况。“EGFP”描绘的是用含有对照的(pEGFP)非-UCOE的质粒转染的细胞。CET220所示为用质粒转染的细胞，在这种质粒中，EGFP表达单元被可操作地连接在hnRNP衍生的UCOE上，但不是连接到pgk/嘌呤霉素抗性元件上。而是使用SV40/新霉素抗性元件。其它的细胞用CET230，711或721转染，它们的结构如图1所示。
图3所示为在转染后的指示日期，图2中所示的细胞群经判断为表达阳性的比例。
图4所示为如中值荧光所检测，EGFP在转染有载体CET220，230，721和711的CHO-K1中的表达情况，中值荧光在没超出FACScan检测能力的情况下经纠正后允许进行比较。这清楚地显示把选择标记(puror)置于可表达基因(EGFP)的5’端(CET230)或3’端(CET721)的效果相当。
图5所示为如中值荧光检测，EGFP在转染有载体CET701，721，704，741，705，751，706，761，708和781的CHO-K1细胞中的表达，中值荧光在没超出FACScan检测能力的情况下经纠正后允许进行比较。
图6所示为EGFP在转染有载体的CHO-K1细胞中的表达水平，所述载体用5’人和鼠hnRNP UCOE和3’嘌呤霉素抗性基因相比较。
图7所示为链霉菌新霉素抗性基因的位置对EGFP表达的影响。CET741在转基因的3’端有选择标记，而CET745在转基因和UCOE的5’端有选择标记。在两个载体中，UCOE都是人RNP UCOE。
图8所示为质粒CET700的图谱。
图9所示为质粒CET710的图谱。
图10所示为CET710的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。
图11所示为质粒CET720的图谱。
图12所示为CET720的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图13所示为野生型白黑链霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。
图14所示为修饰的白黑链霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图15所示为弗氏链霉菌(S.fradiae)的氨基糖苷磷酸转移酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。
图16所示为吸水链霉菌(S.hygroscopicus)的潮霉素磷酸转移酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。
图17所示为大肠杆菌(E.coli)氨基环多醇磷酸转移酶(hygror)基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
图18所示为转座子Tn5(肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))的新霉素磷酸转移酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
图19所示为小鼠hnRNP A2 HindⅢ片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。
图20所示为质粒CET1010的图谱。
图21所示为CET1010的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。
图22所示为质粒CET1020的图谱。
图23所示为CET1020的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)。
图24所示为质粒CET1030的图谱。
图25所示为CET1030的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图26所示为质粒CET1110的图谱。
图27所示为CET1110的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。
图28所示为质粒CET1120的图谱。
图29所示为CET1120的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)。
图30所示为质粒CET1130的图谱。
图31所示为CET1130的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)。
实施例
实施例1：可表达基因的侧翼带有UCOE和可选择元件
材料和方法
pGK-Puro CET表达载体的构建
CET700
CMV-MCS-SV40pA盒以AseⅠ/AflⅡ片段从CET31(一种以CMV MCS pA SV40Neo为基础的质粒)中取出，平端用T4 DNA聚合酶补平并被连接进已用EcoRV消化的pPGK-Puro(mPGK启动子，嘌呤霉素抗性基因，pBluescript中的bGHpA)。
CET720
用HindⅢ消化CET20(pBluescript中的8.3kb hnRNP A2片段)，得到8kb的RNP UCOE，然后将其连接入也已用HindⅢ切割的CET700中。
CET710
从CET21(pBluescript中的人工UCOE)中，以XbaⅠ/CIaⅠ片段的形式取出人工UCOE，用T4 DNA聚合酶补平平端，并将其连接入已用HindⅢ消化且用T4 DNA聚合酶填平平端的CET700中。
CET230
用NarⅠ和EcoRⅠ消化pUC19，去除大约160bp的片段，然后钝化和重新连接，便构建了载体CET230。这从载体骨架上去掉了两个PvuⅠ和PvuⅡ位点中的一个。用AseⅠ/AflⅡ消化pEGFPN-1(Clontech)，接着将平端补平，然后插入到已用NdeⅠ和Eco1091消化并重新补平平端的pUC19载体骨架，从而将CMV-EGFP-SV40pA盒(其MCS缺失)从pEGFPN-1中剪切掉。
PGK-Puro-bGpA盒以EcoRⅠ/XbaⅠ平端填平片段从pPGK-Puro中取出，然后钝化并插入上述载体的单一PvuⅡ位点处。最后，这个8.3kb hnRNP A2片段作为衍生自CET20的HindⅢ片段被插入这个载体的唯一的HindⅢ位点。
为了清楚目的：
CET230是“空”载体CET210的EGFP-表达形式。
CET711是“空”载体CET710的EGFP-表达形式。
CET721是“空”载体CET720的EGFP-表达形式。
基于CET720的带有不同抗生素抗性基因和可选择的启动子或UCOE的载体可通过如下方式构建。通过限制性消化可从CET720中取出PGK启动子(bp11384-11894)和bghpA(bp12567-12893)。将这些元件能插入到pBluescript骨架中，从而以让抗性基因表达的方式，限制性位点能有效用于插入在PGK启动子和bghpA之间的任何抗性基因序列(利用RCR或限制性消化衍生)。CMV-MCS-SV40pA表达盒也能从CET720(bp10533-11380)中取出，然后插入上述载体的PGK启动子的5’端。另一种方法，mCMV-MCS-SV40pA表达盒也能放置在同一位置(CET801，821，824-EGFP表达形式)。hnRNPA2UCOE能通过限制性消化从CET720中(bp2240-10525)中取出，然后插入上述载体的CMV表达盒的5’端，或者，其他UCOE(例如，鼠hnRNPA2)能被插入到同一位置(CET824-EGFP表达载体)。
为了清楚目的：
CET741是“空”载体CET740的EGFP-表达形式，它的5’端含有一个人RNP UCOE，而3’端则包含一个弗氏链霉菌(S.fradiae)的neor基因。
CET761是“空”载体CET760的EGFP-表达形式，它的5’端含有一个人RNP UCOE，而3’端则包含一个大肠杆菌氨基环多醇磷酸转移酶(hygror)基因。
CET781是“空”载体CET780的EGFP-表达形式，它的5’端含有一个人RNP UCOE，而3’端则包含一个修饰的白黑链霉菌(S.alboniger)的嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因。
CET821是“空”载体CET820的EGFP-表达形式，它的5’端含有一个人RNP UCOE，而3’端则包含一个野生型的白黑链霉菌(S.alboniger)嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因。EGFP转基因的表达由鼠(而不是人)CMV IE启动子所驱动。
CET824是“空”载体CET823的EGFP-表达形式，它的5’端含有一个鼠(而不是人)RNP UCOE，而3’端则包含一个野生型的白黑链霉菌(S.alboniger)嘌呤霉素N-乙酰基转移酶基因。
pCIA载体
这是一系列载体，当整合进染色体时，它们能轻易地允许对带有最终优化构型(UCOE表达盒抗性盒)的UCOE表达载体进行构建。
CET900是一个空的克隆载体，在这个载体中，成对的稀有限制性位点位于MCS的侧翼。CET901和CET902分别包括hCMV和mCMV启动子，以及一个MCS和SV40pA。相同的成对的稀有限制性位点也位于这些表达盒的侧翼。
CET1000系列载体包含各种不同的UCOE和抗性表达盒的组合。它们在UCOE的3’端和抗性盒的5’端，也包含和CET900系列相同的稀有限制性位点。这类载体在UCOE的5’端和抗性盒的3’端也含有线性化位点。
因此，任何转基因的表达盒在CET900系列中能被构建，然后且能很容易地转移到CET1000系列中，以便于在整合进染色体时，最终的构型是所需的UCOE-表达盒抗性盒。
如上所述，抗生素抗性基因在CET1000系列中通过限制性消化或PCR得以交换。
转染
根据基本方法以及在此一并引作参考的在审专利申请中所述，CHOK1细胞被转染和筛选。
结果
具体参照图2，和CET721转染的细胞相比，CET721和CET230转染的细胞表示出一贯地更高的表达水平。这两个载体的相似性在于它们都带有8kb hnRNP衍生的UCOE，所述UCOE可操作地连接到驱动EGFP基因的CMV启动子上，并且这两个载体也都携带有pgk/嘌呤霉素抗性基因元件。然而，用PvuⅠ线性化后，CET230整合进宿主细胞染色体后导致元件按如下顺序放置：pgk/Puro，hnRNP UCOE，EGFP基因。用CET721进行同样的处理导致EGFP基因被UCOE和pgk/Puro置于侧翼。用CET230获得的表达水平并没显著高于用CET220获得的表达水平，CET220是一种不携带pgk/Puro元件但具有同样的能驱动EGFP表达的UCOE和启动子的载体。
和基本的EGFP表达质粒相比，所有含UCOE的载体表示出显著升高的表达水平。
图3所示的是，就表达而言，在转染后的所有时间点，用中值荧光表示的表达水平升高也可以反映在转化细胞群中被判定为阳性的细胞比例的上升。这是一个位置效应缺乏的检测，因为载体的随机整合通常会导致转染的细胞群(非克隆)中一系列的表达水平。这个已被5’UCOE和3’选择元件的组合所克服，产生导致均一的高表达群体。
图2中所示的某些细胞池的表达水平是如此之高，以至于产生的荧光超出了检测器的能力。
在图4中，检测已被纠正到检测器反应的线性区域，以让构建体之间进行比较。这表明和单独用UCOE(CET220)或把选择元件(Puror)放在UCOE 5’端而获得的表达水平相比，在CET721中采用UCOE和3’侧翼选择元件的组合使EGFP表达水平增加大约7倍。很明显，把UCOE和选择标记置于表达的转基因侧翼对表达水平的提升是必需的。
这种效果并不局限于特定的选择标记。图7比较了可操作地连接在人RNP UCOE 5’端和5’(CET745)或3’(CET741)放置弗氏链霉菌(S.fradiae)新霉素抗性基因的EGFP的表达。这几乎是已经高表达水平的2倍。
实施例2 其他3’侧翼选择标记的有效性
结果
图5所示为将5’人RNP UCOE和各种不同的3’侧翼抗生素抗性基因置于EGFP转基因侧翼的效果。CET701是一个对照，它不含UCOE，但具野生型的白黑链霉菌(S.alboniger)的Puror。CET721既有5’UCOE又有3’Puror。CET704含有弗氏链霉菌(S.fradiae)的neor，但没有UCOE，而CET741两者均有。CET705包含吸水链霉菌(S hygroscopicus)的hygror，但没有UCOE，而CET751两者均有。CET706具有大肠杆菌的hygror，但没有UCOE，而CET761两者均有。CET708具有密码子修饰的Puror，但没有UCOE，而CET781两者均有。在所有的情况下，3’侧翼抗性基因的促进效果是明显的。
实施例3 其他UCOE和Puro选择元件的组合
结果
如图2和图3所示，带有人工构建的UCOE的可比较质粒(CET711)的表达和带有RNP UCOE的质粒的表达在中值荧光和阳性细胞比例方面是相对等的。这就证明了第二个位于侧翼的富含CpG元件产生的UCOE的效应放大现象总体上是一个，并不局限于RNPUCOE和pgk/Puro元件的特定组合。图4中对CET711和CET721表达的比较显示，CET711中获得一种轻微低水平的表达，但这仍比单独使用UCOE高出至少6倍。
图6所示的是利用鼠CMV启动子驱动表达的人hnRNPUCOE(CET821)和鼠hnRNP UCOE中(CET824)获得的同等结果。CET721包括人hnRNP UCOE而且使用人CMV启动子。