多疣壁虎Hoxc10蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102206647 A (43)申请公布日 2011.10.05 CN 102206647 A *CN102206647A* (21)申请号 201110113360.9 (22)申请日 2011.05.04 C12N 15/12(2006.01) C12N 15/70(2006.01) C07K 14/435(2006.01) C07K 16/18(2006.01) C07K 16/06(2006.01) (71)申请人 南通大学 地址 226019 江苏省南通市啬园路 9 号 (72)发明人 顾星星 周晓芳 陈海莲 陆仁飞 (74)专利代理机构 南通市永通专利事务。

2、所 32100 代理人 葛雷 (54) 发明名称 多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆 抗体制备方法 (57) 摘要 本发明公开了多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体 外表达及多克隆抗体制备方法， 包括多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列的获得， RACE 法获得 Hoxc10 全长序列， 采用 DNASTAR 软件和 SWISS-PLOT 在线 预测多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的抗原表位， 选取优势 表位肽段构建 Hoxc10 的原核表达载体， 体外诱导 融合蛋白表达， 融合蛋白的纯化及多克隆抗体的 制备等步骤。本发明以 pGEX-4T1 为基础所构建 的体外 Hoxc10 表达系。

3、统在 BL21 中能高效地表达 目的蛋白， 进一步进行纯化， 可方便地获得大量的 GST-Hoxc10 融合蛋白， 经此蛋白免疫新西兰大白 兔所制备的兔源抗多疣壁虎 Hoxc10 抗血清滴度 高、 特异性好。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 5 页 CN 102206650 A1/2 页 2 1. 一种多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法， 其特征是 ： 包括下列 步骤 ： （1） 多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列的获得 ： 根据同源比对小鼠、 人、 鸡物种 Hoxc10。

4、 基因序列， 设计一对简并引物， 序列如下 ： 上游引物 F: 5 -TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3 ; 下游引物 R: 5 - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3 , 基因克隆获得多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列 ； （2） 多疣壁虎 Hoxc10 全长序列获得 ： RACE 法获得多疣壁虎 Hoxc10 的 5 cDNA 和 3 cDNA 序列， 与 EST 序列拼接后得到多 疣壁虎Hoxc10全长序列， 共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp， 共编码376个氨基酸 ； 经生物学相关分析确认为多疣壁虎 Hoxc10 基因， 。

5、GenBank 登陆号 ： GQ267528.1 ； （3）使用 DNA STAR 软件和 SWISS-PLOT 在线预测多疣壁虎 Hoxc10 抗原表位， 选取 96-191 片段为免疫肽段， 对应 397-684 核苷酸序列 ； （4） 构建 Hoxc10 的原核表达载体 ： 设计构建 Hoxc10 原核表达载体的引物， 上游引物 5 端加上 Xho 酶切位点及其保护 碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 5 - CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3 ; 下游引物在其 5 端加上 EcoR 酶切位点及 其保护碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 5 - C。

6、CGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3 ； 取多疣壁虎脑及脊髓组织， 用Trizol试剂法提取总RNA ； RT-PCR扩增 ： 用QIAGEN公司逆转 录试剂盒及 2g 总 RNA 进行逆转录反应， 合成 cDNA ； 采用原核表达引物， 以合成的 cDNA 为 模板进行多疣壁虎 Hoxc10 的对应蛋白表位优势肽段 96-191 的 397-684 核苷酸序列， PCR 扩增 ； 用限制性内切酶Xho、 EcoR消化Hoxc10的PCR产物和pGEX-4T1原核表达载体质 粒， 并进行酶切产物的胶回收 ； 连接 ： 用 T4 DNA 连接酶将 PCR 酶切回收产物和 pG。

7、EX-4T1 原 核表达载体质粒的酶切回收产物连接 ； 感受态细胞的制备 ： 用无菌接种棒从 -70保存的 DH5 菌株中蘸菌液划无氨苄青霉素 LB 琼脂板， 37培养过夜后挑取单个克隆接种于 5ml LB 培养基中， 置细菌培养摇床中于 37、 250 转 / 分震荡培养 12 小时 ； 取 0.5ml 该菌液接 种于无氨苄青霉素 100ml LB 液体培养基中， 37震荡培养 2-2.5 小时， 至 OD600为 0.4-0.5 时， 放置于 4冰箱冷却 1-2 小时 ； 将培养液分入两个 50ml 离心管中， 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 用冰浴的 0.1M MgCl2 。

8、25ml 悬浮 30 分钟 ； 4离心， 4000g10 分钟， 弃 去上清， 加入冰浴的 0.1M CaCl2- 甘油溶液 1ml 悬浮 ； 以 100l/ 管分装入 1.5ml 离心管 中， -70冻存备用 ； 重组质粒的转化 ： 取 5l DNA 连接产物加入 100l 感受态细胞中， 轻 轻旋转数次使 DNA 分散均匀， 冰浴 30 分钟， 42水浴中热休克 90 秒， 继续冰浴 2-3 分钟后 加入LB培养基200l， 于37摇孵育60分钟， 将培养物涂于含氨苄青霉素的1.5%琼脂LB 平板， 待胶表面没有液体流动时， 37温箱倒置培养 12-16 小时 ； 重组克隆的筛选及酶切鉴 。

9、定 ： 从上述培养板中挑取 6 个克隆接种于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37震荡培养 过夜， 以碱裂解法小量提取质粒DNA， 限制性内切酶消化1小时， 电泳鉴定DNA目的片断是否 正确构建于表达载体中 ； 将双酶切鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定， 其测序结果序列 与基因库中 397-684 核苷酸序列完全一致 ： 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 权 利 要 求 书 CN 102206647 A CN 102206650 A2/2 页 3 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAA。

10、AAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG ； （5）目的蛋白的表达 ： 制备 BL21 感受态细胞 ； 用鉴定正确的 pGEX-4T1-Hoxc10 重 组质粒转化 BL21 感受态细。

11、胞， 挑取含重组质粒的菌体单斑至含氨苄青霉素 50mg/L 的 2ml LB 培养基中 37震荡培养过夜 ； 将 1ml 菌液加入到含 50ml LB 培养基的 1000ml 培 养瓶中， 37震荡培养至 OD600为 0.6， 取 1ml 菌液作为未诱导的对照组， 余下菌液中加入 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时 ； 同时以转化了 pGEX-4T1 载体的 BL21 细菌作阴性对照 ； 将诱导、 末诱导的含 pGEX-4T1 载体的 BL21 菌液各 1ml， 室温 10000g 离心 1 分钟， 弃去上清， 0.01M PBS 500ml。

12、 重悬， 加入等体积 2 SDS 电 泳上样缓冲液， 100煮沸 5 分钟， 然后以 12000g 离心 1 分钟， 在 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 中各加入 20l 悬液， 电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、 脱色后检测融合蛋白表达情况 ； （6）目的蛋白的纯化 ： 证实有目的蛋白表达后， 将 20ml 转化了 pGEX-4T1-Hoxc10 的 BL21 细菌接种到 1000ml LB 培养基中进行扩大培养， 37震荡培养至 OD600为 0.6， 加入异 丙基 -D- 硫代半乳糖苷至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时， 菌液离心， 超声破碎 后， 用GE healt。

13、hcare公司的glutathione sepharose吸附GST-Hoxc10融合蛋白 ； 用10 mM 的还原型 GSH 洗脱 glutathione sepharose， 将洗脱液放入预处理的透析袋中， 夹紧， 放入 去离子水中， 4透析 24 小时， 收集透析后的液体 ； 用 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶检测经过洗 脱、 透析后的 GST-Hoxc10 融合蛋白 ； （7） 多克隆抗体的制备 ： 参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书， 定量透析后蛋白质的浓 度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫 ： 第一次免疫， 每只兔子用 1 mg 融合蛋白， 加入等 体积的Freud s完全佐剂。

14、乳化完全， 于皮下多点免疫 ； 第一次免疫24天后进行第二次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫 ； 第一次免 疫 42 天后进行第三次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 不完全佐剂乳化完全 进行皮下多点免疫 ； 第三次免疫 10 天后， Elisa 检测 Hoxc10 抗血清达到效价后， 心脏取血， 免疫血清储存于 -80备用 ； 使用制备的 Hoxc10 抗血清对细菌目的蛋白条带和动物组织中 的 Hoxc10 蛋白进行检测， 确定抗血清的特异性， 并用于多克隆抗体的纯化。 2. 根据权利要求 1 所述的多疣。

15、壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法， 其特征是 ： 制备BL21感受态细胞的方法是 ： 用无菌接种棒从-70保存的BL21菌株中蘸菌 液划无氨苄青霉素 LB 琼脂板， 37培养过夜后挑取单个克隆接种于 5ml LB 培养基中， 置 细菌培养摇床中于 37、 250 转 / 分震荡培养 12 小时 ； 取 0.5ml 该菌液接种于无氨苄青霉 素 100ml LB 液体培养基中， 37震荡培养 2-2.5 小时， 至 OD600为 0.4-0.5 时， 放置于 4冰 箱冷却 1-2 小时 ； 将培养液分入两个 50ml 离心管中， 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 。

16、用冰浴的 0.1M MgCl2 25ml 悬浮 30 分钟 ； 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 加入冰浴的 0.1M CaCl2- 甘油溶液 1ml 悬浮 ； 以 100l/ 管分装入 1.5ml 离心管中， -70冻存备用。 权 利 要 求 书 CN 102206647 A CN 102206650 A1/6 页 4 多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。 背景技术 0002 同源异型框基因 (homeobox gene， Hox)， 编码一个高度保守的转录因子家。

17、系， 这些 转录因子在胚胎发育的形态发生中起关键作用， 能够维持正常的体节形成 , 菱脑原节形成 和发育， 以及后脑和各个器官、 组织及四肢的正常的分化和发育。Hoxc10 是 Hox 基因家族 中一位重要的成员。已有研究表明， Hoxc10 不仅影响脊椎动物的胚胎发育， 尤其是神经系 统发育， 同时也影响脊椎动物的断肢及尾部的再生过程。市场上多是针对小鼠、 人及大鼠 Hoxc10 的抗体， 这些抗体与羊、 兔、 猴等有一定的交叉反应， 针对多疣壁虎的 Hoxc10 蛋白高 特异性、 高滴度的抗体目前还没有。为进一步探究 Hoxc10 在多疣壁虎断尾再生过程中的作 用及其他相关生物学功能， 本。

18、专利拟制备兔源抗多疣壁虎 Hoxc10 抗体。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种能大量制备出高质量的抗多疣壁虎 Hoxc10 蛋白抗体 的多疣壁虎 Hoxc10 蛋白的体外表达及多克隆抗体制备方法。 0004 本发明的技术解决方案是 ： 步骤 1） 、 多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列的获得 根据同源比对小鼠、 人、 鸡等物种 Hoxc10 基因序列， 设计一对简并引物， 序列如下 ： 上游引物 F: 5 -TGTCTCTCAACACCTACCCATC-3 ; 下游引物 R: 5 - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3 , 基因克隆获得多疣壁虎 Hox。

19、c10 的 EST 序列。 0005 步骤 2） 、 多疣壁虎 Hoxc10 全长序列获得 RACE 法获得多疣壁虎 Hoxc10 的 5 cDNA 和 3 cDNA 序列， 与 EST 序列拼接后得到多 疣壁虎Hoxc10全长序列， 共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp， 共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎 Hoxc10 基因。GenBank 登陆号 ： GQ267528.1 步骤 3） 、 使用 DNA STAR 软件和 SWISS-PLOT 在线预测多疣壁虎 Hoxc10 抗原表位， 通过 综合分析发现 Hoxc10 抗原表位极有可能位于氨基酸 4-。

20、6,21-24,27,29-30,36-42,45,57,7 2-73,78-81,83-85,99, 131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234, 240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。 0006 本专利选取含有预测抗原表位较多的 96-191 片段为免疫肽段 ( 对应 397-684 核 苷酸序列 )。 0007 步骤 4） 、 构建 Hoxc10 的原核表达载体 1. 设计构建 Hoxc10 原核表达载体的引物， 上游引。

21、物 5 端加上 Xho 酶切位点及其保 护碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A2/6 页 5 5 - CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3 ; 下游引物在其 5 端加上 EcoR 酶切位点及 其保护碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 5 - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3 ； 2. 取多疣壁虎脑， 脊髓及部分其他组织， 用 Trizol 试剂法提取总 RNA ； 3. RT-PCR 扩增 ： 用 QIAGEN 公司逆转录试剂盒及 2g 总 RNA 进行逆转录反。

22、应， 合成 cDNA ； 4. 采用原核表达 引物， 以合成的 cDNA 为模板进行多疣壁虎 Hoxc10 的 397-684 核苷酸序列 （对应蛋白表位 优势肽段 96-191) PCR 扩增 ； 5. 用限制性内切酶 Xho 、 EcoR 消化 Hoxc10 的 PCR 产物 和 pGEX-4T1 原核表达载体质粒， 并进行酶切产物的胶回收。6. 连接 ： 用 T4 DNA 连接酶将 PCR 酶切回收产物和 pGEX-4T1 原核表达载体质粒的酶切回收产物连接 ； 7. 感受态细胞的 制备 ： 用无菌接种棒从 -70保存的 DH5 菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素 LB 琼脂板， 37培养过。

23、夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中， 置细菌培养摇床中于37、 250转/ 分震荡培养 12 小时。取 0.5ml 该菌液接种于无氨苄青霉素 100ml LB 液体培养基中， 37 震荡培养 2-2.5 小时， 至 OD600为 0.4-0.5 时， 放置于 4冰箱冷却 1-2 小时。将培养液分入 两个 50ml 离心管中， 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 用冰浴的 0.1M MgCl2 25ml 悬浮 30分钟。 4离心， 4000g10分钟， 弃去上清， 加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。 以 100l/ 管分装入 1.5ml 离心管中， -70冻存。

24、备用。8. 重组质粒的转化 ： 取 5l DNA 连接产物加入 100l 感受态细胞中， 轻轻旋转数次使 DNA 分散均匀， 冰浴 30 分钟， 42水 浴中热休克 90 秒， 继续冰浴 2-3 分钟后加入 LB 培养基 200l， 于 37缓摇孵育 60 分钟， 将培养物适量涂于 1.5% 琼脂 LB 平板 （含氨苄青霉素） ， 待胶表面没有液体流动时， 37温箱 倒置培养 12-16 小时 ； 9. 重组克隆的筛选及酶切鉴定 ： 从上述培养板中挑取 6 个克隆接种 于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37震荡培养过夜， 以碱裂解法小量提取质粒 DNA， 限 制性内切酶消化1小时，。

25、 电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中 ； 10. 将双酶切 鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定， 其测序结果序列与基因库中 397-684 核苷酸序列完 全一致。 0008 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTGAATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATG。

26、GAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG 步骤5） 、 目的蛋白的表达 ： BL21感受态细胞的制备 （方法同上述DH5感受态细胞的制 备） 。 用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重组质粒转化BL21感受态细胞， 挑取含重组质粒的菌 体单斑至 2ml LB 培养基 （含氨苄青霉素 50mg/L） 中 37震荡培养过夜。将 1ml 菌液加入 到含 50ml LB 培养基的 1000ml 培养瓶中， 37震荡培养至 OD。

27、600为 0.6 左右， 取 1ml 菌液作 为未诱导的对照组， 余下菌液中加入异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 （IPTG） 至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时。同时以转化了 pGEX-4T1 载体的 BL21 细菌作阴性对照。将诱导、 末诱导的含 pGEX-4T1 载体的 BL21 菌液各 1ml， 室温 10000g 离心 1 分钟， 弃去上清， 0.01M PBS 500ml 重悬， 加入等体积 2 SDS 电泳上样缓冲液， 100煮沸 5 分钟， 然后以 12000g 离心 1 分钟， 在 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶中各加入 20l 悬液， 电泳结束后凝胶经考马。

28、斯亮 蓝染色、 脱色后检测融合蛋白表达情况 ； 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A3/6 页 6 步骤 6） 、 目的蛋白的纯化 ： 证实有目的蛋白表达后， 将 20ml 转化了 pGEX-4T1-Hoxc10 的 BL21 细菌接种到 1000ml LB 培养基中进行扩大培养， 37震荡培养至 OD600为 0.6 左右， 加入异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 （IPTG） 至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时。菌液 离心， 超声破碎后， 用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose 吸附 GST-Ho。

29、xc10 融 合蛋白。 用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose， 将洗脱液放入预处理的透析 袋中， 夹紧， 放入去离子水中， 4透析 24 小时， 收集透析后的液体。用 12% SDS 聚丙烯酰胺 凝胶检测经过洗脱、 透析后的 GST-Hoxc10 融合蛋白。 0009 步骤 7） 、 多克隆抗体的制备 ： 参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书， 定量透析后蛋 白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫， 每只兔子用 1 mg 融合蛋 白， 加入等体积 (1 ml) 的 Freud s 完全佐剂乳化完全， 于皮下多点免疫 ； 第一次免疫 24 天。

30、 后进行第二次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 完全佐剂乳化完全进行皮下 多点免疫 ； 第一次免疫 42 天后进行第三次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫 ； 末次免疫 10 天后， Elisa 检测 Hoxc10 抗血清达到 效价后， 心脏取血， 免疫血清储存于-80备用。 使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白 条带和动物组织中的 Hoxc10 蛋白进行检测， 确定抗血清的特异性， 并用于多克隆抗体的纯 化。 0010 本发明所述制备的兔源抗多疣壁虎 Hoxc10 蛋白多克隆抗体， 体内外均可特异。

31、性 的与多疣壁虎 Hoxc10 蛋白相结合。 0011 本发明的优越性在于 ： 以 pGEX-4T1 为基础所构建的体外 Hoxc10 表达系统在 BL 21 中能高效地表达目的蛋白， 进一步以成熟的方法进行纯化， 可方便地获得大量的 GST-Hoxc10 融合蛋白。另外， 经此蛋白免疫新西兰大白兔所制备的兔源抗多疣壁虎 Hoxc10 抗血清滴度高、 特异性好， 完全可以满足相关实验的需要。 附图说明 0012 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 0013 图 1 是多疣壁虎 Hoxc10 优势表位肽段构建入原核表达载体的测序结果示图。 图 2 是原核表达质粒 pGEX-4T1-Hox。

32、c10 构建示图。 0014 图 3 是 GST-Hoxc10 融合蛋白的诱导表达电泳示图 图 4 是 GST-Hoxc10 经 glutathione sepharose 纯化后电泳示图 图 5 是制备的抗体与细菌表达的 Hoxc10 融合蛋白 Western Blot 结果示图 图 6 是制备的抗体与多疣壁虎各组织中的 Hoxc10 蛋白 Western Blot 结果示图 图 7 是制备的抗体与多疣壁虎脊髓组织中的 Hoxc10 蛋白免疫组化结果示图。 0015 图 3 中 M ： 低分子量蛋白标准品 ； 1 ： 未诱导的含 pGEX-4T1 质粒的细菌总蛋白 ； 2 ： 经 IPTG 。

33、诱导的含 pGEX-4T1 质粒的细菌总蛋白 ； 3 ： 未诱导的含 pGEX-4T1-Hoxc10 质粒 的细菌总蛋白 ； 4 ： 经 IPTG 诱导的含 pGEX-4T1- Hoxc10 质粒的细菌总蛋白。 0016 图 4 中 1 ： 经 glutathione sepharose 纯化后的 GST-Hoxc10 融合蛋白 ； 2 ： 未诱导 的含 pGEX-4T1 质粒的细菌总蛋白 ； 3 ： 经 IPTG 诱导的含 pGEX-4T1 质粒的细菌总蛋白 ； 4 ： 未诱导的含pGEX-4T1-Hoxc10质粒的细菌总蛋白 ； 5 ： 经IPTG诱导的含pGEX-4T1- Hoxc10 。

34、质粒的细菌总蛋白 ； 箭头表示 GST-Hoxc10 融合蛋白。 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A4/6 页 7 0017 图 5 中 1 ： 经 glutathione sepharose 纯化后 GST-Hoxc10 融合蛋白 ； 2 ： 经 IPTG 诱导的含pGEX-4T1质粒的细菌总蛋白 ； 箭头所示分别为37 kD Hoxc10 蛋白和26 kD GST 蛋白。 0018 图 6 中 1 ： 壁虎睾丸组织总蛋白 ； 2 ： 壁虎肾组织总蛋白 ； 3 ： 壁虎肺组织总蛋白 ； 4 ： 壁虎心组织总蛋白 ； 5 ： 壁虎脊髓组织总蛋白 ； 6 ： 。

35、壁虎脑组织总蛋白 ； 7 ： 壁虎肝组织 总蛋白 ； 箭头所示为 41 kD Hoxc10 蛋白。 0019 图7中A:多疣壁虎脊髓组织中TRITC标记的Hoxc10蛋白,bar=20m ； B:Hoechst 标记细胞核 , bar=20m ； C ： A 图与 B 图叠加 ,bar=20m;D: C 图矩形区域的放大， 箭头标 记 Hoxc10 蛋白 ,bar=20m。 具体实施方式 0020 步骤 1） 、 多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列的获得 根据同源比对小鼠、 人、 鸡等物种 Hoxc10 基因序列， 设计一对简并引物， 序列如下 ： 上游引物 F: 5 -TGTCTCTC。

36、AACACCTACCCATC-3 ; 下游引物 R: 5 - GTTCTCCCK(G/T)GTTCATTTTCT -3 , 基因克隆获得多疣壁虎 Hoxc10 的 EST 序列。 0021 步骤 2） 、 多疣壁虎 Hoxc10 全长序列获得 RACE 法获得多疣壁虎 Hoxc10 的 5 cDNA 和 3 cDNA 序列， 与 EST 序列拼接后得到多 疣壁虎Hoxc10全长序列， 共包含2156bp,其ORF区位于112-1242bp， 共编码376个氨基酸。 经生物学相关分析确认为多疣壁虎 Hoxc10 基因。GenBank 登陆号 ： GQ267528.1 步骤 3） 、 使用 DNA。

37、 STAR 软件和 SWISS-PLOT 在线预测多疣壁虎 Hoxc10 抗原表位， 通过 综合分析发现 Hoxc10 抗原表位极有可能位于氨基酸 4-6,21-24,27,29-30,36-42,45,57,7 2-73,78-81,83-85,99, 131-132, 136,147-149,153-154,162-165,205-206,209,211,216-217, 226,233-234, 240-241,271-274,295,301-302,308-310,337,370,372-373。 0022 本专利选取含有预测抗原表位较多的 96-191 片段为免疫肽段 ( 对应 39。

38、7-684 核 苷酸序列 )。 0023 步骤 4） 、 构建 Hoxc10 的原核表达载体 1. 设计构建 Hoxc10 原核表达载体的引物， 上游引物 5 端加上 Xho 酶切位点及其保 护碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 5 - CCGGAATTCCAACTCCCCTCCTGCTCT-3 ; 下游引物在其 5 端加上 EcoR 酶切位点及 其保护碱基和补充碱基使其不出现移码， 序列为 ： 5 - CCGCTCGAGCGGTTGCTCCAGATGCTC-3 ； 2. 取多疣壁虎脑， 脊髓及部分其他组织， 用 Trizol 试剂法提取总 RNA ； 3. RT-PCR 扩增 ： 用。

39、 QIAGEN 公司逆转录试剂盒及 2g 总 RNA 进行逆转录反应， 合成 cDNA ； 4. 采用原核表达 引物， 以合成的 cDNA 为模板进行多疣壁虎 Hoxc10 的 397-684 核苷酸序列 （对应蛋白表位 优势肽段 96-191) PCR 扩增 ； 5. 用限制性内切酶 Xho 、 EcoR 消化 Hoxc10 的 PCR 产物 和 pGEX-4T1 原核表达载体质粒， 并进行酶切产物的胶回收。6. 连接 ： 用 T4 DNA 连接酶将 PCR 酶切回收产物和 pGEX-4T1 原核表达载体质粒的酶切回收产物连接 ； 7. 感受态细胞的 制备 ： 用无菌接种棒从 -70保存的 。

40、DH5 菌株中蘸少许菌液划无氨苄青霉素 LB 琼脂板， 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A5/6 页 8 37培养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中， 置细菌培养摇床中于37、 250转/ 分震荡培养 12 小时。取 0.5ml 该菌液接种于无氨苄青霉素 100ml LB 液体培养基中， 37 震荡培养 2-2.5 小时， 至 OD600为 0.4-0.5 时， 放置于 4冰箱冷却 1-2 小时。将培养液分入 两个 50ml 离心管中， 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 用冰浴的 0.1M MgCl2 25ml 悬浮 30分钟。 4离心。

41、， 4000g10分钟， 弃去上清， 加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。 以 100l/ 管分装入 1.5ml 离心管中， -70冻存备用。8. 重组质粒的转化 ： 取 5l DNA 连接产物加入 100l 感受态细胞中， 轻轻旋转数次使 DNA 分散均匀， 冰浴 30 分钟， 42水 浴中热休克 90 秒， 继续冰浴 2-3 分钟后加入 LB 培养基 200l， 于 37缓摇孵育 60 分钟， 将培养物适量涂于 1.5% 琼脂 LB 平板 （含氨苄青霉素） ， 待胶表面没有液体流动时， 37温箱 倒置培养 12-16 小时 ； 9. 重组克隆的筛选及酶切鉴定 ： 从上述培养。

42、板中挑取 6 个克隆接种 于 5ml 含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37震荡培养过夜， 以碱裂解法小量提取质粒 DNA， 限 制性内切酶消化1小时， 电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体中 ； 10. 将双酶切 鉴定为阳性克隆的质粒进行测序鉴定， 其测序结果序列与基因库中 397-684 核苷酸序列完 全一致。 0024 1 CAACTCCCCTCCTGCTCTTTCCCGACCAATGTCAAGGAAGAAAATGCCTG 51 CTGCATGTACAACGCAGACAAAAGGGCTAAAAACGCCACCGAGGCGACCC 101 TCTACCCCAGTCAGATGCCTG。

43、AATCTTGCCTCAGTGACCATGAAGTCCCC 151 GTGCCCAGCTACTACCGCGCCAGCCAAGGTTATTCCTCCATGGAGAAGGC 201 GTCCAACTGCAACAACCCGACCGAGTTTGAGGCAACTTTCGAACCCAGGG 251 CGAGCCTCAGCCAGAGGAGTGAGCATCTGGAGCAACCG 步骤5） 、 目的蛋白的表达 ： BL21感受态细胞的制备。 用鉴定正确的pGEX-4T1-Hoxc10重 组质粒转化BL21感受态细胞， 挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB培养基 （含氨苄青霉素 50mg/L） 中 37震荡培养。

44、过夜。将 1ml 菌液加入到含 50ml LB 培养基的 1000ml 培养瓶中， 37震荡培养至 OD600为 0.6 左右， 取 1ml 菌液作为未诱导的对照组， 余下菌液中加入异丙 基 -D- 硫代半乳糖苷 （IPTG） 至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时。同时以转化了 pGEX-4T1 载体的 BL21 细菌作阴性对照。将诱导、 末诱导的含 pGEX-4T1 载体的 BL21 菌液各 1ml， 室温 10000g 离心 1 分钟， 弃去上清， 0.01M PBS 500ml 重悬， 加入等体积 2 SDS 电 泳上样缓冲液， 100煮沸 5 分钟， 然后以 120。

45、00g 离心 1 分钟， 在 12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶 中各加入 20l 悬液， 电泳结束后凝胶经考马斯亮蓝染色、 脱色后检测融合蛋白表达情况 ； 步骤 6） 、 目的蛋白的纯化 ： 证实有目的蛋白表达后， 将 20ml 转化了 pGEX-4T1-Hoxc10 的 BL21 细菌接种到 1000ml LB 培养基中进行扩大培养， 37震荡培养至 OD600为 0.6 左右， 加入异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 （IPTG） 至终浓度为 0. 2 mmol/L， 30诱导 6 小时。菌液 离心， 超声破碎后， 用 GE healthcare 公司的 glutathione sepharose。

46、 吸附 GST-Hoxc10 融 合蛋白。 用10 mM的还原型GSH洗脱glutathione sepharose， 将洗脱液放入预处理的透析 袋中， 夹紧， 放入去离子水中， 4透析 24 小时， 收集透析后的液体。用 12% SDS 聚丙烯酰胺 凝胶检测经过洗脱、 透析后的 GST-Hoxc10 融合蛋白。 0025 步骤 7） 、 多克隆抗体的制备 ： 参照 BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书， 定量透析后蛋 白质的浓度并取一定量用于新西兰大白兔的免疫。第一次免疫， 每只兔子用 1 mg 融合蛋 白， 加入等体积 (1 ml) 的 Freud s 完全佐剂乳化完全， 于皮下多点免疫 ； 。

47、第一次免疫 24 天 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A6/6 页 9 后进行第二次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 完全佐剂乳化完全进行皮下 多点免疫 ； 第一次免疫 42 天后进行第三次免疫， 使用 0.5mg 融合蛋白与等体积的 Freud s 不完全佐剂乳化完全进行皮下多点免疫 ； 末次免疫 10 天后， Elisa 检测 Hoxc10 抗血清达到 效价后， 心脏取血， 免疫血清储存于-80备用。 使用制备的Hoxc10抗血清对细菌目的蛋白 条带和动物组织中的 Hoxc10 蛋白进行检测， 确定抗血清的特异性， 并用于多克。

48、隆抗体的纯 化。 0026 制备 BL21 感受态细胞的方法是 ： 用无菌接种棒从 -70保存的 BL21 菌株中蘸菌 液划无氨苄青霉素 LB 琼脂板， 37培养过夜后挑取单个克隆接种于 5ml LB 培养基中， 置 细菌培养摇床中于 37、 250 转 / 分震荡培养 12 小时 ； 取 0.5ml 该菌液接种于无氨苄青霉 素 100ml LB 液体培养基中， 37震荡培养 2-2.5 小时， 至 OD600为 0.4-0.5 时， 放置于 4冰 箱冷却 1-2 小时 ； 将培养液分入两个 50ml 离心管中， 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 用冰浴的 0.1M MgCl2 2。

49、5ml 悬浮 30 分钟 ； 4离心， 4000g10 分钟， 弃去上清， 加入冰浴的 0.1M CaCl2- 甘油溶液 1ml 悬浮 ； 以 100l/ 管分装入 1.5ml 离心管中， -70冻存备用。 说 明 书 CN 102206647 A CN 102206650 A1/5 页 10 图 1 说 明 书 附 图 CN 102206647 A CN 102206650 A2/5 页 11 图 2 说 明 书 附 图 CN 102206647 A CN 102206650 A3/5 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102206647 A CN 102206650 A4/5 页 13 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102206647 A CN 102206650 A5/5 页 14 图 7 说 明 书 附 图 CN 102206647 A 。