快速测定囊泡病毒滴度的方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610522012.X (22)申请日 2016.07.05 (71)申请人 华中农业大学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 申请人 湖南农业大学 (72)发明人 万虎韩宁宁李建洪陈子姝 黄国华 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 王和平冯超 (51)Int.Cl. C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/06(2006.01) (54)发明名称 快速测定囊泡病毒滴度的方法 (57)摘要 本发明涉及生物技。

2、术领域， 具体而言， 公开 了一种用于囊泡病毒滴度的快速检测方法。 该方 法重悬对数生长期Sf9昆虫细胞； 置培养箱中静 置培养30分钟至细胞贴壁， 弃上清培养基， 换用 新的Sf-900IISFM培养基； 利用血小球计数板测 定细胞浓度； 取Sf9昆虫细胞悬液与囊泡病毒稀 释液混匀后接种至96孔细胞培养盘； 置于培养箱 中培养24小时后， 每孔加台盼蓝染色液， 统计每 孔被染色细胞个数、 总细胞个数。 计算每孔Sf9昆 虫细胞死亡率， 每孔的死细胞率低于对照组的死 细胞率， 认定该孔被囊泡病毒侵染， 反之则认为 该孔未被病毒侵染， 根据公式计算囊泡病毒的 TCID50。 本发明测定囊泡病毒滴。

3、度的方法结合了 细胞染色， 可用于囊泡病毒滴度的快速测定， 测 定结果更为准确。 权利要求书2页 说明书7页 CN 106048090 A 2016.10.26 CN 106048090 A 1.一种快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 包括以下步骤： 1)制备昆虫细胞悬液： 将昆虫细胞置于Sf-900IISFM液体培养基中进行培养， 得到对 数生长期的昆虫细胞， 然后用Sf-900IISFM液体培养基对昆虫细胞进行稀释， 得到昆虫细 胞悬液， 2)制备待测囊泡病毒稀释液： 将待测囊泡病毒使用Sf-900IISFM液体培养基十倍梯 度稀释备用； 得到不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液； 3)。

4、制备细胞病毒悬液： 将步骤2)得到的不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液分别与步骤 1)得到昆虫细胞悬液混合， 得到不同稀释度的细胞病毒悬液； 4)囊泡病毒侵染： 将步骤3)得到不同稀释度的细胞病毒悬液接种至细胞培养盘内， 置 于细胞培养箱中培养2030h； 5)台盼蓝染色： 取出上述细胞培养盘， 并向细胞培养孔中滴加台盼蓝染色液染色， 混合 均匀， 染色23分钟， 在显微镜下计数每孔被染色的死细胞个数和细胞总个数； 6)囊泡病毒滴度计算： 根据每孔的死细胞个数和细胞总个数计算每孔细胞死亡率， 即 每孔细胞死亡率每孔死细胞个数/该孔细胞总个数， 从而统计细胞培养盘中， 每个稀释度 细胞病毒悬液的侵染。

5、孔数； 计算囊泡病毒的TCID50。 2.根据权利要求1所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤1)中， 昆 虫细胞的为草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda卵巢细胞Sf9细胞、 草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢细胞Sf21细胞、 粉纹夜蛾Trichoplusiani卵细胞系Hi5细胞中任意一种。 3.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤1)中， 所述昆虫细胞悬液中， 昆虫细胞的个数为1.09.9105个/mL。 4.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤2)中， 囊泡。

6、病毒为HvAV3、 SfAV1、 TnAV2和SeAV5中任意一种。 5.根据权利要求4所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤2)中， 待 测囊泡病毒稀释液的稀释度的梯度为210。 6.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤3)中， 待测囊泡病毒稀释液与昆虫细胞悬液的体积比为1 815。 7.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤4)中， 细胞病毒悬液接种至细胞培养盘的具体步骤如下： 1)处理组： 每一排或列的细胞培养孔内均接种同样稀释度的细胞病毒悬液， 2)对照组： 保留一排或列的细胞培养孔内均接种Sf。

7、-900IISFM液体培养基与昆虫细 胞悬液的混合液； 其中， 每个孔的接种量均为100200 L。 8.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤5)中， 台盼蓝染色液的质量分数为0.30.6， 台盼蓝染色液滴加量为730 L。 9.根据权利要求1或2所述快速测定囊泡病毒滴度的方法， 其特征在于： 所述步骤6)中， 根据每孔细胞死亡率计算对照组的平均细胞死亡率， 即对照组的平均细胞死亡率对照组 每孔细胞死亡率之和/对照组孔数； 比较处理组每孔细胞死亡率和对照组的平均死亡率， 判 断接种病毒的处理组是否被病毒侵染， 若处理组的某孔内细胞死亡率大于对照组的平均细胞。

8、死亡率， 则判定该孔被病毒侵 权利要求书 1/2 页 2 CN 106048090 A 2 染， 即该孔为阳性， 或， 若处理组的某孔内细胞死亡率小于对照组的平均细胞死亡率， 则判定该孔未被病 毒侵染， 即该孔为阴性； 由上述判定统计每个病毒稀释度处理组的侵染孔数， 计算该病毒稀释度处理组的侵染 率， 即每组处理侵染率该组侵染孔数/该组总孔数， 从而根据Reed-Muench法计算囊泡病 毒的TCID50 即， 距离比例(高于50的病变率-50)/(高于50的病变率-低于50病变率)， lgTCID50高于50病变的病毒最高稀释度的对数-距离比例。 权利要求书 2/2 页 3 CN 10604。

9、8090 A 3 快速测定囊泡病毒滴度的方法 技术领域 0001 本发明涉及测定病毒滴度的方法， 具体地指一种快速测定囊泡病毒滴度的方法。 背景技术 0002 囊泡病毒(ascovirus)是一类主要侵染鳞翅目夜蛾科昆虫的DNA病毒。 囊泡病毒粒 子含一个环状超螺旋双链DNA， 病毒基因组大小依种的不同从116kbp(DpAV4)到185kbp (HvAV3)不等。 囊泡病毒基因组包含两组重复序列。 第一组依种的不同大小从1.1kbp到 3.8kbp， 目前所知在生理上并没有什么特殊的作用。 第二组大小约0.31.2kbp， 编码杆状 病毒重复开读框基因序列。 囊泡病毒侵染宿主幼虫后宿主幼虫表。

10、现为生长发育迟缓， 肌肉 弹性降低， 取食量减少等症状。 细胞病理学特征显示侵染初期细胞核肥大， 随之核膜破裂， 细胞过度增长， 细胞质膜嵌入细胞内部， 将细胞划分为2030个小囊。 病毒从囊泡内生成， 囊泡相互分离后在血淋巴中累积。 侵染3、 4天后， 病毒大量复制， 在血淋巴中的浓度达到108 个含毒颗粒/毫升， 血淋巴呈乳白色， 这是囊泡病毒侵染的显著特征。 因此， 从感病幼虫收集 的血淋巴中， 除含有大量的病毒粒子外， 还含有包含病毒粒子的囊泡。 900由于囊泡病毒特 殊的细胞病理学特征， 迄今未有较为理想的囊泡病毒滴度测定方法， 严重影响了囊泡病毒 及相关学科的研究进程。 0003 。

11、而今， 病毒学及分子生物学等学科的飞速发展， 病毒滴度测定方法呈现简单快速 等特点。 目前最常见的滴度测定方法有两种， 分别为噬斑法和终点稀释法， 0004 1)噬斑法(plaqueassay)是测定病毒滴度经典且被广大病毒学家较认可的方法， 其原理为： 单个噬菌斑是由一个病毒粒子产生的， 通过噬斑数和稀释度的换算， 获得病毒滴 度， 以噬斑形成单位(PFU/mL)表示。 该方法检测时间长， 易受细胞质量、 单层细胞密度、 琼脂 糖的一致性、 孵育时间和操作者熟练程度等多种因素的影响， 且相邻的噬斑可能联合到一 起， 降低了噬斑数， 也可能母斑病毒产生子斑， 增加了噬斑数， 导致试验重复性差，。

12、 即结果不 同。 0005 2)终点稀释法(end-pointdilutionassay)以50组织培养侵染剂量(TCID50)表 示， 是指能使半数单层细胞孔(管)出现病变的病毒稀释度， 是使用较广泛的一种病毒含量 测定方法， 该方法主要通过观察细胞病变来确定病毒的滴度。 然而， 由于囊泡病毒侵染昆虫 细胞引起的细胞病变不明显， 漏检及误判可能性非常大， 即主观和经验因素对检测结果的 影响较大， 故依照传统的终点稀释法测定囊泡病毒滴度有很大缺陷。 0006 综上所述， 由于囊泡病毒特殊的细胞病理学特征以及现有病毒滴度测定方法的明 显缺陷， 导致目前尚没有一种快速简便测定囊泡病毒滴度的方法。 。

13、发明内容 0007 本发明克服了传统的终点稀释法和噬斑法检测囊泡病毒滴度的技术缺陷， 提供一 种快速测定囊泡病毒滴度方法， 该方法是通过囊泡病毒侵染单层昆虫细胞， 致使细胞病变， 结合细胞活力染色， 在显微镜下观察细胞是否被侵染， 统计昆虫细胞死亡率， 并计算病毒滴 说明书 1/7 页 4 CN 106048090 A 4 度。 0008 为实现上述目的， 本发明提供的一种快速测定囊泡病毒滴度的方法， 包括以下步 骤： 0009 1)制备昆虫细胞悬液： 将昆虫细胞置于Sf-900IISFM液体培养基中进行培养， 得 到对数生长期的昆虫细胞， 然后用Sf-900IISFM液体培养基对昆虫细胞进行。

14、稀释， 得到昆 虫细胞悬液， 其中， Sf-900IISFM液体培养基购于gibco公司； 0010 2)制备待测囊泡病毒稀释液： 将待测囊泡病毒使用Sf-900IISFM液体培养基十倍 梯度稀释备用， 得到不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液； 0011 3)制备细胞病毒悬液： 将步骤2)得到的不同稀释度的待测囊泡病毒稀释液分别与 步骤1)得到昆虫细胞悬液混合， 得到不同稀释度的细胞病毒悬液； 0012 4)囊泡病毒侵染： 将步骤3)得到不同稀释度的细胞病毒悬液接种至细胞培养盘 内， 置于细胞培养箱中培养2030h， 在2030h内细胞凋亡明显， 但病毒侵染时间过长， 被 病毒侵染的细胞破裂， 释。

15、放出病毒粒子和囊泡， 不利于后续染色试验和死细胞个数统计； 0013 5)台盼蓝染色： 取出上述细胞培养盘， 并向细胞培养孔中滴加台盼蓝染色液染色， 混合均匀， 染色23分钟， 在显微镜下计数每孔被染色的死细胞个数和细胞总个数； 0014 6)囊泡病毒滴度计算： 根据每孔的死细胞个数和细胞总个数计算每孔细胞死亡 率， 即每孔细胞死亡率每孔死细胞个数/该孔细胞总个数， 从而统计细胞培养盘中， 每个 稀释度细胞病毒悬液的侵染孔数； 计算囊泡病毒的TCID50。 0015 进一步地， 所述步骤1)中， 昆虫细胞的为草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda卵巢 细胞Sf9细胞、 草地贪夜蛾S。

16、podopterafrugiperda卵巢细胞Sf21细胞、 粉纹夜蛾 TrichoplusianiHbner卵细胞系Hi5细胞中任意一种。 0016 再进一步地， 所述步骤1)中， 所述昆虫细胞悬液中， 昆虫细胞的个数为1.09.9 105个/mL。 0017 再进一步地， 所述步骤2)中， 囊泡病毒为HvAV3、 SfAV1、 TnAV2和SeAV5中任意一种。 0018 再进一步地， 所述步骤2)中， 待测囊泡病毒稀释液的稀释度的梯度为210。 0019 再进一步地， 所述步骤3)中， 待测囊泡病毒稀释液与昆虫细胞悬液的体积比为1 8 15。 0020 再进一步地， 所述步骤4)中， 细。

17、胞病毒悬液接种至细胞培养盘的具体步骤如下： 0021 1)处理组： 每一排或列的细胞培养孔内均接种同样稀释度的细胞病毒悬液， 0022 2)对照组： 保留一排或列的细胞培养孔内均接种Sf-900IISFM液体培养基与昆虫 细胞悬液的混合液； 0023 其中， 每个孔的接种量均为100200 L。 0024 再进一步地， 所述步骤5)中， 台盼蓝染色液的质量分数为0.30.6， 台盼蓝染色 液滴加量为730 L。 0025 再进一步地， 所述步骤6)中， 根据每孔细胞死亡率计算对照组的平均细胞死亡率， 即对照组的平均细胞死亡率对照组每孔细胞死亡率之和/对照组孔数； 比较处理组每孔 细胞死亡率和对。

18、照组的平均死亡率， 判断接种病毒的处理组是否被病毒侵染， 0026 若处理组的某孔内细胞死亡率大于对照组的平均细胞死亡率， 则判定该孔被病毒 侵染， 即该孔为阳性， 说明书 2/7 页 5 CN 106048090 A 5 0027 或， 若处理组的某孔内细胞死亡率小于对照组的平均细胞死亡率， 则判定该孔未 被病毒侵染， 即该孔为阴性； 0028 由上述判定统计每个病毒稀释度处理组的侵染孔数， 计算该病毒稀释度处理组的 侵染率， 即每组处理侵染率该组侵染孔数/该组总孔数， 从而根据Reed-Muench法计算囊 泡病毒的TCID50 0029 即， 距离比例(高于50的病变率-50)/(高于5。

19、0的病变率-低于50病变 率) 0030 lgTCID50高于50病变的病毒最高稀释度的对数-距离比例。 0031 本发明的有益效果在于： 0032 本发明方法操作简单、 结果精确、 耗时短、 稳定性好。 该方法能以较高的检测准确 度测定囊泡病毒滴度； 本发明所述的滴度检测方法测定囊泡病毒滴度仅需2天， 而传统的终 点稀释法则需要8-10天， 噬斑形成需要很多个感染周期， 得到最终结果通常需要三个星期， 大大缩短了检测时间。 囊泡病毒侵染细胞后没有明显的细胞病变特征， 单纯的显微镜观察 无法判断细胞是否被病毒侵染， 故传统的终点稀释法无法准确检测囊泡病毒滴度。 相比较 传统的终点稀释法和噬斑法。

20、， 本发明所述方法检测周期缩短6-8天， 检测效率高， 不仅大大 缩短了操作时间， 节约成本， 实验结果更具预料性， 在不同操作个体间也更精确稳定。 本发 明对操作人员的要求相对较低， 不可控因素较小， 实验结果的操作稳定性较高。 具体实施方式 0033 为了更好地解释本发明， 以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容， 但 本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。 0034 实施例1囊泡病毒HvAV-3h滴度的快速测定 0035 具体步骤如下： 0036 1.制备囊泡病毒HvAV-3h梯度稀释液 0037 将待测囊泡病毒液HvAV-3h用Sf-900IISFM培养基梯度稀释， 涡旋振荡30秒。

21、混匀。 具体稀释度如表1所示。 0038 表1囊泡病毒稀释方案 说明书 3/7 页 6 CN 106048090 A 6 0039 0040 2.制备昆虫细胞悬液 0041 取足量Sf9昆虫细胞培养物按常规传代方法收集昆虫细胞， 静置30min后弃去上清 培养基， 换用新鲜Sf-900IISFM培养基， 用枪吹打使昆虫细胞悬浮， 用血细胞计数板计数细 胞个数， 并用Sf-900IISFM培养基将细胞稀释至浓度为1105个/mL。 0042 3.制备细胞病毒悬液 0043 分别取1300 L的昆虫细胞悬液和130 L的病毒梯度稀释液于1.5mL已灭菌的离心 管， 轻轻混匀。 0044 4.病毒侵。

22、染 0045 取110 L细胞病毒悬液加入到96孔细胞培养盘中， 每列为一个梯度稀释的细胞悬 液， 第一列为空， 第二列到第六列病毒稀释度分别为10-8、 10-7、 10-6、 10-5、 10-4， 第七列为不 加病毒梯度稀释液的对照组， 做好相应标记， 置细胞培养箱中培养24小时。 0046 表296孔盘加样分布 说明书 4/7 页 7 CN 106048090 A 7 0047 0048 4.昆虫细胞染色 0049 取出96孔培养盘， 每孔加10 L0.4的台盼蓝染色液， 轻轻晃动混匀。 0050 5.实验结果观察 0051 台盼蓝染色2-3分钟后， 在显微镜下计数每孔被染色的细胞个数。

23、和细胞总个数。 0052 6.数据处理 0053 通过计数细胞个数， 计算每孔的细胞死亡率， 根据对照组的平均细胞死亡率， 判断 接种病毒的处理组是否被病毒侵染， 若处理组的细胞死亡率大于对照组的平均细胞死亡 率， 该孔被病毒侵染， 则判定该孔为阳性， 反之则为阴性。 0054 7.结果计算 0055 表3昆虫细胞死亡率 说明书 5/7 页 8 CN 106048090 A 8 0056 0057 注:每病毒稀释处理组侵染率阳性孔数/总接种孔数 0058 表4囊泡病毒侵染率 0059 0060 按Reed-Muench法计算该病毒的TCID50值， 具体计算方法如下: 0061 距离比例(高于。

24、50的侵染率-50)/(高于50的侵染率-低于50的侵染率) lg稀释倍数 0062 (58.33-50)/(58.3333.33) 说明书 6/7 页 9 CN 106048090 A 9 0063 0.3332 0064 lgTCID50高于50病变的病毒最高稀释度的对数-距离比例 0065 -5.3332 0066 TCID5010lgTCID50 0067 10-5.3332 0068 由此可知， 病毒的滴度为105.3332TCID50/10 L， 即2.15107TCID50/mL。 0069 上述Sf-900IISFM液体培养基购于gibco公司； 其它材料均购于市面。 0070 其它未详细说明的部分均为现有技术。 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述， 但它仅仅是本发明一部分实施例， 而不是全部实施例， 人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例， 这些实施例都属于本发明保护范围。 说明书 7/7 页 10 CN 106048090 A 10 。