一株重组大肠杆菌及其在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102206606 A (43)申请公布日 2011.10.05 CN 102206606 A *CN102206606A* (21)申请号 201110079886.X (22)申请日 2011.03.31 C12N 1/21(2006.01) C12P 13/00(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (71)申请人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南路 27 号 (72)发明人 祁庆生 康振 王阳 王倩 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (54) 发明名称 一株重组大肠杆菌及其。

2、在生产 5- 氨基乙酰 丙酸中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一株重组大肠杆菌， 其中所述 重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌 DALA， 由如下方 法制得 ： 构建含 hemAM和 hemL 基因的共表达载 体 p-hemAM-hemL， 再构建含 rhtA 基因的表达载 体 p-rhtA， 将所构建的重组质粒 p-hemAM-hemL 和 p-rhtA 共转化大肠杆菌中， 得同时过量表达 hemAM、 hemL 和 rhtA 基因的重组大肠杆菌 DALA。 本发明还公开了所述重组大肠杆菌在生产 5- 氨 基乙酰丙酸中的应用， 发酵结果表明， 本发明的重 组大肠杆菌的ALA产量达到了4.13g。

3、/L， ALA/葡萄 糖转化率为 0.168g ALA/g 葡萄糖， 提示具有很好 的工业开发和应用前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 7 页 序列表 3 页 附图 2 页 CN 102206609 A1/1 页 2 1. 一株重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌 DALA， 由如 下方法制得 ： 构建含 hemAM和 hemL 基因的共表达载体 p-hemAM-hemL， 再构建含 rhtA 基因的 表达载体p-rhtA， 将所构建的重组质粒p-hemAM-hemL和p-rhtA共转。

4、化大肠杆菌中， 得同时 过量表达 hemAM、 hemL 和 rhtA 基因的重组大肠杆菌 DALA。 2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述hemAM是来源于大肠杆菌或沙 门氏菌的 hemA 基因的突变体 ； 所述 hemL 基因来源于大肠杆菌或沙门氏菌 ； 所述 rthA 基因 来源于大肠杆菌。 3.如权利要求2所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述hemAM是来源于亚利桑那沙门 沙门氏菌的 hemA 基因的突变体 ； 所述 hemL 基因来源于沙门氏菌。 4. 如权利要求 1 所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述表达 hemAM、 hemL 或 rhtA 基因 的。

5、载体为 pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18、 pCL1920 或 pTrc99A。 5. 如权利要求 4 所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述表达 hemAM和 hemL 基因的载 体选 pUC19 ； 所述表达 rhtA 基因的载体选 pCL1920。 6.如权利要求1所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述大肠杆菌选大肠杆菌MG1655、 大肠杆菌 DH5、 大肠杆菌 JM109、 大肠杆菌 W3110 或大肠杆菌 XL1-Blue。 7. 如权利要求 6 所述的重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述大肠杆菌选大肠杆菌 DH5。 8. 如权利要求 1 所述的重组大肠。

6、杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌 DALA 为 DH5/ pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。 9. 权利要求 1 所述重组大肠杆菌在生产 5- 氨基乙酰丙酸中的应用， 其特征在于， 所 述应用是以所述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖来生产 5- 氨基乙酰丙 酸 ； 其中， 所述改良无机盐培养基配方为 ： 葡萄糖 5-50g/L， (NH4)2SO410-30g/L， KH2PO41-8g/ L， Na2HPO412H2O 10-30g/L， MgSO47H2O 0.1-1.5g/L， MnSO47H2O 0.001-0.1g/L， 酵母粉 0.5-3g/。

7、L， 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)0.05-1mM ； 所述发酵中培养基中添加浓度为 50-100g/mL 的氨苄青霉素和浓度为 30-50g/mL 的壮观霉素。 10.如权利要求9所述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸中的应用， 其特征在于， 所 述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖的发酵条件为 ： 菌种接种量以体积百 分比计为 2 5， 发酵温度为 35 38， pH 为 6.0 7.0， 溶氧控制在 50以上， 发 酵时间为 36 60h。 权 利 要 求 书 CN 102206606 A CN 102206609 A1/7 页 3 一株重组大肠杆菌及其在生产 5。

8、- 氨基乙酰丙酸中的应用 技术领域 0001 本发明涉及基因工程和微生物发酵领域， 具体地说， 涉及一株重组大肠杆菌及其 构建方法以及该重组菌株在生产 5- 氨基乙酰丙酸 (ALA) 中的应用。 背景技术 0002 5- 氨基乙酰丙酸 (ALA)， 其分子式为 C5O3NH9， 分子量为 131.13， 熔点为 118， ALA 在农业上具有重要的应用。研究表明它是无公害的天然物质， 具有生物降解性。5- 氨基乙 酰丙酸是一种新型农药， 由于其在环境中易降解， 无残留， 对哺乳动物无毒性， 因其作为一 种无公害的绿色农药而受到关注。ALA 在农业领域应用也非常广泛， 主要应用于绿色除草 剂、 。

9、植物生长调节剂、 杀虫剂等方面。 除了在农业上的应用， 在医学领域， ALA作为一种安全、 选择、 渗透性好的光动力学药物逐渐受到青睐。ALA 已经应用于皮肤癌、 膀胱癌、 消化道癌、 肺癌等的诊断与光动力治疗 (PDT) 中。 0003 目前， ALA 的生产方法集中在化学合成。关于 -ALA 化学合成方法的报道最早文 献出自上世纪 50 年代， 进入 20 世纪 90 年代， 有关化学合成的研究最为活跃。相关化学合 成主要集中在以马尿酸和琥珀酸为原料的合成工艺研究、 以糠醛等杂环物质为原料的合成 工艺研究及以乙酰丙酸或其衍生物为原料的合成工艺研究。由于化学合成反应步骤多、 副 产物多、 分。

10、离提纯难、 ALA 的得率低等问题， 从而造成生产成本高。除此之外， 由于化学合成 中涉及很多有毒试剂， 从而对环境也会造成污染。所以随着社会和科学技术的发展。以廉 价的可再生资源为底物， 利用微生物发酵生产 ALA 已是未来的趋势。目前市场上， 葡萄糖价 格为 4500 元 / 吨， ALA 价格为 80000000 元 / 吨。即使 ALA-HCl， 其价格也极为昂贵， 达到 4,000,0000 元 / 吨。所以利用葡萄糖廉价底物为原料发酵生产 ALA， 成本上具有极大的优 势。 0004 国外一些科研者通过诱变育种法对光合细菌球形红细菌 (Rhodobacter sphaeroides。

11、)诱变， 筛选ALA高产菌株。 通过发酵工艺， ALA产量达到了7.2g/L。 然而由于光 合细菌发酵中采用光照， 从而增加了成本， 不适合大规模工业发酵生产。 大肠杆菌(E.coli) 作为生产工业产物的宿主由于其遗传背景清楚、 易操作、 生长速率快、 易培养、 可利用无机 盐培养基培养及可利用多种碳源， 而受到越来越多的重视。 随着基因工程技术的成熟， 人们 已经采用基因重组技术将 R.sphaeroides 中的 ALA 合成酶基因 (hemA) 在野生型大肠杆菌 中表达。Mariet 和 Zeikus 获得大肠杆菌 (Escherichia coli) 重组菌株， ALA 发酵产量达 。

12、到了 3.79g/L。L.Xie et al. 等利用含有 R.sphaeroides 的 ALA 合成酶基因的重组大肠杆 菌， 经过发酵优化， ALA 产量达到 5.2g/L。上述 ALA 生产方法是利用 C4- 途径， 即通过表达 ALA 合成酶生物转化琥珀酸和甘氨酸生产 ALA。 0005 目前由于琥珀酸主要是通过化学合成法制备， 所以琥珀酸和甘氨酸为底物生物转 化 ALA 成本较高， 同时由于高浓度的甘氨酸 ( 1.7g/L) 即造成对菌体生长的抑制， 所以生 物转化工艺相对复杂。 同时， 生物转化中所用培养基为昂贵的LB培养基， 所以这也成为ALA 工业化的瓶颈。 如何降低发酵成本以。

13、及简化发酵工艺， 成为ALA大工业生产的关键问题。 只 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A2/7 页 4 有降低生物法生产ALA的成本， 同时简化发酵工艺， 利用微生物工业化生产ALA才有望代替 目前的化学合成方法。 发明内容 0006 针对目前 ALA 生产中的缺陷， 本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其 构建方法以及该重组菌株在生产 5- 氨基乙酰丙酸 (ALA) 中的应用。 0007 本发明的技术方案是基于ALA的C5途径， 采用在大肠杆菌中过量表达来源于大肠 杆菌或沙门氏菌中的中 hemA 基因突变体和来源于大肠杆菌的大肠杆菌、 亚利桑那沙门。

14、氏 菌或伤寒沙门氏菌中的 hemL 基因， 在改良无机盐培养基内以葡萄糖为唯一碳源发酵生产 5- 氨基乙酰丙酸 (ALA)。 0008 本发明所述重组大肠杆菌， 其特征在于， 所述重组大肠杆菌名为重组大肠杆菌 DALA， 由如下方法制得 ： 构建含 hemAM和 hemL 基因的共表达载体 p-hemAM-hemL， 再构建含 rhtA 基因的表达载体 p-rhtA， 将所构建的重组质粒 p-hemAM-hemL 和 p-rhtA 共转化大肠杆 菌中， 得同时过量表达 hemAM、 hemL 和 rhtA 基因的重组大肠杆菌 DALA。 0009 其中， 所述 hemAM是来源于大肠杆菌或沙门。

15、氏菌的 hemA 基因的突变体 ； 所述 hemL 基因来源于大肠杆菌或沙门氏菌 ； 所述 rthA 基因来源于大肠杆菌。 0010 进一步优选的是， 所述 hemAM是来源于亚利桑那沙门沙门氏菌的 hemA 基因的突变 体 ； 所述 hemL 基因来源于沙门氏菌。 0011 上述表达 hemAM、 hemL 或 rhtA 基因的载体为 pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18、 pCL1920 或 pTrc99A ； 其中质粒 pBluescript SK-、 pCL1920 和来源于 DSMZ( 德国微生物保藏 中心 )， 质粒 pUC19、 pUC18 和 pTrc99。

16、A 来源于 famentas 公司。 0012 其中， 所述表达 hemAM和 hemL 基因的载体优选 pUC19 ； 所述表达 rhtA 基因的载体 优选 pCL1920。 0013 上述出发菌株大肠杆菌选大肠杆菌 MG1655、 大肠杆菌 DH5、 大肠杆菌 JM109、 大 肠杆菌 W3110 或大肠杆菌 XL1-Blue ； 其中 MG1655、 JM109 和 W3110 来源于 ATCC( 美国典型 菌种保藏中心) ； 大肠杆菌DH5、 大肠杆菌Xl1-blue来源于DSMZ(德国微生物保藏中心)。 0014 其中， 所述出大肠杆菌优选大肠杆菌 DH5。 0015 上述重组大肠杆。

17、菌 DALA 优选是 DH5/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。 0016 本发明所述重组大肠杆菌的构建步骤 ： 0017 1.hemAM和 hemL 基因的共表达载体的构建 0018 基本方法是将来源于大肠杆菌或沙门氏菌的 hemA 基因的突变体 hemAM插入到含 有来自大肠杆菌hemL基因的质粒载体pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18、 pCL1920或pTrc99A 中 ； 或者将来源于大肠杆菌的 hemL 基因插入含有来源于大肠杆菌或沙门氏菌的 hemA 基因 的突变体 hemAM的质粒载体 pBluescript SK-、 pUC19、 。

18、pUC18、 pCL1920 或 pTrc99A 中， 从而 获得 hemAM和 hemL 基因的共表达载体 p-hemAM-hemL。 0019 2.rhtA 基因表达载体的构建 0020 基本方法是以大肠杆菌基因组为模板， 克隆rhtA基因， 将所克隆获得的rhtA插入 质粒 pBluescript SK-、 pUC19、 pUC18、 pCL1920 或 pTrc99A 中， 从而获得 rhtA 的表达载体 p-rhtA。 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A3/7 页 5 0021 3.ALA 发酵重组菌株的构建 0022 基本方法是将所构建的重组质粒。

19、 p-hemAM-hemL 和 p-rhtA 共转化大肠杆菌 MG1655、 JM109、 DH5、 W3110、 BL21 或 XL1-blue 中， 从而获得过量表达 hemAM、 hemL 和 rhtA 的重组大肠杆菌 DALA。 0023 上述过量表达 hemAM、 hemL 和 rhtA 的重组大肠杆菌 DALA 优选构建重组大肠杆菌 DALA DH5/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA。 0024 本发明所述重组大肠杆菌在生产 5- 氨基乙酰丙酸中的应用， 其特征在于， 所述应 用是以所述重组大肠杆菌在改良的无机盐培养基中发酵葡萄糖来生产 5- 氨基乙酰丙酸 ；。

20、 其中， 所述改良无机盐培养基配方为 ： 葡萄糖 5-50g/L， (NH4)2SO410-30g/L， KH2PO41-8g/L， Na2HPO412H2O 10-30g/L， MgSO47H2O 0.1-1.5g/L， MnSO47H2O0.001-0.1g/L， 酵 母 粉 0.5-3g/L， 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)0.05-1mM ； 所述发酵中培养基中添加浓度为 50-100g/mL 的氨苄青霉素和浓度为 30-50g/mL 的壮观霉素。 0025 上述改良无机盐培养基进一步优选的配方为 ： (NH4)2SO416g/L， KH2PO43g/L， Na2HPO41。

21、2H2O 16g/L， MgSO47H2O 1g/L， MnSO47H2O 0.01g/L，酵 母 粉 2g/L，异 丙 基 -D- 硫代半乳糖苷 (IPTG)0.1mM， 葡萄糖 35g/L。 0026 本发明所述重组大肠杆菌在生产 5- 氨基乙酰丙酸中的应用， 具体方法是 ： 0027 1. 摇瓶培养及 ALA 检测 0028 摇瓶培养 ： 挑取所构建的重组菌株单菌落至装有3-5mL的发酵培养基的25mL的三 角瓶中， 氨苄青霉素终浓度为100g/mL， 壮观霉素终浓度为50g/mL， 37， 225转/分， 培 养 12h。 0029 将过夜培养的菌液按照 0.5-3 (v/v) 的接种。

22、量接入装有 50mL 发酵培养基的 300mL 的三角瓶中， 氨苄青霉素终浓度为 100g/mL， 壮观霉素终浓度为 50g/mL， 37， 200-280 转 / 分， 发酵时间为 8-56h。期间每 2-6h 取样， 然后利用比色法检测 ALA 的浓度。 0030 ALA 检测方法是 ： 将样品稀释至 2mL， 加入 1mL 的乙酸盐缓冲液， 0.5mL 的乙酰 丙酮， 然后煮沸 15min。冷却至室温， 取 2mL 的反应液至新管中， 然后加入 2mL 的改良 Ehrlich s 试剂， 反应 20min， 利用分光光度计 554nm 下检测。 0031 2. 发酵罐培养及 ALA 检测。

23、 0032 种子液的制备 ： 挑取所构建的重组大肠杆菌单菌落至装有 3-5mL 的发酵培养基的 25mL 的三角瓶中， 氨苄青霉素终浓度为 100g/mL， 壮观霉素终浓度为 50g/mL， 30-39， 200-250 转 / 分， 培养 8-16h。 0033 将过夜培养的菌液按照 0.5-3 (v/v) 的接种量接入装有 50mL 发酵培养基的 300mL 的三角瓶中， 氨苄青霉素终浓度为 100g/mL， 壮观霉素终浓度为 50g/mL， 37， 200-250 转 / 分， 培养 6-10h， 制得种子液。 0034 发酵罐培养 ： 将制备好的种子液以体积百分比计按照 2的接种量转接。

24、装有 3L 发 酵培养基的5L发酵罐中进行培养。 发酵温度为35-38， pH为6.0-7.0， 溶氧控制在50 以上， 发酵时间为 36-60h。间隔 2-6h 取样， 然后利用比色法检测 ALA 的浓度。 0035 ALA 检测方法同上。 0036 上述重组大肠杆菌在生产5-氨基乙酰丙酸的应用中， 发酵温度优选37， pH优选 6.2， 溶氧控制在 50以上， 发酵时间为 60h。 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A4/7 页 6 0037 本发明所提供的重组大肠杆菌及其生产5-氨基乙酰丙酸(ALA)的方法， 具有非常 重要的工业应用价值。 0038 通。

25、过实验比较发现， 本发明所述的重组菌株 DALA 的 ALA 的产量最高。 0039 其中， 摇瓶培养中， 进行实验的重组菌株 DEX、 DEL、 DA、 DAL 和 DXAL 的 ALA 产量分 别是 0.016g/L、 0.024g/L、 0.176g/L、 2.05g/L 和 1.32g/L， 而本发明所述的重组菌株 DALA 的 ALA 产量为 2.86g/L， 在所有参试菌中最高， 为菌株 DEX 的 ALA 产量的 179 倍。发酵罐培 养中， 进行实验的重组大肠杆菌 DALA 的 ALA 产量达到了 4.13g/L， 葡萄糖的转化率达到了 0.168g ALA/g 葡萄糖。提示具。

26、有很好的工业开发和应用前景。 附图说明 0040 图 1. 重组大肠杆菌发酵葡萄糖生产 ALA 的途径。 0041 图 2. 构建质粒表达载体图谱。 0042 图 3. 各重组菌株 ALA 产量的比较。 0043 图 4. 发酵罐培养重组菌株生产 ALA。 具体实施方式 0044 一般性说明 ： 实施例所涉及的酶均购自 TaKaRa 公司， 质粒提取试剂盒购自天根 公司， 琼脂糖凝胶回收 DNA 片段试剂盒购自申能博彩公司， 操作完全按照相应说明述进行。 质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。ALA 标准样品及其他试剂均购自 Sigma 公司。 DH5 感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。 。

27、0045 LB 液体培养基 (1L) ： 酵母粉 5， 蛋白胨 10， NaCl 10， pH 7.0。 0046 LB- 氨苄抗性固体培养基 (1L) ： 酵母粉 5， 蛋白胨 10， NaCl 10， 氨苄青霉素 100g/mL。 0047 ALA 检测方法 ： 将样品稀释至 2mL， 加入 1mL 的乙酸盐缓冲液， 0.5mL 的乙酰丙酮， 然后煮沸 15min。冷却至室温， 取 2mL 的反应液至新管中， 然后加入 2mL 的改良 Ehrlich s 试剂， 反应 20min， 利用分光光度计 554nm 下检测。 0048 所述乙酸盐缓冲液组成为 (1L) ： 57mL 冰乙酸， 8。

28、2g 无水醋酸钠。 0049 所述改良 Ehrlich s 试剂 ： 在 50mL 的量筒中加入 30mL 的冰乙酸， 1g 对 - 二甲氨 基苯甲醛， 8mL 70高氯酸， 然后定容 50mL。 0050 实施例 1、 gltX 基因表达载体的构建 0051 根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列， 利用引物gltX-F ： 5-TCCCTGCAGAAAGGAG GATATACATATGAAAATCAAAACTCGCTTCGCGC-3和 gltX-R ： 5 -GGCGTCGACTTACTGCTGATTTTCG CGTTCAGCAATAAAATCC-3以大肠杆菌基因组或直接采用菌落 PCR， 。

29、克隆 gltX 基因。将克隆 的 gltX 片段分别利用核酸内切酶 PstI 和 SalI 消化处理， 同时将质粒载体 pUC19 也分别利 用核酸内切酶 PstI 和 SalI 消化处理。将消化处理的 gltX 片段和 pUC19 质粒载体利用琼 脂糖凝胶试剂盒回收， 然后利用 T4 连接酶连接。连接体系为 10L ： 0052 gltX 片段 ： 6L 0053 pUC19 载体 ： 2L 0054 10Buffer ： 1L 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A5/7 页 7 0055 T4 连接酶 ： 1L 0056 16连接 12h 后， 将 10L。

30、 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热 击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布氨苄青霉素抗 性平板， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。然后进一步测序验证 gltX 基因的正确。从 而获得重组质粒 pUC-gltX。 0057 实施例 2、 hemL 基因表达载体的构建 0058 根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列， 利用引物hemL-F ： 5-ACAGGATCCAAAGGAG G。

31、ATATACATATGAGTAAGTCTGAAAATCTTTACAGCG-3和 hemL-R ： 5 -AATGAGCTCTCACAACTTCGCA AACACCCGACGTGCAGCA-3以大肠杆菌基因组或直接采用菌落 PCR， 克隆 hemL 基因。将克隆 的 hemL 片段分别利用核酸内切酶 BamI 和 SacI 消化处理， 同时将质粒载体 pUC19 也分别利 用核酸内切酶 BamI 和 SacI 消化处理。将消化处理的 hemL 片段和 pUC19 质粒载体利用琼 脂糖凝胶试剂盒回收， 然后利用 T4 连接酶连接。连接体系为 10L ： 0059 hemL 片段 ： 6L 0060。

32、 pUC19 载体 ： 2L 0061 10Buffer ： 1L 0062 T4 连接酶 ： 1L 0063 16连接 12h 后， 将 10L 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布氨苄青霉素抗性 平板， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。然后进一步测序验证 hemL 基因的正确。从而 获得过重组质粒 pUC-hemL。 0064 实施例 3、 he。

33、mA 基因的突变及表达载体的构建 0065 根据 NCBI 公布的沙门氏菌基因组序列， 利用引物 hemAM-F ： 5 -CCCGTCGACAAAGGA GGATATACATATGACCAAGAAGCTTTTAGCACTCGGTATCAAC-3和hemAM-R ： 5-AAATCTAGACTACTCC AGCCCGAGGCTGTCGCGCAGA-3以大肠杆菌基因组或直接采用菌落 PCR， 克隆 hemAM基因。将 克隆的 hemL 片段分别利用核酸内切酶 SalI 和 XbaI 消化处理， 同时将质粒载体 pUC19 也分 别利用核酸内切酶 SalI 和 XbaI 消化处理。将消化处理的 h。

34、emAM片段和 pUC19 质粒载体利 用琼脂糖凝胶试剂盒回收， 然后利用 T4 连接酶连接。连接体系为 10L ： 0066 hemAM片段 ： 6L 0067 pUC19 载体 ： 2L 0068 10Buffer ： 1L 0069 T4 连接酶 ： 1L 0070 16连接 12h 后， 将 10L 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布氨苄青霉素抗性 平。

35、板， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。然后进一步测序验证 hemAM基因的正确。从而 获得重组质粒 pUC-hemAM。 0071 实施例 4、 hemAM和 hemL 基因共表达载体的构建 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A6/7 页 8 0072 利用核酸内切酶 BamI 和 SacI 消化处理质粒 pUC-hemL， 获得 BamI-hemL-SacI 片 段。然后利用核酸内切酶 BamI 和 SacI 消化处理质粒 pUC-hemAM。利用 T4 连接酶将片段 BamI-hemL-SacI 连接至 pUC-hemAM， 连接体系为 10L。

36、 ： 0073 hemL 片段 ： 6L 0074 pUC-hemAM载体 ： 2L 0075 10Buffer ： 1L 0076 T4 连接酶 ： 1L 0077 16连接 12h 后， 将 10L 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布氨苄青霉素抗性 平板， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。然后进一步测序验证 hemAM和 hemL 基因的正 确。

37、从而获得重组质粒 pUC-hemAM-hemL。 0078 实施例 6、 gltX、 hemAM和 hemL 基因共表达载体的构建 0079 利用核酸内切酶 PstI 和 SalI 消化处理质粒 pUC-gltX， 获得 PstI-gltX-SalI 片 段。然后利用核酸内切酶 PstI 和 SalI 消化处理质粒 pUC-hemAM-hemL。利用 T4 连接酶将 片段 PstI-gltX-SalI 连接至 pUC-hemAM-hemL， 连接体系为 10L ： 0080 gltX 片段 ： 6L 0081 pUC-hemAM-hemL 载体 ： 2L 0082 10Buffer ： 1L 。

38、0083 T4 连接酶 ： 1L 0084 16连接 12h 后， 将 10L 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布氨苄青霉素抗性 平板， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。从而获得重组质粒 pUC-gltX-hemAM-hemL。 0085 实施例 7、 rhtA 表达载体的构建 0086 根据NCBI公布的大肠杆菌基因组序列， 利用引物rhtA-F。

39、 ： 5-CCGAAGCTTTTAATAA GGAGGATATACATATGCCTGGTTCATTACGTAAAATGCCGG-3和rhtA-R ： 5-GCCCTGCAGTTAATTAATG TCTAATTCTTTTATTTTGCTCTC-3以大肠杆菌基因组或直接采用菌落PCR， 克隆rhtA基因。 将 克隆的rhtA片段分别利用核酸内切酶HindIII和PstI消化处理， 同时将质粒载体pCL1920 也分别利用核酸内切酶 HindIII 和 PstI 消化处理。将消化处理的 rhtA 片段和 pCL1920 质 粒载体利用琼脂糖凝胶试剂盒回收， 然后利用 T4 连接酶连接。 0087 连。

40、接体系为 10L ： 0088 rhtA 片段 ： 6L 0089 pCL1920 载体 ： 2L 0090 10Buffer ： 1L 0091 T4 连接酶 ： 1L 0092 16连接 12h 后， 将 10L 的连接液转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。转化过程 为 ： 将 10L 的连接液加入 100L 的 DH5 感受态细胞中， 混匀。冰浴 30min， 42热击 90s， 冰浴 2min， 加入 900L 的 LB 培养基， 37， 100 转 / 分， 孵化 1h， 涂布壮观霉素抗性平 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A7/7 页 9 板 (3。

41、0g/mL)， 培养 16h， 挑取转化子， 提取质粒验证。然后进一步测序验证 rhta 基因的正 确。从而获得过量表达 rhtA 的重组质粒 pCL1920-rhtA。 0093 实施例 8、 重组菌株的构建及 ALA 产量的比较 0094 重组菌株的构建 ： 分别将上述所构建的质粒 pUC-gltX、 pUC-hemL、 pUC-hemAM、 pUC-hemAM-hemL以及pUC-gltX-hemAM-hemL转化大肠杆菌DH5感受态细胞， 分别获得重组 菌株 DH5/pUC-gltX( 命名为 DEX)、 DH5/pUC-hemL( 命名为 DEL)、 DH5/pUC-hemAM( 命。

42、 名为DA)、 DH5/pUC-hemAM-hemL(命名为DAL)以及DH5/pUC-gltX-hemAM-hemL (命名为 DXAL)。将重组质粒 pUC-hemAM-hemL 和重组质粒 pCL1920-rhtA 共转化大肠杆菌 DH5 感 受态细胞， 获得重组菌株 DH5a/pUC-hemAM-hemL+pCL1920-rhtA( 命名为 DALA)。 0095 各重组菌株的发酵比较 ： 挑取所构建的重组菌株 DEX、 DEL、 DA、 DAL、 DXAL 以及 DALA 单菌落至装有 20mL 的发酵培养基的 250mL 的三角瓶中， 37， 225 转 / 分， 培养 12h。 。

43、按照体积比 1的接种量将培养液转接装有 50mL 发酵培养基的 300mL 的三角瓶中， 37， 225 转 / 分， 4h 取样， 发酵时间为 36h。其中 DEX、 DEL、 DA、 DAL、 DXAL 的发酵培养基组分为 ： (NH4)2SO416g/L， KH2PO43g/L， Na2HPO412H2O 16g/L， MgSO47H2O 1g/L， MnSO47H2O 0.01g/ L， 酵母粉2g/L， 100g/mL氨苄青霉素， IPTG0.1mM， 葡萄糖35g/L。 其中， 氨苄青霉素的添加 是为了维持质粒的稳定。 而重组菌株DALA的发酵培养基组分为 ： (NH4)2SO41。

44、6g/L， KH2PO43g/ L， Na2HPO412H2O 16g/L， MgSO47H2O 1g/L， MnSO47H2O 0.01g/L， 酵母粉 2g/L， 100g/ mL 氨苄青霉素， 50g/mL 壮观霉素， IPTG 0.1mM， 葡萄糖 35g/L。其中， 氨苄青霉素和壮观 霉素的添加是为了维持双质粒的稳定。 0096 ALA 检测方法具体是 ： 将样品稀释至 2mL， 加入 1mL 的乙酸盐缓冲液， 0.5mL 的乙 酰丙酮， 然后煮沸 15min。冷却至室温， 取 2mL 的反应液至新管中， 然后加入 2mL 的改良 Ehrlich s 试剂， 反应 20min， 利用。

45、分光光度计 554nm 下检测。 0097 各重组菌株 ALA 产量统计见图 3。其中， 重组菌株 DEX、 DEL、 DA、 DAL 和 DXAL 的 ALA 产量分别是 0.016g/L、 0.024g/L、 0.176g/L、 2.05g/L 和 1.32g/L。而重组菌株 DALA 的 ALA 产量最大， 为 2.86g/L， 为菌株 DEX 的 ALA 产量的 179 倍。 0098 实施例 9、 重组菌株 E.coli DALA 分批发酵生产 ALA 0099 种子液的制备 ： 挑取所构建的重组大肠杆菌单菌落至装有 4mL 的发酵培养基的 25mL 的三角瓶中， 37， 225 转。

46、 / 分， 培养 12h。将培养的菌液按照 1 (v/v) 的接种量接入 装有50mL发酵培养基的300mL的三角瓶中， 37， 225转/分， 培养8h。 从而制备好种子液。 0100 发酵罐培养 ： 将制备好的种子液按照 2 (v/v) 的接种量转接装有 3L 发酵培养基 的 5L 发酵罐中进行培养。发酵温度为 37， pH 为 6.2， 溶氧控制在 50以上， 发酵时间为 56h。间隔 4h 取样， 然后利用比色法检测 ALA 的浓度。 0101 ALA 检测方法为比色法， 详见实施例一般性说明。 0102 上 述 重 组 菌 株 DALA 的 发 酵 培 养 基 组 分 为 ： (NH。

47、4)2SO416g/L， KH2PO43g/L， Na2HPO412H2O 16g/L， MgSO47H2O 1g/L， MnSO47H2O 0.01g/L， 酵母粉 2g/L， 100g/mL 氨苄青霉素， 50g/mL 壮观霉素， IPTG 0.1mM， 葡萄糖 35g/L。 0103 发酵结果如图4所示， 重组大肠杆菌DALA的ALA的产量达到4.13g/L， 葡萄糖的转 化率达到了 0.168g ALA/g 葡萄糖。 说 明 书 CN 102206606 A CN 102206609 A1/3 页 10 0001 0002 序 列 表 CN 102206606 A CN 102206609 A2/3 页 11 0003 序 列 表 CN 102206606 A CN 102206609 A3/3 页 12 序 列 表 CN 102206606 A CN 102206609 A1/2 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102206606 A CN 102206609 A2/2 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102206606 A 。