一种用于儿童哮喘检测的标志物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102154494 A (43)申请公布日 2011.08.17 CN 102154494 A *CN102154494A* (21)申请号 201110060515.7 (22)申请日 2011.03.14 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军军事医学科学院基 础医学研究所 地址 100850 北京市海淀区太平路 27 号 申请人 中国疾病预防控制中心环境与健康 相关产品安全所 (72)发明人 蔡欣 徐东群 徐东刚 付文亮 邹民吉 朱泽轶 (74)专利代理机构 北京众合诚成知识产权代理 有限公司 11246 代理人 史双元 (54) 。

2、发明名称 一种用于儿童哮喘检测的标志物 (57) 摘要 本发明公开了属于儿童哮喘辅助诊断领域的 一种用于儿童哮喘检测的标志物。该标志物为采 用半定量 RT-PCR 或实时定量 PCR 的扩增产物， 扩 增引物为针对 TRPV2 基因序列的特异性引物， 扩 增模板为儿童外周血淋巴细胞中提取总 RNA 并反 转录成的 cDNA， 扩增产物的长度分别为 578bp 和 95bp。采用本发明标志物检测哮喘组儿童外周血 淋巴细胞中TRPV2基因表达水平， 与检测总IgE相 比， 其敏感性更高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书。

3、 7 页 序列表 3 页 附图 1 页 CN 102154495 A1/1 页 2 1. 一种用于儿童哮喘检测的标志物， 其特征在于， 所述标志物为采用半定量 RT-PCR 或 实时定量PCR的扩增产物， 扩增引物为针对TRPV2基因序列的特异性引物， 扩增模板为儿童 外周血淋巴细胞中提取总 RNA 并反转录成的 cDNA。 2. 一种用于儿童哮喘检测的标志物， 其特征在于， 所述半定量 RT-PCR 扩增产物的序列 如SEQ ID No.1所示， 长度为578bp， 实时定量PCR扩增产物的序列如SEQ ID No.2所示， 长 度为 95bp。 3. 根据权利要求 1 所述一种用于儿童哮喘。

4、检测的标志物， 其特征在于， 所述特异性引 物包括针对半定量 RT-PCR 的特异性引物和针对实时定量 PCR 的特异性引物。 4. 根据权利要求 3 所述一种用于儿童哮喘检测的标志物， 其特征在于， 所述针对半定 量 RT-PCR 的特异性引物为 ： 引物 f1 具有序列表中 SEQ ID No.3 的核苷酸序列， 引物 r1 具 有序列表中 SEQ ID No.4 的核苷酸序列 ； 针对实时定量 PCR 的特异性引物为 ： 引物 f3 具有 序列表中 SEQ ID No.5 的核苷酸序列， 引物 r3 具有序列表中 SEQ ID No.6 的核苷酸序列。 权 利 要 求 书 CN 1021。

5、54494 A CN 102154495 A1/7 页 3 一种用于儿童哮喘检测的标志物 技术领域 0001 本发明属于儿童哮喘辅助诊断领域， 具体涉及一种用于儿童哮喘检测的标志物。 背景技术 0002 支气管哮喘是当前世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病， 哮喘的发生可影响 人类各年龄层， 可在婴幼儿起病， 并以儿童多发。在最近的几十年， 儿童哮喘的患病率呈明 显上升的趋势， 有些国家甚至在短短10年间患病率就上升了1倍多 1。 我国1990和2000年 进行的全国儿童哮喘发病调查结果显示， 10 年间儿童哮喘患病率由 0.91上升到 1.50， 患病率上升了 64.84 2 0003 哮喘。

6、不仅严重危害儿童的健康成长， 对其整个一生的生存质量产生远期影响， 而 且给我国带来沉重的经济损失和社会负担， 影响社会稳定和国民经济的可持续发展。 0004 哮喘的病因和发病机制十分复杂， 是免疫、 遗传和环境因素综合作用的结果。 一般 认为哮喘在儿童 5 岁左右有两个发病高峰。临床上大多数患者是从隐匿发病开始， 逐渐加 重的。 如果所有的哮喘患者都能在早期得到及时地诊断与治疗， 其预后将大为改观， 同时也 会节约大量的医疗卫生资源。 0005 儿童因年龄、 生理解剖、 免疫功能、 变应原接触量、 环境情况等因素致喘， 致喘因素 复杂， 故童哮喘在发作诱因、 频度、 轻重上不同于成人 3。儿。

7、童哮喘诊断主要有以下几点难 点 ： 1、 儿童哮喘的诊断需除外其他疾病， 但要除外的疾病种类相当庞大， 需要临床工作者 丰富的工作经验和审慎的工作态度。2、 5 岁以下的儿童肺功能测定及支气管激发试验难于 开展， 加大了儿童哮喘的诊断难度。 3、 对反复喘息的认识有一定难度， 如对患儿既往喘息次 数的正确掌握应该依据医疗病历记载而并非家长主诉， 但在我国许多家长特别是来自农村 的家长对医疗病历保管不当经常遗失， 因此对患儿既往喘息情况不得而知。诊断主要依据 症状、 体征， 缺乏诊断方法和指标的金标准。特应性变应原检测、 总 IgE 和特异性 IgE 的检 测、 肺功能的检测、 支气管舒张试验和。

8、支气管激发试验 ( 后 3 项检查尤其适用于 5 岁以上儿 童 ) 对儿童哮喘的诊断具有重要的作用， 但并非所有患儿均具有上述指标异常。 0006 因 此，迫 切 需 要 更 好 的 早 期 检 测 儿 童 哮 喘 的 方 法。TRPV2 是 TRP(transientreceptor potential) 阳离子通道超家族 V 亚家族的成员 4， 是非选择性阳 离子通道， 在体内可被伤害性热刺激 ( 52 摄氏度 ) 和 TRP 激动剂激活。TRPV2 广泛分布 在所有脊髓、 脑和非神经细胞 5-8， 在脾、 肺、 肠组织及淋巴细胞中均有表达9-10， 其表达分 布表明 TRPV2 除了可感。

9、伤有害的热刺激外， 还可能具有广泛的生物学功能。研究表明， TRPV 家族成员可以被刺激性空气污染物等激活 ； 同时它的激活， 可引起感觉神经 C 纤维激活， 刺 激沿轴索上行传递， 在它的轴索神经反射范围内的其它神经原亦会激活， 可以使局部组织 出现血管扩张、 通透性增加、 炎性渗出、 黏膜水肿、 黏液分泌亢进、 支气管收缩， 即所谓的 “气 道神经源性炎症” ， 是引起哮喘发作的重要原因。因此 TRPV2 作为 TRPV 家族成员之一， 与哮 喘的发病密切相关。 说 明 书 CN 102154494 A CN 102154495 A2/7 页 4 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一。

10、种用于儿童哮喘检测的标志物。 0008 一种用于儿童哮喘检测的标志物， 其特征在于， 所述标志物为采用半定量 RT-PCR 或实时定量 PCR 的扩增产物， 扩增引物为针对 TRPV2 基因序列 (Genbank 登录号 ： NM 016113.3) 的特异性引物， 扩增模板为儿童外周血淋巴细胞中提取总 RNA 并反转录成的 cDNA。 0009 所述半定量RT-PCR扩增产物的序列如SEQ ID No.1所示， 长度为578bp， 实时定量 PCR 扩增产物的序列如 SEQ ID No.2 所示， 长度为 95bp。 0010 所述特异性引物包括针对半定量 RT-PCR 的特异性引物和针对实。

11、时定量 PCR 的特 异性引物。 0011 所述针对半定量 RT-PCR 的特异性引物为 ： 引物 f1 具有序列表中 SEQ ID No.3 的 核苷酸序列， 引物 r1 具有序列表中 SEQ ID No.4 的核苷酸序列 ； 针对实时定量 PCR 的特异 性引物为 ： 引物f3具有序列表中SEQ ID No.5的核苷酸序列， 引物r3具有序列表中SEQ ID No.6 的核苷酸序列。 0012 本发明的有益效果 ： 本发明通过标志物检测哮喘组儿童外周血淋巴细胞中 TRPV2 基因表达水平， 与检测总 IgE 相比， 其敏感性更高。本发明采用半定量 RT-PCR 和实时定量 PCR 的方法能。

12、够精确、 快速检测 TRPV2 基因的表达水平。 附图说明 0013 图 1 ： TRPV-2 在哮喘组 (A) 与正常组 (B) 半定量 RT-PCR 结果 ； 0014 其中标号 33-38 代表哮喘组实验标号， 48、 58、 59、 62、 63 代表正常组实验标号。 0015 图 2 ： TRPV-2 在哮喘组与正常组实时定量 PCR 结果。 具体实施方式 0016 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。 0017 实施例 1 ： 哮喘患儿及对照的选择 0018 按照儿童支气管哮喘诊断与防治指南 (2008 年修订 ) 的诊断标准， 在儿童医院呼 吸科， 由临床医生选择符合标。

13、准的哮喘患儿， 年龄 15 岁， 共 60 例患儿。选取与哮喘组儿 童年龄、 性别、 相匹配的健康儿童 60 例作为对照组。 0019 病例的判定依据儿童年龄选择不同的判定标准 ： 0020 婴幼儿哮喘诊断标准 ： (1)年龄3岁， 喘息发作3次 ； (2)发作时双肺闻及呼气 相哮鸣音， 呼气相延长 ； (3) 具有特应性体质， 如过敏性湿疹、 过敏性鼻炎等 ； (4) 父母有哮 喘病史或其他过敏史 ； (5) 除外其他引起喘息的疾病。凡具有 (1)、 (2)、 (5) 条即可诊断哮 喘。如喘息发作 2 次， 并具有第 (2)、 (5) 条， 诊断为可疑哮喘或喘息性支气管炎 ( 3 岁 )。 。

14、如同时具有第 (3) 和 / 或第 (4) 条时， 可考虑给予哮喘治疗性诊断。 0021 儿童哮喘的诊断标准 ： (1)年龄3岁， 喘息呈反复发作者(如发作1次， 若可追溯 与某种变应原或刺激因素有关， 亦可考虑 ) ； (2) 发作时双肺闻及以呼气相为主的哮鸣音， 呼气相延长 ； (3) 支气管扩张剂有明显的疗效 ； (4) 除外其他引起喘息的疾病。 0022 实施例 2 ： 血样的收集及生物指标的检测 说 明 书 CN 102154494 A CN 102154495 A3/7 页 5 0023 抽取研究对象静脉血检测血清中总 IgE， 该部分检测工作由医院协助完成。 0024 分析方法 。

15、： 采用免疫印迹法定量检测血清中总 IgE 水平。 0025 具体操作方法 ： 抽取病人静脉血 1ml， 分离血清， 取 250L 与吸附有特异性过敏原 的硝酸纤维素膜于反应槽内室温孵育 45min， 洗涤后加入标记了生物素的抗人 IgE 抗体， 室 温孵育 45min， 洗脱未结合的二抗， 加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素， 再室温孵育 20min， 洗去未结合酶， 加入底物显色。所有孵育在混匀器 (120 次振 /min) 上完成。显色深 浅与血清中 sIgE 含量成正比， 通过 CCD 相机照相， 将结果导入软件系统， 并计算出总 IgE 的 分级和浓度数值 (IU/ml)。 002。

16、6 实施例 3 ： 提取 RNA 0027 抽取研究对象静脉血 3ml， EDTA 抗凝用以提取 RNA。RNA 的提取方法， 具体见盖宁 生物科技有限公司生产的超纯总 RNA 快速提取试剂盒说明书。每份血样提取 RNA 后都分别 对提取的 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性， 利用紫外分光光度仪检测其浓度。计算 3 微克所需反转录用量。 0028 实施例 4 ： 引物设计 0029 在 GeneBank 中下载登录的 TRPV2 基因的 mRNA 序列。根据已报道的 TRPV2 基因序列， 运用生物信息学分析， 选择针对半定量 RT-PCR 的靶序列 ( 核苷酸序列如 序列表中 SEQ 。

17、ID No.1 所示 )， 设计并合成针对半定量 RT-PCR 检测 TRPV2 序列的特 异 性 引 物， 上 游 引 物 ： f1 ： 5 -AGGGCGAGGACCGGAAATTC-3 (SEQ ID No.3)， 下 游 引 物 ： r1 ： 5 -GGCGGGCTGGTGTGGGTT-3 (SEQ IDNo.4)，上 下 游 引 物 间 的 TRPV2 片 段 长 578bp。将 hGAPDH 磷酸甘油醛脱氢酶设为内参照物， 上下游引物间的 hGAPDH 片段 长 445bp。 具 体 为 ： 上 游 引 物 ： f2 ： 5 -CATCATCCCTGCCTCTACTG-3 ， 下 。

18、游 引 物 ： r2 ： 5 -GGGTCTCTCTCTTCCTCTTGT-3。 0030 选择针对实时定量PCR的靶序列(核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示)， 设 计并合成针对实时定量PCR检测TRPV2序列的特异性引物， 上游引物 ： f3 ： 5-CTTCCTTTTC GGCTTCGCTGTAG-3 (SEQ ID No.5) 下游引物 ： r3 ： 5 -GCACTGACTCTGTGGCATTGG-3 (SEQ ID No.6)。上下游引物间的 TRPV2 片段长 95bp。将 hGAPDH 磷酸甘油醛脱氢酶设为内参照 物， 上下游引物间的 hGAPDH 片段长 87bp。

19、。上游引物 ： f4 ： 5 -TGCACCACCAACTGCTTAGC-3 下游引物 ： r4 ： 5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3。 对TRPV2基因预期产物进行BLAST分析。 结果证实所设计的目的片段与 TRPV2 基因的同源率为 100， 而与其它因子的同源率均小 于 40。 0031 实施例 5 ： 半定量 RT-PCR 检测 TRPV2 基因的表达 0032 采用半定量 RT-PCR 方法， 操作步骤如下 ： 0033 RT-PCR 方法 ： 以提取的 RNA 为模板， 模板浓度为 3g， 反应体系如下 ： 0034 RNA ： 3g 0035 Oligo dT。

20、 primer(50M) ： 1L 0036 dNTP(10mM) ： 1L 0037 ddH2O ： 加到 10L 0038 65保温5min后， 迅速在冰上冷却2min。 离心数秒， 在管中加下列反转录反应液 ： 0039 5AMV 反转录酶缓冲液 ： 2L 说 明 书 CN 102154494 A CN 102154495 A4/7 页 6 0040 AMV 反转录酶 (5U) ： 1L 0041 RNA 酶抑制剂 (40U) ： 1L 0042 ddH2O ： 加到 20L 0043 42， 30min， 75， 15min， 4， 冷却。取 1L 反转录产物进行 PCR 反应， 用相。

21、应 TRPV2 基因引物 (f1 和 r1) 及 GAPDH 引物 (f2 和 r2) 进行 PCR 反应， 反应体系 (20L) 如 下 ： 0044 0045 PCR 反应条件为 94预变性 3min ； 94 30s， 55 30s， 72 30s， 30 个循环 ； 最后 72延伸 7min。PCR 产物经 1.0的琼脂糖凝胶电泳观察。磷酸甘油醛脱氢酶 hGAPDH 设为 内参照物， 取 1l 反转录产物用相应引物扩增后， 电泳检测内参在 445bp 位置表达水平是 否一致， 若不一致调整模板浓度至内参一致后再进行相关因子的检测。反应体系和扩增条 件同上， 并用凝胶成像系统照相 ( 图。

22、 1)。 0046 计算 TRPV2 基因的表达水平， 具体操作步骤如下 ： 0047 取2l的PCR产物电泳检测， 用凝胶成像系统照相。 与100ng的DNA Maker条带相 对比， 用Glyko Bandscan 5.0软件分析各信号分子表达强度得到因子与100ng的DNAMaker 条带相对比的比值。 0048 将得到的信号分子与 DNA Maker 的相对比比值计算成相应的浓度， 按如下公 式 ： 信号分子表达强度 ng/l 2l 信号分子表达量 / 相应 100ng 的 DNAMaker 条 带 100ng 相应的 hGAPDH 表达强度 / 相应 100ng 的 DNA Make。

23、r 条带 /2。 0049 实施例 6 ： 实时定量 PCR 检测 TRPV2 基因的表达 ： 0050 采用实时定量 PCR 方法， 操作步骤如下 ： 0051 以反转录的 cDNA 为模板， 取 1l， 每管反应如下， 每个模板做 2 个复孔 ： 0052 说 明 书 CN 102154494 A CN 102154495 A5/7 页 7 0053 PCR 反应条件为 95预变性 10min ； 94 30s， 55 30s， 72 30s， 40 个循环 ； 最后 94变性 1min ； 55 30s， 93 30s， 72延伸 7min。磷酸甘油醛脱氢酶 hGAPDH 设为内参照 物。

24、。反应结束后将结果存入电脑， 用 Mxpro3000 应用软件分析结果 ( 图 2)。 0054 实施例 7 ： 统计分析 0055 统计分析使用 SAS9.1 软件包。具体分析如下 ： 0056 7.1t 检验分析半定量 RT-PCR 检测 TRPV2 在正常组和哮喘组的表达水平， 分 析结果显示 TRPV2 在正常组表达强度为 16.516.29ng/l， 而在哮喘组表达强度为 23.615.07ng/l ； t 检验分析 TRPV2 在正常组和哮喘组的表达水平有显著性差异， P 0.001( 表 1)。当 TRPV2 基因的表达水平 22ng/l 可作为评价哮喘儿童 TRPV2 基因表 。

25、达异常， 并作为儿童哮喘标记物应用于早期儿童哮喘诊断。 0057 7.2 实时定量 PCR 检测 TRPV2 在正常组和哮喘组的表达水平， 分析结果显示 TRPV2 在哮喘组表达强度Ct(Ct目的基因-Ct管家基因)为4.71.1， TRPV2在正常组表达强度Ct 为 1.381.7( 表 2)， TRPV2 在哮喘组表达强度为正常组表达强度的 2.6 倍， t 检验分析两 组表达有显著性差异 P 0.05( 表 2)。当 TRPV2 基因的 Ct 表达水平 3 可作为评价哮 喘儿童 TRPV2 基因表达异常， 并作为儿童哮喘标记物应用于早期儿童哮喘诊断。 0058 7.3哮喘儿童中检测总Ig。

26、E水平与检测TRPV2基因表达水平的比较， 按总IgE水平 的高低分成三级， 100IU/ml 的为正常， 在 100-200IU/ml 之间的为增加， 200IU/ml 为显 著增加。比较在哮喘组儿童 TRPV2 基因及总 IgE 水平升高百分比， 本组有 14 例 (23.3 ) 哮喘儿童 IgE 正常， 总 IgE 水平升高占 76.7， 而 TRPV2 表达升高占 100。卡方分析两种 检测方法均有显著差异 (P 0.001)( 表 3)。说明 TRPV2 基因的表达水平升高在哮喘反应 中较总 IgE 检测更为敏感。 0059 表 1. 半定量 RT-PCR 检测 TRPV2 基因在正。

27、常组和哮喘组的表达水平比较 0060 0061 表 2. 实时定量 PCR 检测 TRPV2 基因在正常组和哮喘组的表达水平比较 说 明 书 CN 102154494 A CN 102154495 A6/7 页 8 0062 0063 表 3. 哮喘组儿童中检测总 IgE 水平与检测 TRPV2 基因表达水平的比较 0064 0065 参考文献 0066 1.WHO Bronchial asthma， fact sheet No 206， revised January 2000s. 0067 2. 全国儿科哮喘协作组 .2000 年与 1990 年儿童支气管哮喘患病率的调查比较 J. 中华结。

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