新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒及应用.pdf

《新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒及应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒及应用.pdf（6页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(10)申请公布号 CN 102181569 A (43)申请公布日 2011.09.14 CN 102181569 A *CN102181569A* (21)申请号 201110129750.5 (22)申请日 2011.05.19 C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 上海主健生物工程有限公司 地址 200433 上海市杨浦区国定路 335 号 2 号楼 6 层 (72)发明人 王贻锘 (54) 发明名称 新生儿神经管畸形致病基因突变检测试剂盒 及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种检测新生儿神经管畸形致 病基因上的相关 SNP 位。

2、点是否发生突变的试剂 盒。该试剂盒的主要成分包括 ： (1) 检测 MTHFR 基 因上rs1801133号和rs1801131号和MTRR基因上 rs1801394 号 SNP 位点多态性基因型的特异性引 物对及特异性荧光探针对 ； (2) 常规荧光定量 PCR 反应试剂。本发明的试剂盒用于检测新生儿神 经管畸形致病基因的突变体， 可以快速方便地查 出致病基因的携带者， 可应用于产前诊断、 及时治 疗， 降低新生儿神经管畸形的发病率， 优生优育。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 CN 102181572 。

3、A1/1 页 2 1. 一种检测新生儿神经管畸形致病基因是否发生突变的试剂盒， 其特征在于包括以下 成分 ： (1) 检测 MTHFR 基因上 rs1801133 号和 rs1801131 号 SNPs 多态性基因型的特异性引 物对及特异性荧光探针对 ； (2) 检测 MTRR 基因上 rs1801394 号 SNP 多态性基因型的特异性 引物对及特异性荧光探针对 ； (3) 常规荧光定量 PCR 反应试剂。 2. 根据权利 1 所述的试剂盒， 其特征在于包括以下组分和含量 ： (1)3l 10X 荧 光定量 PCR 反应缓冲液 ； (2)0.3l 25mM dNTP 混合液 ； (3)1.8。

4、l 25mM MgCl2 溶液 ； (4)0.075l(5units/l)Taq DNA 聚合酶 ； (5)20M 特异性引物对每条引物各 1OD ； (6)10M 特异性荧光探针对每条探针各 1OD ； (7) 去离子水 15.975l。本试剂盒为一人份 检测应用， 试剂盒的保存温度为 -20。 3.根据权利1所述的试剂盒用于检测新生儿神经管畸形致病基因5， 10-亚甲基四氢叶 酸还原酶基因 (MTHFR)、 甲硫氨酸合成酶还原酶基因 (MTRR) 上的相关 SNP 位点的突变体。 权 利 要 求 书 CN 102181569 A CN 102181572 A1/4 页 3 新生儿神经管畸形。

5、致病基因突变检测试剂盒及应用 技术领域 0001 本发明属生物技术领域， 具体涉及检测新生儿神经管畸形致病基因是否发生突变 的试剂盒。 背景技术 0002 叶酸是机体所需的重要营养素， 为水溶性 B 族维生素， 在绿叶蔬菜、 水果及动物肝 脏中含量丰富。 叶酸在人体内以四氢叶酸的形式起作用， 四氢叶酸是一碳单位的运载体， 可 运载甲基、 甲烯基、 甲醛基等一碳单位， 参与体内氨基酸、 嘌呤、 嘧啶的合成。因而叶酸对细 胞分裂增殖、 组织修复和机体发育等都是不可缺少的营养素。 0003 对于孕妇， 补充叶酸尤其重要。妊娠头 4 周是胎儿神经管分化和形成的重要时期， 此期叶酸缺乏可增加胎儿神经管畸。

6、形及早产的风险， 而很多受孕者在早孕期并没意识到自 己已经怀孕 ； 更有研究显示， 妇女在服用叶酸 4 周后， 体内叶酸缺乏的状态才能得到明显的 改善。因此， 育龄妇女至少应在孕前 3 个月开始， 适当多吃富含叶酸的食物和补充叶酸， 以 确保胚胎早期有一个较好的叶酸营养状态， 预防胎儿神经管及其他器官畸形的发生。 0004 育龄妇女服用叶酸增补剂时由于个人的遗传体质不同， 存在叶酸代谢能力的差 异， 不同人群所需叶酸剂量不能一概而论。 如服用剂量不足实际需求， 达不到补充叶酸的效 果 ； 而盲目过量服用高浓度叶酸， 会干扰孕妇的营养元素代谢， 同样会影响胎儿发育， 超量 服用叶酸也会引起药品不。

7、良反应， 反而会对孕妇和胎儿造成严重不良后果。所以不同身体 状况与素质的育龄妇女必须根据自身情况， 有的放矢地准备与补充所需要的叶酸。 0005 目前， 经证实并且机理研究清楚的与叶酸代谢密切相关的基因有 ： 5， 10- 亚甲基 四氢叶酸还原酶基因 (MTHFR)、 甲硫氨酸合成酶还原酶基因 (MTRR)。 0006 MTHFR 为 5， 10-methylenetetrahydrofolate reductase(NADPH)( 亚甲基四氢叶 酸还原酶 ) 蛋白编码基因， 主要作用是在叶酸代谢通路中将 5， 10- 亚甲基四氢叶酸转化为 具有生物学功能的5-甲基四氢叶酸盐。 5-甲基四氢叶。

8、酸盐可以进一步进入甲基传递通路， 通过同型半胱氨酸的重新甲基化过程间接的为 DNA 甲基化和蛋白质甲基化提供甲基并且 使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。研究发现， MTHFR 基因存在多种多态 型， 影响 MTHFR 活性和热稳定性。常见的变异包括 ： (1)677C-T ： MTHFR 基因第 677 位密码子 胞嘧啶 (C) 被胸腺嘧啶 (T) 替代， 编码后酶分子中丙氨酸被缬氨酸替代， 引起 MTHFR 热稳定 性和活性降低， 相对于正常的 C/C 基因型， 纯合子 T/T 基因型 MTHFR 活性在 37 摄氏度降低 5060， 在46摄氏度降低65； (2)1298A-C。

9、 ： 编码后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代， 引 起 MTHFR 活性降低。1298A-C 与 677C-T 不同的是， 纯合子和杂合子血浆同型半胱氨酸升高 和叶酸降低均不明显。 然而， 如果同时存在1298A-C和677C-T复合变异的杂合子， 则MTHFR 活性低于野生型 40。 0007 甲硫氨酸是蛋白质合成和一碳代谢的必需氨基酸， 它的合成是由甲硫氨酸合酶 (MTR 编码 ) 催化的， 而甲硫氨酸合酶因为辅助因子维生素 B12 被氧化而最终失活。MTRR 编 码的甲硫氨酸合成酶还原酶能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨 说 明 书 CN 102181569 A CN 102。

10、181572 A2/4 页 4 酸合酶。MTRR 能够保持甲基钴铵 III 在一定水平， 而甲基钴铵 III 是激活蛋氨酸合成酶的 辅助因子， 它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR 变异是造成叶酸 / 甲基维生 素缺乏症E型的主要原因。 MTRR 66AG多态性， 导致蛋氨酸被异亮氨酸替代， 使该酶活性 降低。该基因型对同型半胱氨酸水平有显著影响。有研究指出， MTRR 基因 A66G 多态， 血浆 同型半胱氨酸增高， 基因型为 MTRR 66GG， MTRR 66AG 的孕妇或胎儿发生神经管畸形的危险 性较正常对照组增加。 发明内容 0008 本发明的目的是提供一种采用荧光定量 。

11、PCR 技术检测新生儿神经管畸形致病基 因 5， 10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因 (MTHFR)、 甲硫氨酸合成酶还原酶基因 (MTRR) 上的相 关 SNP 位点是否发生突变的试剂盒。 0009 本检测试剂盒主要包括以下成分 ： 0010 (1)检测MTHFR基因上rs1801133号和rs1801131号SNPs多态性基因型的特异性 引物对及特异性荧光探针对 ： 0011 (2)检测MTRR基因上rs1801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧 光探针对 ； 0012 (3) 常规荧光定量 PCR 反应试剂， 如 Taq 酶、 dNTP 混合液、 MgCl2溶液、 反应缓冲。

12、液、 去离子水等。 0013 本检测试剂盒的组分和含量包括 ： 0014 (1)3l 10X 荧光定量 PCR 反应缓冲液 ； 0015 (2)0.3l 25mM dNTP 混合液 ； 0016 (3)1.8l 25mM MgCl2溶液 ； 0017 (4)0.075l(5units/l)Taq DNA 聚合酶 ； 0018 (5)20M 特异性引物对每条引物各 1 OD ； 0019 (6)10M 特异性荧光探针对每条探针各 1 OD ； 0020 (7) 去离子水 15.975l。 0021 本试剂盒为一人份检测应用， 试剂盒的保存温度为 -20。 0022 本试剂盒的使用步骤包括 ： 0。

13、023 (1) 提取样本的基因组 DNA ； 0024 (2) 荧光定量 PCR 反应 ： 0025 使用检测试剂盒， 进行 3 次独立的荧光定量 PCR 反应， 每次反应的体系为总体 积 10l， 包含浓度为 20ng/l 的 DNA 模板 2l、 1l 10X 荧光定量 PCR 反应缓冲液、 0.1l 25mM dNTP 混合液、 0.6l 25mM MgCl2溶液、 0.025l(5units/l)Taq DNA 聚合 酶、 20M 的有义引物和反义引物各 0.225l、 10M 的带 VIC 荧光探针和带 FAM 荧光探针 各 0.25l， 去离子水 5.325l。 0026 在PCR。

14、扩增仪上进行反应， 反应条件为50、 2分钟， 95、 10分钟， 进行60个循环 的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反应结束后在荧光定量 PCR 仪上读取样品荧光量。 0027 本发明所述的试剂盒用于检测习惯性流产致病基因新生儿神经管畸形致病基因 5， 10- 亚甲基四氢叶酸还原酶基因 (MTHFR)、 甲硫氨酸合成酶还原酶基因 (MTRR) 上的相关 说 明 书 CN 102181569 A CN 102181572 A3/4 页 5 SNP 位点的突变体， 可以快速方便地查出致病基因的携带者， 可应用于产前诊断、 及时治疗， 降低新生儿神经管畸形的发病率， 优生优育。 具体实施方。

15、式 0028 实施例 1 0029 一人份检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒， 包括以下成分 ： 0030 (1)检测MTHFR基因上rs1801133号和rs1801131号SNPs多态性基因型的特异性 引物对及特异性荧 0031 光探针对， 每条引物和探针各 1 OD ； 0032 (2)检测MTRR基因上rs1801394号SNP多态性基因型的特异性引物对及特异性荧 光探针对， 每条引物和探针各 1 OD ； 0033 (3) 荧光定量 PCR 反应试剂 ： 3l 10X 荧光定量 PCR 反应缓冲液、 0.3l 25mM dNTP 混合液、 1.8l25mM MgCl2 溶。

16、液、 0.075l(5units/l)Taq DNA 聚合酶、 去离子水 15.975l。 0034 本试剂盒保存于 -20， 尽量减少反复冻融。 0035 实施例 2 0036 一人份检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒的使用步骤包括 ： 0037 (1) 提取样本的基因组 DNA ； 0038 (2) 荧光定量 PCR 反应 ： 0039 使用检测试剂盒， 进行 3 次独立的荧光定量 PCR 反应， 每次反应的体系为总体 积 10l， 包含浓度为 20ng/l 的 DNA 模板 2l、 1l 10X 荧光定量 PCR 反应缓冲液、 0.1l 25mM dNTP 混合液、 0.6l。

17、 25mMMgCl2溶液、 0.025l(5units/l)Taq DNA 聚合 酶、 20M 的有义引物和反义引物各 0.225l、 10M 的带 VIC 荧光探针和带 FAM 荧光探针 各 0.25l， 去离子水 5.325l。 0040 在PCR扩增仪上进行反应， 反应条件为50、 2分钟， 95、 10分钟， 进行60个循环 的 95、 30 秒， 60、 1 分钟。反应结束后在荧光定量 PCR 仪上读取样品荧光量。 0041 (3)SNP 基因型分析 0042 根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对 SNP 位点进行基因型分析。 0043 熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够。

18、通过辨识荧光定量PCR仪上显示的 最终样品荧光量， 根据不同序列探针 VIC 和 FAM 荧光信号的强弱即可确定所检测的 SNP 位 点的基因型。 0044 实施例 3 0045 应用检测新生儿神经管畸形致病基因否发生突变的试剂盒进行孕妇新生儿神经 管畸形遗传易感性检测的服务 0046 (1) 由医院检验科医师指导被检孕妇使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样， 采 用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的 DNA 抽提 ； 0047 (2) 基因分型检测 ： 0048 使用本发明提供的试剂盒， 对被检测者基因组 DNA 的 MTHFR 基因上 rs1801133 号 和 rs1801131 号 SNP 位。

19、点和 MTRR 基因上 rs1801394 号 SNP 位点分别进行荧光定量 PCR 检 说 明 书 CN 102181569 A CN 102181572 A4/4 页 6 测， 确定这 3 个 SNPs 位点的基因型。 0049 (3) 孕妇新生儿神经管畸形遗传易感性的分析 0050 通过对被检测者 SNPs 基因型的分析， 出具孕妇新生儿神经管畸形遗传易感性的 分析报告单。报告中详细说明了该孕妇的新生儿神经管畸形遗传风险的高低， 并由医师向 其详细说明和解读新生儿神经管畸形遗传易感性分析报告单， 指导孕妇合理补充叶酸， 防 止新生儿神经管畸形的发生。 说 明 书 CN 102181569 A 。