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1、(10)授权公告号 CN 102229981 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 102229981 B *CN102229981B* (21)申请号 201110127228.3 (22)申请日 2011.05.17 CGMCC NO. 4684 2011.03.15 C12Q 1/68(2006.01) A01H 1/02(2006.01) A01H 1/04(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 张天真 王鹏 郭旺珍 曹志斌 (74)专利代理机构 南京经纬专利商。
2、标代理有限 公司 32200 代理人 张素卿 (54) 发明名称 一种改良棉花纤维强度和马克隆值的分子育 种方法 (57) 摘要 本发明一种改良棉花纤维强度和马克隆值 的分子育种方法， 专用于农作物 （棉花）定向改 良农艺性状和新品种的选育。通过对海岛棉染 色体片段导入系进行棉纤维品质检测， 筛选出纤 维强度显著增加且马克隆值显著降低的导入系 IL088-A7-3。 以此导入系为非轮回亲本， 新疆棉区 品种新陆早38号为轮回亲本， 进行杂交， 回交2代 且自交 3 代并辅以分子标记辅助选择获得纤维强 度和马克隆值都优良的棉花新品系。利用这一方 法， 已经培育出优质、 高产的棉花新品系 “南农海。
3、 导 3 号” 。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 赵菁 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花纤维强度和马克隆值的分子育种方 法， 包括 ： 1) 以新疆棉区品种新陆早38号为轮回亲本， 以IL088-A7-3染色体片段导入系为非 轮回亲本， 杂交1代， 回交2代获得BC2F1， 每代都是混收混种 ； IL088-A7-3保藏号为CGMCC NO.4684 ； 2。
4、) 分子标记辅助第一次前景选择 ： BC2F1种植， 应用 CTAB 法提取 DNA， 采用 IL088-A7-3 导入片段上的分子标记引物对 NAU3028、 NAU2887、 NAU3380、 NAU2002、 NAU2108、 NAU2186、 JESPR65、 JESPR228、 NAU1362 进行 PCR 扩增， 选择同时含有 9 个分子标记条带分别为 225bp ； 450bp ； 395bp ； 600bp ； 350bp ； 360bp ； 145bp ； 310bp ； 335bp 的单株自交获得 BC2F2， 种子按单 株收获 ； 引物对产物大小 bp 正向引物序列 53。
5、反向引物序列 53 NAU3028225GCTCACAAGTTCCAACATCAAAGAAATTACAAGCCCATGC NAU2887450CACCATGAGCCACTAATTCAACACATTTTTCCCTTTTTGG NAU3380395CACCATGAGCCACTAATTCAGAGAGACAGTGAGCAAACGA NAU2002600GCCCTTTTTGGTAGATGAACATCACTTCAGCTGGGGTTT NAU2108350GGGGACTTCATCTGGTTCTACAGTAGGCCAAGTCTCTCGT NAU2186360CAAAACGCTTTCGAATACAAGATTAC。
6、ACCGCAGAGTCCTT JESPR65145CCACCCAATTTAAGAAGAAATTGGGTTAGTTGTATTAGGGTCGTTG JESPR228310CAGAACAACACCATCAACACTCTCAGGGCAAGCAAAGCAAAACTC NAU1362335TCTGATTTGCTGATTGGAAACTTATTCGGACTTGGTTGCT 3) 分子标记辅助第二次前景选择 ： 种植 BC2F2， 每株提取 DNA 后， 再利用分子标记引 物对 NAU3028、 NAU2887、 NAU3380、 NAU2002、 NAU2108、 NAU2186、 JESPR65、 JESP。
7、R228、 NAU1362确定BC2F2单株的基因型， 同时只有9个分子标记条带分别为225bp ； 450bp ； 395bp ； 600bp ； 350bp ； 360bp ； 145bp ； 310bp ； 335bp 的单株自交获得 BC2F3， BC2F3中选择纤维长度 30.40-31.60 mm， 纤维强度32.6-34.5cN/tex， 马克隆值3.43-4.19， 单铃重5.08-5.85 g， 衣 分 38.2-41.3% 的家系， 即为改良棉花纤维强度和马克隆值的育成品系。 权 利 要 求 书 CN 102229981 B 2 1/4 页 3 一种改良棉花纤维强度和马克隆。
8、值的分子育种方法 0001 （一） 技术领域 ： 0002 本发明一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花纤维强度和马克隆值的分子 育种方法， 专用于快速、 有效地选育与生产纤维强度和马克隆值都优良的棉花新品系 （新品 种） 。 0003 （二） 背景技术 ： 0004 棉花是世界性的重要经济作物。中国是棉花的生产大国， 消费大国和纺织大国。 作为棉花生产大国， 我国主产棉区覆盖 16 个省、 市 （自治区） ， 常年植棉面积 70008000 万 亩， 总产约 600 万吨， 占世界总产的四分之一。随着纺织技术的进步， 纺织产品也从粗支纱 发展到高支纱甚至达到 100 支的细沙， 加工对象也有。
9、一般中绒棉发展到中长绒棉、 长绒棉 和超长绒棉。 王延琴等 （王延琴， 杨伟华， 许红霞， 周大云， 冯新爱， 匡 猛. 中国棉花生 产中存在的主要问题及建议 . 中国农学通报 , 2009, 25(14): 86-90） 20032007 年连续 5 年在三大主产棉区选取 546 个基点， 2201 份棉花样品进行纤维质量检测发现我国陆地棉 样品的纤维长度平均28.8 mm， 变幅24.034.7 mm， 主要处于细绒棉的中绒 （28.031.0 mm） 范围， 即中与长的范围 ； 断裂比强度平均 28.3 cN/tex， 变幅 19.7-38.3 cN/tex， 多数处于 中等 (26.0。
10、29.0cN/tex) 范围， 即中到强的范围 ； 马克隆值平均 4.2， 变幅 2.05.2， 多数在 （3.74.9） 范围。中国棉花基本能满足纺织工业的需要， 但缺乏长度在 31 mm 以上， 断裂比 强度在 34 cN/tex 以上， 马克隆值在 3.74.2 之间的特优质品种， 来满足纺 60 支以上高支 纱的需要。 0005 一般棉花品种纤维品质性状的遗传分析均表现出典型数量性状遗传方式， 易受环 境条件影响。在不同分离群体中， 加性、 显性或上位性效应均可能占主导地位。利用野生种 的高强力性状和海岛棉的优良品质基因杂交渐渗和转育， 是当代育种家获取高强力纤维的 主要途径。 海岛棉。
11、生育期长， 成熟晚， 铃小， 产量低于陆地棉， 但纤维细强， 是纺高支纱原料 ； 而陆地棉的产量高， 适应性广， 纤维品质中等， 但显著优于亚洲棉和草棉。 陆地棉、 海岛棉两 者杂交的 F1可育， 表型正常， 且有明显的产量、 品质的杂种优势， 印度、 以色列、 中国已成功 培育出海、 陆杂交种在生产上大面积推广利用。 但是， 两者杂交的后代表现典型的种间杂交 的疯狂分离， 棉花育种家一直努力想培育出既具陆地棉的高产， 又有海岛棉优质的新品种， 一直没有成功。 分子标记技术在纤维品质改良育种中的应用大大减少了育种过程中选择的 盲目性， 快速实现外源优良种质向栽培品种渗透， 拓宽了品种的遗传基础。
12、。 国内外研究人员 对纤维品质进行了大量的 QTL 定位研究， 有的已经用于标记辅助选择育种实践。 0006 染色体片段导入系(Chromosome segment introgression lines， CSIL)是利用杂 交， 回交和分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS)构建的覆盖作物整个基 因组的一系列近等基因系。它的基因组内只有来自供体亲本的一个纯合的染色体片段， 而 基因组的其余部分与轮回亲本相同。它是进行基因组研究， 特别是 QTL 定位和分子设计育 种的理想材料。万建民 （万建民 . 作物分子设计育种 . 作物学报， 2006,32（3。
13、） ： 455-462.） 已利用由粳稻 Asominori( 轮回亲本 ) 和籼稻 IR24( 非轮回亲本 ) 构建的染色体片段置换 系进行了分子育种的实践。 说 明 书 CN 102229981 B 3 2/4 页 4 0007 （三） 发明内容 0008 技术问题 一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花纤维强度和马克隆值的 分子育种方法， 克服和缓解海陆杂交存在的严重的连锁累赘和， 有利于海岛棉中纤维强度 和马克隆值优良的基因资源导入陆地棉中。回交可以恢复轮回亲本的遗传背景， 同时保存 了非轮回亲本的有利性状， 结合分子标记辅助选择目标性状， 可以快速高效培育纤维强度 和马克隆值都优良的。
14、棉花新品系。 0009 技术方案 0010 一种利用海岛棉染色体片段导入系改良棉花纤维强度和马克隆值的分子育种方 法， 包括 ： 0011 1) 以新疆棉区品种新陆早 38 号为轮回亲本 （） ， 以 IL088-A7-3 染色体片段导入 系为非轮回亲本 （） ， 杂交 1 代， 回交 2 代获得 BC2F1， 每代都是混收混种 ； 0012 2) 分子标记辅助第一次前景选择 ： BC2F1种植， 应用 CTAB 法提取 DNA， 采用 IL088-A7-3 导入片段上的分子标记引物对 NAU3028、 NAU2887、 NAU3380、 NAU2002、 NAU2108、 NAU2186、 。
15、JESPR65、 JESPR228、 NAU1362 进行 PCR 扩增， 选择同时含有 9 个分子标记 条带 （分子量分别为 225bp ； 450bp ； 395bp ； 600bp ； 350bp ； 360bp ； 145bp ； 310bp ； 335bp） 的单 株自交获得 BC2F2， 种子按单株收获 ； 0013 引物对产物大小 （bp）正向引物序列 （53）反向引物序列 （53） NAU3028225GCTCACAAGTTCCAACATCAAAGAAATTACAAGCCCATGC NAU2887450CACCATGAGCCACTAATTCAACACATTTTTCCCTTTTT。
16、GG NAU3380395CACCATGAGCCACTAATTCAGAGAGACAGTGAGCAAACGA NAU2002600GCCCTTTTTGGTAGATGAACATCACTTCAGCTGGGGTTT NAU2108350GGGGACTTCATCTGGTTCTACAGTAGGCCAAGTCTCTCGT NAU2186360CAAAACGCTTTCGAATACAAGATTACACCGCAGAGTCCTT JESPR65145CCACCCAATTTAAGAAGAAATTGGGTTAGTTGTATTAGGGTCGTTG JESPR228 310CAGAACAACACCATCAACACTCTCA。
17、GGGCAAGCAAAGCAAAACTC NAU1362335TCTGATTTGCTGATTGGAAACTTATTCGGACTTGGTTGCT 0014 3) 分子标记辅助第二次前景选择 ： 种植 BC2F2， 每株提取 DNA 后， 再利用分子 标记引物对 NAU3028、 NAU2887、 NAU3380、 NAU2002、 NAU2108、 NAU2186、 JESPR65、 JESPR228、 NAU1362 确定 BC2F2单株的基因型， 同时只有 9 个分子标记条带 （分子量分别为 225bp ； 450bp ； 395bp ； 600bp ； 350bp ； 360bp ； 14。
18、5bp ； 310bp ； 335bp）的单株自交获得 BC2F3， BC2F3即为改良棉花纤维强度和马克隆值的育成品系， 所述的改良棉花纤维强度和马克 隆值的 BC2F3中选择纤维长度 30.40-31.60 mm， 纤维强度 32.6-34.5cN/tex， 马克隆值 3.43-4.19， 单铃重 5.08-5.85 g， 衣分 38.2-41.3% 的家系， 即为育成品系 “南农海导 3 号” 。 该品系纤维强度较新陆早38号显著增加， 马克隆值较新陆早38号号显著降低， 纤维长度和 产量与轮回亲本新陆早 38 号号相当。 0015 有益效果 ： 本发明所提供的一种利用海岛棉染色体片段导。
19、入系改良棉花纤维强 度和马克隆值的分子育种方法与传统的回交聚合育种技术相比具有如下优点 ： 传统的回交 聚合育种技术存在杂交工作量大、 选择可靠性差、 育种周期长的缺陷。 通过分子标记辅助选 择目标性状， 可在 2-3 年内快速高效培育出高产、 优质等多目标性状的棉花新品系。 0016 “南农海导 3 号” 的主要优点 ： 以海岛棉染色体片段导入系IL088-A7-3 为供体 说 明 书 CN 102229981 B 4 3/4 页 5 材料， 以新陆早 38 号为轮回亲本， 通过分子标记辅助选择获得了产量与轮回亲本新陆早 38 号相当， 纤维强度显著增加， 马克隆值显著降低的棉花新品系 “南。
20、农海导 3 号” 。 该品系的 纤维强度 32.6-34.5cN/tex， 马克隆值 3.43-4.19。 0017 （四） 附图说明 ： 0018 图 1 分子标记辅助选择纤维强度和马克隆值优良的棉花新品系 0019 （五） 生物保藏 ： 0020 IL088-A7-3 为陆地棉 （Gossypium hirsutum.） ， 2011 年 3 月 15 日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国 科学院微生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.4684。 0021 （六） 具体实施方式 ： 0022 选择亲本 ： 南京。
21、农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室棉花研究所以陆 地棉遗传标准系 TM-1 为轮回亲本， 抗病、 优质的海岛棉海 7124 品系为供体亲本 （非轮回亲 本） ， 在回交高世代结合覆盖全基因组的 SSR 分子标记辅助选择， 培育了国内首套陆地棉遗 传标准系 TM-1 背景的海岛棉染色体片段导入系 174 个， 其基因组的覆盖率达 83.5%。通过 对海岛棉染色体片段导入系进行连续 2 年的棉纤维品质检测， 筛选出纤维长度显著优于对 照的导入系IL088-A7-3。 该导入系纤维长度31.26-31.7mm， 纤维强度34.4-34.5cN/tex， 马 克隆值 4.3-4.4， 单铃重 6。
22、.7-6.8 g， 衣分 35.3-36.2%， 单株铃数 15-19 个， 株高 95-105 cm。 0023 新疆棉区品种新陆早 38 号是新疆生产建设兵团农七师农业科学研究所选育的高 产、 抗病的棉花新品种， 2008 年通过新疆自治区农作物品种审定委员会审定 （品种审定号 ： 新审棉 2008 年 32 号） 。该品种纤维长度 30.62-31.28mm， 纤维强度 31.8-32.1cN/tex， 马克 隆值 4.09-4.19， 单铃重 6.45-6.56 g， 衣分 37.1-37.4%， 单株铃数 8-12 个， 株高 80-85 cm。 0024 品种选育 ： 2007 年。
23、冬季在海南三亚以新疆棉区品种新陆早 38 号为父本， IL088-A7-3 为母本配制杂交 F1。2008 年夏季在南京农业大学江浦试验站分别种植一行新 陆早38号和F1， 以新陆早38号为父本， F1为母本配制杂交组合产生BC1F1， 成熟后全部混收。 2008 年冬季在海南三亚分别种植一行新陆早 38 号和 BC1F1， 以新陆早 38 号为父本， F1为母 本配制杂交组合产生 BC2F1， 成熟后全部混收。田间管理按常规方法进行。 0025 分子标记辅助选择 ： 2009 年夏季在南京农业大学江浦试验站种植 3 行 BC2F1， 每 行 10-12 株， 每株采集 3-4 片未展开的叶片。
24、放入 1.5ml 的 eppendorf 管中， 并加入预冷的 新鲜配制的提取缓冲液 600 l， 电钻研磨， 应用 CTAB 法 （Paterson AH, Brubaker CL, Wendel JF. A rapid method for extraction of cotton （Gossypium spp.） genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis J. Plant Mol Biol Rep, 1993, 11, 2: 122-127） 提取 DNA， 采用 IL088-A7-3 导入片段上的分子标记 （表 1） 进行 PCR 扩增。
25、， 扩增体 系 10l， DNA 模板 1l， 94预变性 5min， 94变性 0.5min， 57复性 0.5min， 72延伸 1min， 30 个循环后， 72再延伸 10 min， 扩增产物经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ： 凝胶浓度 为 8%， 电泳缓冲液为 0.5 倍 TBE， 170V 恒压电泳 1.5 小时。选择含有 3 个分子标记的 5 个单 株自交获得 BC2F2， 种子按单株收获。 0026 2009 年冬季在海南三亚每个 BC2F2种植 3 行， 每行 10-12 株， 共计 15 行， 150-180 株， 每株采集叶片， 提取 DNA 后， 利用表 1 提供的分子标记。
26、确定 BC2F2单株的基因型， 选择 3 个标记都是纯合的单株自交获得 10 株 BC2F3。 说 明 书 CN 102229981 B 5 4/4 页 6 0027 田间鉴定 ： 2010 年夏季， 每个 BC2F3在新疆种植 2 行， 每行 15-20 株， 两次重复。成 熟后按行混收棉花后， 每行取12克皮棉样品， 重复2次， 送河南棉花质量检测中心检测皮棉 品质。 以上所述的改良棉花纤维强度和马克隆值的BC2F3中选择纤维长度30.40-31.60 mm， 纤维强度32.6-34.5cN/tex， 马克隆值3.43-4.19， 单铃重5.08-5.85 g， 衣分38.2-41.3%的。
27、 家系， 即为育成品系 “南农海导 3 号” 。该品系纤维强度较新陆早 38 号显著增加， 马克隆值 较新陆早 38 号显著降低， 纤维长度和产量与轮回亲本新陆早 38 号相当。 0028 表 1 IL088-A7-3 导入片段的 SSR 分子标记 0029 引物对产物大小 （bp）正向引物序列 （53）反向引物序列 （53） NAU3028225GCTCACAAGTTCCAACATCAAAGAAATTACAAGCCCATGC NAU2887450CACCATGAGCCACTAATTCAACACATTTTTCCCTTTTTGG NAU3380395CACCATGAGCCACTAATTCAGAG。
28、AGACAGTGAGCAAACGA NAU2002600GCCCTTTTTGGTAGATGAACATCACTTCAGCTGGGGTTT NAU2108350GGGGACTTCATCTGGTTCTACAGTAGGCCAAGTCTCTCGT NAU2186360CAAAACGCTTTCGAATACAAGATTACACCGCAGAGTCCTT JESPR65145CCACCCAATTTAAGAAGAAATTGGGTTAGTTGTATTAGGGTCGTTG JESPR228 310CAGAACAACACCATCAACACTCTCAGGGCAAGCAAAGCAAAACTC NAU1362335TCTGA。
29、TTTGCTGATTGGAAACTTATTCGGACTTGGTTGCT 0030 注 : JESPR 来自 Reddy 等 （Reddy O U K, Pepper A E , Abdurakhmonov I Y, Saha S , Jenkins J N , Brooks T D , Bolek Y, El2Zik K M1 The identification of dinucleotide and trinucleotide microsatellite repeat loci from cotton G. hir sutum L. J Cotton Sci , 2001 , 5: 10。
30、3-113） 公布的序列 ; NAU 编号的引物 由本实验室从 EST-SSR 序列中开发 （Han Z G, Guo W Z, Song X L, et al. Genetic mapping of EST-derived microsatellites from the diploid Gossypium arboreum in allotetraploid cotton. Mol Gen Genomics, 2004, 272: 308327; Han Z G, Wang C B, Song X L, et al. Characteristics, development and map。
31、ping of Gossypium hirsutum derived EST-SSRs in allotetraploid cotton. Theor Appl Genet, 2006, 112: 430439 ； Wangzhen Guo, Caiping Cai, Changbiao Wang, et al. A preliminary analysis of genome structure and composition in Gossypium hirsutum. BMC Genomics, 2008, 9: 314-331. ） . 所有的引物信息可以从网站 www.cottonm。
32、arkers.org 上下载。 说 明 书 CN 102229981 B 6 1/5 页 7 序列表 南京农业大学 一种改良棉花纤维强度和马克隆值的分子育种 方法 说明书 00 2011-04-11 18 PatentIn version 3.1 1 20 DNA 人工合成 NAU3028 正向引物序列 (1).(20) 1 gctcacaagt tccaacatca 20 2 20 DNA 人工合成 NAU3028 反向引物序列 (1).(20) 2 aagaaattac aagcccatgc 20 3 20 DNA 人工合成 NAU2887 正向引物序列 (1).(20) 3 caccat。
33、gagc cactaattca 20 4 20 序 列 表 CN 102229981 B 7 2/5 页 8 DNA 人工合成 NAU2887 反向引物序列 (1).(20) 4 acacattttt ccctttttgg 20 5 20 DNA 人工合成 NAU3380 正向引物序列 (1).(20) 5 caccatgagc cactaattca 20 6 20 DNA 人工合成 NAU3380 反向引物序列 (1).(20) 6 gagagacagt gagcaaacga 20 7 20 DNA 人工合成 NAU2002 正向引物序列 (1).(20) 7 gccctttttg gtag。
34、atgaac 20 8 19 DNA 人工合成 序 列 表 CN 102229981 B 8 3/5 页 9 NAU2002 反向引物序列 (1).(19) 8 atcacttcag ctggggttt 19 9 20 DNA 人工合成 NAU2108 正向引物序列 (1).(20) 9 ggggacttca tctggttcta 20 10 20 DNA 人工合成 NAU2108 反向引物序列 (1).(20) 10 cagtaggcca agtctctcgt 20 11 20 DNA 人工合成 NAU2186 正向引物序列 (1).(20) 11 caaaacgctt tcgaatacaa。
35、 20 12 20 DNA 人工合成 NAU2186 反向引物序列 (1).(20) 序 列 表 CN 102229981 B 9 4/5 页 10 12 gattacaccg cagagtcctt 20 13 23 DNA 人工合成 JESPR65 正向引物序列 (1).(23) 13 ccacccaatt taagaagaaa ttg 23 14 23 DNA 人工合成 JESPR65 反向引物序列 (1).(23) 14 ggttagttgt attagggtcg ttg 23 15 26 DNA 人工合成 JESPR228 正向引物序列 (1).(26) 15 cagaacaaca c。
36、catcaacac tctcag 26 16 19 DNA 人工合成 JESPR228 反向引物序列 (1).(19) 16 ggcaagcaaa gcaaaactc 19 17 序 列 表 CN 102229981 B 10 5/5 页 11 20 DNA 人工合成 NAU1362 正向引物序列 (1).(20) 17 tctgatttgc tgattggaaa 20 18 20 DNA 人工合成 NAU1362 反向引物序列 (1).(20) 18 cttattcgga cttggttgct 20 序 列 表 CN 102229981 B 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 102229981 B 12 。