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1、(10)申请公布号 CN 102181370 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181370 A *CN102181370A* (21)申请号 201110062381.2 (22)申请日 2011.03.16 M2010357 2010.12.20 C12N 1/14(2006.01) C12P 1/02(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 中山大学 地址 510275 广东省广州市新港西路 135 号 (72)发明人 王军 宋永相 刘岚 林永成 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 陈卫 (5。
2、4) 发明名称 南海红树林内生真菌 BL321 (57) 摘要 本发明公开了一种南海红树林内生真菌， 属于生物高技术领域。所用菌株为 BL321， 经 鉴定为鹿角菌属 （Xylariasp.） ， 菌种保藏号为 CCTCCM2010357， 该菌株的 16SrDNA 的 Genbank 登 录号为 HM569607。主要生物学特性为该菌菌落表 面为乳白色细丝羽绒状， 背面为麦黄色， 匍匐扩散 型生长， 无孢子生成， 为好氧型真菌， 其所产部分 新型化合物具有明显的抗肿瘤活性。本发明生产 方便， 成本低， 节能环保， 是开发新型天然药物的 一种理想载体。 (83)生物保藏信息 (51)Int.C。
3、l. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 CN 102181372 A1/1 页 2 1. 南海红树林内生菌 BL321， 为分自广东阳江红树林海岸带白榄树叶的内生真菌， 经鉴定为鹿角菌属 （Xylariasp.） ， 于 2010 年 12 月 20 日寄存于中国典型培养物保藏中 心 （CCTCC） ， 菌种保藏号为 CCTCC M 2010357， 该菌株的 16S rDNA 的 Genbank 登录号为 HM569607 ； 该菌生物学特性为菌落表面为乳白色细丝羽绒状， 背面为麦黄色， 匍匐扩散型生 长， 无孢子。
4、生成， 为好氧型真菌。 2. 如权利要求 1 所述的南海红树林内生菌 BL321 在制备抗肿瘤药物方面的应用。 3. 如权利要求 1 所述的南海红树林内生菌 BL321， 其特征在于其基因序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 权 利 要 求 书 CN 102181370 A CN 102181372 A1/3 页 3 南海红树林内生真菌 BL321 技术领域 0001 本专利涉及一株产抗肿瘤活性化合物的南海红树林内生真菌， 属于生物技术领 域。 背景技术 0002 红树林是热带和亚热带沿海地区特有的植物群落， 红树林真菌是共生于其中的一 个特殊群体， 由于其独特的生存环境， 能够产生出许。
5、多结构新颖的代谢产物， 成为目前研究 最多和最系统的海洋真菌， 目前已分离鉴定的红树林真菌超过 200 种， 随着对其研究的深 入， 红树林内生真菌作为一种海洋微生物资源， 许多结构新颖、 生物活性良好的次级代谢产 物不断被报道， 已成为海洋药物开发的一种重要资源林永成， 周世宁，海洋微生物及其代 谢产物 ， 北京 ： 化工出版社， 2003。 刘爱荣， 吴晓鹏， 徐同， 红树林内生真菌研究进展，应用生 态学报， 2007， 18(4) ： 912-918。 对于红树林真菌Xylaria sp.， 我们先后从Xylaria sp. 2508 菌株中发现了具有 钙离子通道抑制作用的 Xyloke。
6、tal A、 B、 F， 其中 Xyloketal F 的最大最强抑制浓度达 到 0.03M， X.-Y. Wu, X.-H. Liu, Y.-C, Lin, J.-H. Luo, Z.-G. She, H.-J. Li, L.-W. Chan, S. Antus, T. Kurtan, B. Elsasser, K. Krohn,Eur. J. Org. Chem.2005, 4061-4064. 和具有对 DNA 亲和性的 xylopyridine AXu Fang. Pang Jiyang, et al. Chinese Journal of Chemistry, 2009, 27, 3。
7、65-368 等活性天然化合物。Xylaria sp. BL321 是一株产抗肿瘤天然产物的内生真菌， 对其深入研究， 有助对该方面先导化合物的认 识与开发。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种可产生抗肿瘤化合物的南海红树林内生真菌 BL321。 0004 本发明的另一目的在于保护南海红树林内生真菌 BL321 在制备抗肿瘤药物方面 的应用。 0005 发明通过以下技术方案实现上述目的 ： 本发明提供了南海红树林内生菌 BL321， 采自广东阳江红树林海岸带白榄树叶， 经鉴定 为鹿角菌属 （Xylariasp.） ， 于2010年12月20日寄存于中国典型培养物保藏中心 （CCTCC。
8、） ， 菌种保藏号为 CCTCC M 2010357， 该菌株的 16S rDNA 的 Genbank 登录号为 HM569607 ； 该 菌生物学特性为菌落表面为乳白色细丝羽绒状， 背面为麦黄色， 匍匐扩散型生长， 无孢子生 成， 为好氧型真菌 ； 其所产部分新型化合物具有明显的抗肿瘤活性。 0006 该内生真菌 BL321 的基因序列如 SEQ ID NO ： 1 所示 ： 1 tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtctc cgttggtgaa ccagcggagg gatcattaaa 61 gagttatcat aactcctaaa acccatgtga acctt。
9、acctt tgttgcctcg gcaggtctgc 121 agcttaccct gtaagcacct accctgtagg tactttaccc ggtagttgta ggaaagaaac 181 ctgccggtgg tatattaaaa aaacctcttt gtttgttatg ttattctgaa ttctataatt 说 明 书 CN 102181370 A CN 102181372 A2/3 页 4 241 aataaagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 301 gaaatgcgat aagt。
10、aatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 361 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 421 cctcgttgct tagcgttggg agcttacaaa acaacccttt gtagttcctt aaagttagtg 481 gcggagttgg tttcacactc tagacgtagt aagatttatt atctcgccta tagatgagcc 541 ggtctcctgc cgtaaaaacc cccttacttc tt。
11、aaaggttg acctcggatc aggtaggaat 601 acccgctgaa cttaagcata tcaatagccg ggaggaaa 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： （1） 南海红树林内生真菌 BL321 产独特结构的化合物， 经测试， 部分化合物具有高效的 肿瘤细胞抑制作用。 0007 （2） 本发明生产成本低， 节能环保， 是开发新型天然药物的理想载体。 0008 （3） 本发明生产周期短， 分离制备较容易， 易于扩大生产。 0009 具体实施例 0010 实施例 1. 菌种的分离与保藏。 0011 将采来的白榄树叶表面彻底消毒后， 在超净台内将其剪碎， 。
12、放入预先准备好的无 菌水中浸泡十分钟， 用浸提液涂布于PDA平板上， 28静置培养5-7天， 等菌长出后， 挑取单 个菌落二次涂布平板， 直到所长菌落为单一菌落为止。于 PDA 斜面内 4保藏。BL321 的菌 落形态为无包子生成的乳白色细丝羽绒状， 背面为麦黄色， 匍匐扩散型生长。 0012 实施例 2. 菌种 BL321 的鉴定。 0013 将 BL321 从 PDA 斜面培养基转入 PDA 平皿培养基培养， 培养 5-7 天， 形成白色匍匐 菌丝， 刮去菌丝体， 用真菌 DNA 提取试剂盒提取 DNA。提取的 DNA 用 ITS4R/ITS1F 50L 反 应体系， 扩增 ITS-rRN。
13、A。反应条件为 94 3min， 35 次循环 ： 94 30s， 50 30s， 72 1min， 72 8min。DNA 鉴定用 DNA 双向测序， 测序结果经基因文库检索比对为 Max index 为 91%， 确定为鹿角菌。 0014 实施例 3. 活性成分的提取与分离。 0015 B321 从斜面活化后， 将带有菌丝体的琼脂快接种于含 250mL GYT 培养基的 500mL 三角瓶中， 在28下， 摇床rpm 120， 培养5-7天， 在对数生长期转接扩大培养， 每个含500mL GYT 培养基的 1L 三角瓶接种 1mL， 在 28下， 摇床 rpm 120， 培养 5-7 天 。
14、（或静置 30 天） ， 收 取菌体。 0016 菌体经干燥粉碎后， 用 3 倍体积乙酸乙酯 （EA） 萃取 5 次， 萃取液浓缩后用 EA/ 石 油醚 （PE） 以 10% 的梯度进行柱色谱层析， 得到极性 EA/PE 在 40% 左右的组分， 组分经浓缩、 重结晶后得含量在 80% 左右的已知艾里莫芬烷类的倍半萜化合物 S6-2 (07H239-A)， 其每 升发酵液的产量达到 20mg 左右， 对其进行进一步色谱柱层析和 HPLC， 在极性为甲醇 ： 水 ： 乙酸 =75:25:0.1、 流速为 1.5mL/min、 254nm 波长检测的条件下， 又得到同系列的 4 个微量 说 明 书。
15、 CN 102181370 A CN 102181372 A3/3 页 5 新化合物。初步检测部分化合物具有明显的抗肿瘤活性和 - 葡萄糖甘酶的激活活性。 07H239-A曾有报道其对24株肿瘤细胞的平均IC50为3.2 g/mL L. A. McDonald, L. R. Barbieri, V. S. Bernan, J. Janso, P. Lassota, G. T. Garter, J. Nat. Prod. 2004, 67, 1565.。 说 明 书 CN 102181370 A CN 102181372 A1/2 页 6 SEQUENCE LISTING 中山大学 南海红树林内。
16、生真菌 BL321 1 PatentIn version 3.2 1 638 DNA 人工序列 1 tagaggaagt aaaagtcgta acaaggtctc cgttggtgaa ccagcggagg gatcattaaa 60 gagttatcat aactcctaaa acccatgtga accttacctt tgttgcctcg gcaggtctgc 120 agcttaccct gtaagcacct accctgtagg tactttaccc ggtagttgta ggaaagaaac 180 ctgccggtgg tatattaaaa aaacctcttt gtttgtta。
17、tg ttattctgaa ttctataatt 240 aataaagtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga agaacgcagc 300 gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct ttgaacgcac 360 attgcgccca ttagtattct agtgggcatg cctgttcgag cgtcatttca acccttaagc 420 cctcgttgct tagcgttggg agcttacaaa acaacccttt gtagttcctt aaagttagtg 480 gcggagttgg tttcacactc tagacgtagt aagatttatt atctcgccta tagatgagcc 540 ggtctcctgc cgtaaaaacc cccttacttc ttaaaggttg acctcggatc aggtaggaat 600 序 列 表 CN 102181370 A CN 102181372 A2/2 页 7 acccgctgaa cttaagcata tcaatagccg ggaggaaa 638 序 列 表 CN 102181370 A 。