犬瘟热病毒、肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重PCR试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102181581 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181581 A *CN102181581A* (21)申请号 201110100549.4 (22)申请日 2011.04.21 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院特产研究所 地址 132109 吉林省吉林市昌邑区左家镇 申请人 吉林特研生物技术有限责任公司 (72)发明人 易立 程世鹏 王建科 杨莘 许红丽 (74)专利代理机构 吉林长春新纪元专利代理有 限责任公司 22100 代理人 王薇 (54) 发明名称 犬瘟。

2、热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的 三重 PCR 试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种能同时检测水貂犬瘟热 病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试 剂 盒， 其 组 成 包 括 ： DNA 聚 合 酶， dNTPs， 引 物， PCR 缓冲液， 双蒸水 ； 其特征在于 ： 所述的 引物由 3 对引物组成， 其中， 第 1 对引物的序 列 为 5 -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3 和 5 -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3 ，第 2 对 引 物 的 序 列 为 5 -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3 和 5 -CAGAGCGAAGATA。

3、AGCAG-3 ，第 3 对 引 物的序列为 5 -GAAACCACGGTGGAGACA-3和 5 -AAGAGTTGACCTGGAGGG-3。采用本发明多重 PCR 试剂盒可在同一反应体系中同时检测出是否 有水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒 的感染或多重感染， 具有较高的特异性和敏感性， 从而节省时间和试剂， 可以为貂群的快速和早期 诊断提供有效的工具。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 4 页 CN 102181584 A1/1 页 2 1. 检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒。

4、的三重 PCR 试剂盒， 由 DNA 聚合 酶， dNTPs， 引物， PCR 缓冲液， 双蒸水组成 ； 其特征在于 ： 由 CDV， MEV， ADV3 对引物组成， 引物 序列为 ： CDV 引物 ： CDV-P1 5 -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3 CDV-P2 5 -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3 MEV 引物 ： MEV-P1 5 -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3 MEV-P2 5 -CAGAGCGAAGATAAGCAG-3 ADV 引物 ： ADV-P1 5 -GAAACCACGGTGGAGACA-3 ADV-P2 5 -AAGAGT。

5、TGACCTGGAGGG-3 ， CDV， MEV， ADV 各自的扩增目标长度为 335bp、 553bp 和 451bp。 2. 根据权利要求 1 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒， 所述的引物 CDV 阳性对照质粒、 MEV 阳性对照质粒和 ADV 阳性对照质粒， 其特征在 于还包括 1 个阴性对照。 3. 根据权利要求 1、 2 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒， 其特征在于所述的 CDV 阳性对照质粒的制备方法为 ： (1) 以水貂犬瘟热病毒的 cDNA 为模板， 以 5 -GATAAAGCATGTCAT。

6、TATAGTCCTAA-3和 5 -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3 为引物进行 PCR 扩增， 得到 335bp 的扩增产物， 将扩增产物回 收并纯化后克隆至 pMD18-T 载体， 得到 CDV 阳性对照质粒。 4. 根据权利要求 1、 2 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒， 其特征在于所述的 MEV 阳性对照质粒的制备方法为 ： 以水貂肠炎细小病毒的 DNA 为模板， 以 5 -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3 和 5 -CAGAGCGAAGATAAGCAG-3 为引物进行 PCR 扩增， 得到 555bp 的扩增产物， 将扩增产物。

7、回收并纯化后克隆至 pMD18-T 载体， 得到 MEV 阳 性对照质粒。 5. 根据权利要求 1、 2 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒， 其特征在于所述的 ADV 阳性对照质粒的制备方法为 ： 以水貂阿留申病毒 DNA 为 模板， 以 5 -GAAACCACGGTGGAGACA-3 和 5 -AAGAGTTGACCTGGAGGG-3 为引物进行 PCR 扩增， 得到 451bp 的扩增产物， 将扩增产物回收并纯化后克隆至 pMD18-T 载体， 得到 ADV 阳性对照 质粒。 6. 根据权利要求 1 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒。

8、的三重 PCR 试剂盒， 其特征在于所述的空白对照是蒸馏水。 7. 根据权利要求 1 所述检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒， 其特征在于所述的 DNA 聚合酶为 rTaqDNA 聚合酶。 权 利 要 求 书 CN 102181581 A CN 102181584 A1/6 页 3 犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三重 PCR 试剂 盒 技术领域 0001 本发明公开了一种能同时检测水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留申病毒的三 重 PCR 试剂盒， 属于水貂烈性病毒的检测领域。 背景技术 0002 犬瘟热病 (Canine distemper， CD。

9、) 是由副粘病毒科麻疹病毒属禽犬瘟热病毒 (CDV) 引起的犬科、 鼬科及部分浣熊科动物的一种高度接触性、 致死性传染病 ( 文献 1)。特 征表现为病毒粒子有囊膜， 直径大小约为 150 nm， 包括一个线性、 负义单链 RNA 基因组， 大 小约为15.0 kb， 病毒只有一个血清型。 该病的传染性极强， 死亡率可高达80以上， 病程早 期双相体温热型， 眼、 鼻、 消化道等粘膜炎症， 随后以支气管炎、 卡他性肺炎、 胃肠炎为特征。 病后期可见有神经症状出现如痉挛、 抽搐， 部分病例可出现鼻部和角垫高度角化， 并可继发 肺炎、 肠炎等症状 ( 文献 2)。传染源主要是病犬、 病兽和带毒动物。

10、， 其中患犬瘟热的病犬是 最危险的传染源。 主要是通过患病动物的眼、 鼻分泌物、 唾液、 尿和粪便排出病毒(文献3)。 快速诊断该病对控制犬瘟热病的大规模流行有着积极的意义。 0003 水貂肠炎细小病毒病 （Mink enteritis） 是由细小病毒科细小病毒属水貂肠炎细 小病毒 （MEV） 引起的以剧烈腹泻为主要临床特症的急性、 烈性和高度接触性传染病 ( 文献 4)。病毒颗粒无囊膜， 直径约 25 nm， 整个病毒粒子呈 20 面体对称， 基因组为单分子线状 DNA， 大小约为5.0 kb(文献5)， 病毒只有一个血清型。 病毒大量的存在于病貂的肝脏、 脾脏 及肠道， 并从粪便大量排出。。

11、 病貂、 带毒貂是主要传染源， 病毒主要通过病貂的粪便、 尿液和 各种分泌物散播。本病主要发生在夏季， 近年来有推延到秋季的趋势。貂群一旦感染， 如不 采取措施， 会引起地方性、 周期性流行， 通常会在翌年分窝前后的幼貂群中再次发生。快速 诊断该病可有效地控制水貂细小病毒性肠炎的流行。 0004 水貂阿留申病 （Mink aleutian disease） 是由水貂阿留申病毒 (MADV) 引起的水 貂接触性、 慢性、 进行性传染病。主要侵害网状内皮细胞系统。以浆细胞增多， 血丙种球蛋 白增高， 持续性病毒血症， 免疫复合物造成的肾小球肾炎和肝炎， 贫血及进行性衰竭为特征 ( 文献 6)。水貂。

12、的遗传类型与本病的易感性有密切关系， 蓝宝石彩貂发病率较高。本病传 入貂群， 开始多呈隐形流行， 随着时间的延长和病貂的积累， 表现出地方性流行， 造成严重 损失 ( 文献 7)。建立定期检疫制度是净化貂群、 消灭阿留申病的最好途径， 阳性 （感染） 貂 严格淘汰， 如此检测数年， 可达到基本净化的目的。 0005 近年来随着毛皮动物 （水貂等） 养殖业的不断发展， 以具备相当数量的产业化规 模。同时作为水貂养殖业的 3 大疫病 ： 犬瘟热病、 肠炎细小病毒病、 阿留申病已在主要养殖 区域大规模流行与传播， 严重影响毛皮动物养殖业发展， 对农业经济发展、 社会稳定和人类 健康也带来不良影响。这。

13、 3 种疫病的常规诊断方法是病毒分离鉴定、 血凝实验、 琼脂扩散试 验、 对流免疫电泳和动物感染实验等 ( 文献 8-10)， 这些方法都存在敏感性低， 特异性不足， 操作费时费力等局限性。因此， 建立一种快速、 敏感、 特异、 简便的同时检测这 3 种病毒的分 说 明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A2/6 页 4 子生物学方法有着重要的意义， 并对病毒的复合感染诊断有着积极的帮助。 0006 参考文献 1 杨应丽 . 犬瘟热病毒研究进展 . 河北农业科学 .2006.（4） ： 99-102. 2 高大潮 . 犬瘟热病的诊治 . 现代农业科技 .2009（9）。

14、 ： 255. 3 赵新龙 . 犬瘟热病流行特点和诊治 . 中国畜禽种业 .2009（12） ： 92 4 闫 喜 军，柴 秀 丽，吴 威，等 . 水 貂 肠 炎 细 小 病 毒 分 离 鉴 定 . 畜 牧 与 兽 医 .2007(3):52-52 5张海玲， 闫喜军， 柴秀丽， 等.水貂肠炎细小病毒PCR检测方法的建立和应用.特产研 究 .2007(2):1-3 6 马建， 华育平 . 水貂阿留申病发病机理的研究进展 . 动物医学进展 .2005(1):39-42 7 王 克 祥，刘 永 逵，孙 宏 磊 . 水 貂 阿 留 申 病 的 研 究 进 展 . 中 国 畜 牧 兽 医 .2010(。

15、12):223-225 8 肖 家 美， 程 世 鹏， 赵 艳 . 水 貂 阿 留 申 病 诊 断 方 法 的 研 究 进 展。 特 产 研 究 .2007(2):70-72 9王好， 张宇， 钱爱东.犬瘟热诊断方法的研究进展.畜牧与饲料科学.2009 （10） ： 67-69 10 刘剑郁 . 犬细小病毒诊断研究进展 . 养犬 .2007（2） ： 8-10 发明内容 本发明的主要目的是提供一种能同时检测包括水貂犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和阿留 申病毒的三重 PCR 试剂盒 ； 本发明的另一目的是提供这种检测试剂的制备方法。 0007 本发明的技术方案是这样实现的 ： 检测犬瘟热病毒、 肠炎。

16、细小病毒和水貂阿留申 病毒的三重 PCR 试剂盒包括 3 对特异性引物， CDV， MEV， ADV 各自的扩增目标长度为 335bp、 553bp 和 451bp， 引物序列为 ： CDV 引物 ： CDV-P1 5 -GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3 CDV-P2 5 -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3 MEV 引物 ： MEV-P1 5 -AACTGGGCGGAGCCTAAA-3 MEV-P2 5 -CAGAGCGAAGATAAGCAG-3 ADV 引物 ： ADV-P1 5 -GAAACCACGGTGGAGACA-3 ADV-P2 5 -AAGAGTTG。

17、ACCTGGAGGG-3 为了达到更好的检测效果， 本发明试剂盒还带有 3 个阳性对照质粒， 包括 ： CDV 阳性对 照质粒 ； MEV 阳性对照质粒和 ADV 阳性对照质粒。并另外包含 1 个阴性对照。 0008 其中， 所述的 3 个阳性对照质粒的制作方法为 ：（1） 以犬瘟热 CDV3 株的 cDNA 为 模板， 以 CDV-P1 和 CDV-P2 为引物进行 PCR 扩增， 得到 335bp 的扩增产物， 回收并纯化后克 隆至 pMD18-T 载体， 得到 CDV 阳性对照质粒 ；（2） 以水貂肠炎细小病毒 MEVB 株的 DNA 为模 板， 以 MEV-P1 和 MEV-P2 为引。

18、物进行 PCR 扩增， 得到 553bp 的扩增产物， 回收并纯化后克隆 至 pMD18-T 载体， 得到 MEV 阳性对照质粒 ；（3） 以水貂阿留申病毒 ADV-G 株的 DNA 为模板， 以 ADV-P1 和 ADV-P2 为引物进行 PCR 扩增， 得到 451bp 的扩增产物， 回收并纯化后克隆至 说 明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A3/6 页 5 pMD18-T 载体， 得到 ADV 阳性对照质粒。 0009 所述的阴性对照是蒸馏水。 0010 所述的 DNA 聚合酶为 rTaq DNA 聚合酶。 0011 本发明试剂盒在检测犬瘟热病毒、 肠炎细小。

19、病毒、 水貂阿留申病毒中的应用 ： 25L 反应体系 ： rTaq DNA 聚合酶 2.0U ； dNTPs (2.5mmol/) 2.0L ； 引物 CDV-P1 以及 CDV-P2， MEV-P1 以及 MEV-P2， ADV-P1 以及 ADV-P2 各 10pmol ； 10 倍 PCR Buffer2.5L ； 待测 模板 2.0L， 其余的由蒸馏水补充至 25L。 0012 PCR 反应程序为 ： 95 5min ； 94 45s， 55 30s， 72 30s， 30 个循环 ； 72 10min。 0013 判定结果 ： 如果从待检测的样品中扩增到了 335bp 片段， 则该检。

20、测样品含有犬瘟 热病毒 ； 如果从待检测的样品中扩增到了 553bp 片段， 则该检测样品含有肠炎细小病毒 ； 从 待检测的样品中扩增到了 451bp 片段， 则该检测样品含有水貂阿留申病毒。如果同时检测 到 2 个或者 3 个目标大小条带， 则该检测样品同时含有该目标代表的病毒。 0014 本发明的积极效果是 1 根据病毒基因组的保守基因序列设计引物， 得到了检测包括犬瘟热病毒、 肠炎细小 病毒和水貂阿留申病毒的三重 PCR 试剂盒。与常规的 PCR 方法相比采用本发明的试剂盒 可以在同一反应体系中检测是否含有犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒核酸， 具有较高的特异性和敏感性， 具有。

21、同时检测和鉴别 3 种毛皮动物最常见的病毒性疾病等特 点， 可以对毛皮动物兽群中隐形感染或者持续带毒宿主和发病动物进行准确检测。 0015 2 本项发明中的三重 PCR 试剂盒可对细胞培养物、 组织、 分泌液、 血液等多种样品 的CDV、 MEV和ADV进行快速检测， 样品适用范围广， 试剂盒提供的试剂中， 无感染性、 无生物 安全隐患成分， 使用安全性很高。 0016 3 本项发明中的试剂所组成的试剂盒可在收到样品 6 小时候进行定性诊断结果， 为诊断毛皮动物 （水貂等） 的犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒感染提供有效工 具。 附图说明 0017 图1本发明三重PCR试剂盒的特异性。

22、检测;1-8 ： ADV检测结果 ； CDV检测结果 ； MEV 检测结果 ； ADV 与 CDV 混合后的检测结果 ； MEV 和 ADV 混合后的检测结果 ； MEV 和 CDV 混合后 的检测结果 ； MEV、 ADV、 CDV 混合后的检测结 ； 阴性对照结果 ； M ： DL2000 Marker 图 2 本发明三重 PCR 试剂盒的敏感性检测 CDV 检测浓度分别为 10ng/L1.0pg/L ； MEV 检测浓度为 10ng/L100 pg/L ； ADV 检测浓度为 10ng/L10 pg/L。 0018 图 3 本发明三重 PCR 试剂盒的病毒样品检测 ； 1-3 ： CDV。

23、 病毒检测结果 ； MEV 病毒 检测结果 ； ADV 病毒检测结果 ； M ： DL2000 Marker 图 4 本发明三重 PCR 试剂盒的病毒样品检测 ； 1 ： CDV 病毒检测阳性结果 ； 2 ： 病毒临床 检测 CDV 强阳性结果 ； 3 ： 病毒临床检测 CDV 弱阳性结果 ； 4 ： 病毒临床检测 CDV 阴性结果 ； M ： DL2000 Marker 图5 本发明三重PCR试剂盒的病毒样品检测 ； 1 ： ADV病毒检测阳性结果 ； 2 ： CDV病毒检 测阳性结果 ； 3 ： CDV和ADV病毒混合的阳性结果 ； 4， 7 ： 临床样品中CDV和ADV混合感染的阳 说 。

24、明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A4/6 页 6 性结果 ； 5， 6 ： 临床样品中的阴性结果 ； M ： DL2000 Marker 具体实施方式 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而更为 清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0019 实施例 1 1 材料与方法 1.1 病毒株 CDV3、 MEVB 和 ADV-G 均由中国农业科学院特产研。

25、究所提供 ； M-MLV 反转录 酶、 rTaq DNA聚合酶、 dNTPS、 DNA Marker DL2000、 pMD18-T载体等均购自宝生物工程(大 连 ) 有限公司， 胶回收试剂盒均购自上海华舜生物技术有限公司， 病毒 RNA 提取试剂购置 Invitrogen 公司。 0020 1.2 阳性对照重组质粒的构建 根据 CDV3 病毒株 N 基因设计检测 CDV 病毒特异性引物 CDV-P1 5 -GATAAAGCATGTCAT TATAGTCCTAA-3 ； CDV-P2 5 -CTTGAGCTTTCGACCTTC-3 ， 扩增片段长度为 335bp。利用 Vero 细胞增殖 CD。

26、V3 种毒， 培养 3 天后参照病毒 RNA 提取试剂 （Invitrogen 公司） 提取总 RNA， 以 反转录产物为模板扩增 CDV 335 片段。PCR 反应条件为 ： 95 5min ； 94 45s， 55 30s， 72 30s， 30 个循环 ； 72 10min。将目的片段回收纯化后， 利用 pMD18-T 载体构建重组质 粒， 命名为 CDV 阳性对照质粒。送 Invitrogen 公司进行测序。 0021 MEV 和 ADV 经处理提取病毒 DNA 后， 其阳性对照质粒构建方法同 CDV 阳性对照质 粒。 0022 1.3 三重 PCR 反应条件的优化 25pL 反应体系。

27、中， 以 CDV、 MEV 和 ADV 阳性对照质粒 ( 浓度均为 100ng/L) 混合 物为模板， 采用先固定引物对 CDV-P1/CDV-P2 的浓度， 在 1pmol/L-10pmol/L 之间调 整引物对 MEV-P1/MEV-P2 的摩尔量， 同时将退火温度在 48-62进行优化， 每 2递增。在 此基础上进一步优化引物对 ADV-P1/ADV-P2 的摩尔量及退火温度， 最终确定三重 PCR 的最 佳引物浓度比和退火温度。 0023 1.4 三重 PCR 的特异性实验 分别以 CDV、 MEV 和 ADV 阳性对照质粒以及阴性对照水为模板， 进行三重 PCR 的特异性 实验 ； 。

28、另外以 CDV 和 MEV 的阳性对照质粒混合物、 CDV 和 ADV 的阳性对照质粒混合物、 MEV 和 ADV 的阳性对照质粒混合物， CDV、 MEV 和 ADV 阳性对照质粒混合物为模板， 进行三重 PCR 的 特异性实验， 对其混合模板进行三重 PCR 的特异性进行检验。 0024 1.5 三重 PCR 的敏感性实验 以不同浓度的 CDV、 MEV 和 ADV 阳性对照质粒为模板 （100ng/L-1.0pg/L） ， 进行三重 PCR 的敏感性实验。 0025 2 实验结果 2.1 重组质粒的建立 CDV、 MEV 和 ADV 重组质粒经过测序后， 进行核酸比对发现， 相关基因的核。

29、酸同源性达到 99% 以上。表明所获得的重组质粒均为阳性质粒。 说 明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A5/6 页 7 0026 2.2 三重 PCR 最佳反应条件的确定 经过对反应浓度和退火温度的条件的优化， 确定在 25pL 反应体系中， rTaq DNA 聚合 酶 2.0U ； dNTPs (2.5mmol/) 2.0L ； 引物CDV-P1以及CDV-P2， MEV-P1以及MEV-P2， ADV-P1 以及 ADV-P2 各 10pmol ； 10 倍 PCR Buffer2.5L ； 待测模板 2.0L， 其余的由蒸馏水补充 至 25L。PCR 反应程。

30、序为 ： 95 5min ； 94 45s， 55 30s， 72 30s， 30 个循环 ； 72 10min。 0027 2.3 三重 PCR 特异性实验 CDV、 MEV 和 ADV 阳性对照质粒分别出现其对应的 335bp、 553bp、 451bp 条带， 混合后的 样品也能出现相对应的多个条带， 阴性对照蒸馏水未扩增出任何条带。如图 1 所示。 0028 2.4 三重 PCR 敏感性实验 实验结果如图2所示， CDV 最低检测浓度为1.0pg/L ； MEV最低检测结果为100 pg/L ； ADV 检测结果为 10 pg/L。 0029 实施例 2 利用犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒。

31、和水貂阿留申病毒的三重 PCR 方法对病毒样品检测 1 材料与方法 1.1 病毒株 CDV3、 MEVB 和 ADV-G 均由中国农业科学院特产研究所提供 ； M-MLV 反转录 酶、 rTaq DNA 聚合酶、 dNTPS、 DNA Marker DL2000、 等均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公 司， 病毒 RNA 提取试剂购置 Invitrogen 公司。 0030 1.2 病毒核酸模板制备 （RNA 及 DNA 的提取） 参照病毒 RNA 提取试剂 （Invitrogen 公司） 提取病毒株 CDV3 的总 RNA， 并利用 M-MLV 反 转录酶进行反转录， 提取其 cDNA 。

32、作为犬瘟热病毒 PCR 模板使用。MEVB 和 ADV-G 毒株的 DNA 直接使用沸水裂解法， 即将其放入水浴中 5min， 冷却后可直接作为肠炎细小病毒和阿留申 病毒模板。 0031 1.3 三重 PCR 反应 将 CDV、 MEV 和 ADV 病毒提取的核酸为模板， 分别加入到包含混合引物的三重 PCR 体系 中， 使用三重 PCR 最佳反应条件对病毒模板进行检测。 0032 2 试验结果 2.1 三重 PCR 对病毒模板的检测结果 CDV、 MEV 和 ADV 病毒分别出现其对应的 335bp、 553bp、 451bp 条带， 如图 3 所示。 0033 实施例 3 利用犬瘟热病毒、。

33、 肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重 PCR 方法对犬瘟热病毒临床 样品检测 1 材料与方法 1.1 病毒株CDV3由中国农业科学院特产研究所提供 ； M-MLV反转录酶、 rTaq DNA聚合 酶、 dNTPS、 DNA Marker DL2000 等购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 病毒 RNA 提取试剂 购置 Invitrogen 公司。 0034 1.2 病毒核酸模板制备 （RNA 的提取） 参照病毒 RNA 提取试剂 （Invitrogen 公司） 提取病毒株 CDV3 以及犬瘟热临床样本的总 RNA， 并利用 M-MLV 反转录酶进行反转录， 提取其 cDNA 作为犬瘟热病。

34、毒 PCR 模板使用。 说 明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A6/6 页 8 0035 1.3 三重 PCR 反应 将病毒株 CDV3 和犬瘟热临床样本提取的核酸为模板， 分别加入到包含混合引物的三 重 PCR 体系中， 使用三重 PCR 最佳反应条件对病毒模板进行检测。 0036 2 试验结果 2.1 三重 PCR 对病毒模板的检测结果 病毒株 CDV3 和疑似犬瘟热临床样本出现其对应的 335bp 条带， 阴性则无任何条带， 。 0037 实施例 4 利用犬瘟热病毒、 肠炎细小病毒和水貂阿留申病毒的三重 PCR 方法对包含犬瘟热病 毒和水貂阿留申病毒及其混合。

35、感染临床样本检测 1 材料与方法 1.1 病毒株 MEVB 和 ADV-G 均由中国农业科学院特产研究所提供 ； M-MLV 反转录酶、 rTaq DNA 聚合酶、 dNTPS、 DNA Marker DL2000 等均购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司， 病 毒 RNA 提取试剂购置 Invitrogen 公司。 0038 1.2 病毒核酸模板制备 （RNA 或者 DNA 的提取） 参照病毒 RNA 提取试剂 （Invitrogen 公司） 提取病毒株 CDV3 的总 RNA， 并利用 M-MLV 反 转录酶进行反转录， 提取其 cDNA 作为犬瘟热病毒 PCR 模板使用。ADV-G 毒。

36、株的 DNA 直接使 用沸水裂解法， 即将其放入水浴中 5min， 冷却后可直接作为犬瘟热病毒和水貂阿留申病毒 模板。 0039 1.3 三重 PCR 反应 将 CDV 和 ADV 病毒以及临床样本提取的核酸为模板， 分别加入到包含混合引物的三重 PCR 体系中， 使用三重 PCR 最佳反应条件对病毒模板进行检测。 0040 2 试验结果 2.1 三重 PCR 对病毒模板的检测结果 MEV和ADV病毒分别出现其对应的335bp、 451bp条带， 混和后的两种病毒和混合感染的 临床样本同时出现 335bp 和 451bp 两条带， 阴性则无任何条带， 如图 5 所示。 说 明 书 CN 102181581 A CN 102181584 A1/4 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102181581 A CN 102181584 A2/4 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 102181581 A CN 102181584 A3/4 页 11 图 4 说 明 书 附 图 CN 102181581 A CN 102181584 A4/4 页 12 图 5 说 明 书 附 图 CN 102181581 A 。