本发明涉及新的叶绿素(Chl)和细菌叶绿素(Bchl)衍 生物，它们的制备和它们在光动力治疗以及在荧光探测和监测技术中 的应用。
近二十年来，人们越来越热心于将光敏剂用于癌症治疗。在这种 被称之为光动力治疗(PDT)技术中，通过以前被用作发色团在其 原位的光致敏作用产生单线态氧，氧原子团和过氧化物 (superoxides or peroxides)并使恶性细胞中毒(Dougherly， 1987)。此项技术是将无毒药剂与无危险性的光敏辐射相结合， 与常用的化学疗法和放射疗法相比具有更好的选择性且不减少其破坏 性，因此有希望用来提高受治疗患者的生存质量。
PDT中使用的光敏剂要有高产率的单线态氧并且对恶性组织有 高亲合力和选择性。激发三线态的形成使卟啉具有相对较高的产率， 并由于此状态与其单线态基态能量的差异使它们成为良好的能量供体， 以激发基态(三线态)氧成为单线态氧。已知有时血卟啉(HP) (图1)和血卟啉衍生物(HPD)，倾向于存在瘤细胞中聚集。因 此，HP和HPD的混合物现已成为PDT的优选化合物。
作为光动力剂使用的商品化HPD混合物photofrin II(Quarda Logic Technologies Inc温哥华，BC，加拿大)含有高比例的 醚键连HP低聚体，它在400nm左右(所谓索瑞带)具有高消光 系数值，但在可见光部分(500-630nm，所谓Q带)其消光 系数小得多，不幸的是，由于动物体组织使UV-可见光(VIS) 大大衰减，HPD在原处的光致敏作用的产率很低。因此，如要有效 地治疗肿瘤，要求有强烈的光照和大量的HPD。由于所用HPD的 量加大，它在正常组织中积累的机会以及随之而来的使非恶性部位受 到损伤的危险性就大大增加了。相对于其类似物，HPD的另一缺点 是从人体中消除缓慢。用HPD治疗的病人在数周内会受到皮肤光毒 作用的伤害。
动物体组织对UV-VIS的强衰减作用以及HPD对恶性部位 有限的专一性促进了对新的光治疗剂的研究和合成，这些光治疗剂能 吸收650nm以上的光并且能提高其在恶性部位的滞留(McRobert 等人，1989)。
为了提高在恶性组织中的滞留和对恶性组织的专一性，试验了在 卟啉结构的吡咯基上连接有不同化学基团的各种卟啉衍生物，通过改 变卟啉π-电子体系实现了相对于HPD化合物吸收的向红效应。
在这些研究中，人们对用Chl和Bchl衍生物作为PDT剂 的兴趣在日益增加(Kreimer-Birnbaum，1989，Spike和 Bommer 1991)。Chls和Bchls分别是二-和四氢卟啉衍生物， 由4个吡咯环和一个把它们相互连接并与Mg原子相连接起来的碳环 所组成，图2所示为叶绿素a(Chla)，图3所示为细菌叶绿素a (Bchla)，M表示Mg，R基团在Bchla中为植基或牻牛儿基牻牛儿 基，在Chla中为植基。由于Bchla分子上有二个被还原的附加β-碳 (吡咯环的外同碳原子)因而不同于Chla分子。Chls和Bchls的改变 是由于大环上的取代基或者是酯化17-位丙酸残基的醇残基的变化 而引起的。例如天然存在的Bchla其醇残基为植基或牻牛儿基牻牛儿 基，而Bchlb中为牻牛儿基牻牛儿基。由叶绿素和细菌叶绿素衍生得 到的酸分别被称作脱植基叶绿素(Chlide)和细菌脱植基叶绿素 (Bchlide)。由Chla和Bchla衍生的游离酸分别是Chlidea和Bchlidea 没有中心金属原子的从Chl和Bchl衍生的化合物分别被称作脱镁叶绿素 (Pheo)和细菌脱镁叶绿素(Bpheo)。由Chla和Bchla衍生的脱镁叶 绿素分别被称作Pheoa和Bpheoa。由脱镁叶绿素和细菌脱镁叶绿 素衍生的游离酸分别称作脱镁叶绿素甲酯-酸和细菌脱镁叶绿素甲酯 -酸。
Chls和Bchls吸收太阳能并与生物光合作用中引发电子转移。已 经发现在单体形式下最低的能量转移(所谓的Qy转移)是在670 -800nm，而在聚集状态下可移至1000nm。这些转移有极 高的消光系数。由Chls和Bchls的激发单线态氧到它们的最低三线态 的系统间过渡的概率是相当高的(30-50％)，并确有高产率的 激发态氧分子。事实上，由Chls和Bchls引起的氧的光致敏作用强调 了这样一个事实，即它们包含于光合成细菌和植物的重要降解过程之 中，因此，所有的光合成有机体对单线态氧或氧原子团具有各种保护 机制。因为Chls和Bchls通常是由动物体消耗的天然化合物，因此相 对于HP和HPD，它们在体内的降解速度很快(Llewellyn等， 1990)，这是一个很重要的优点，它使病人需接受的过长时间照 射减少。
但是，在把天然Chl或Bchl萃取物用于PDT时还有某些问题。 首先，由于它们是强疏水性的，因此难以被传输至恶性部位；其次， 在正常的传输条件下，即在室温，有氧存在下以及在正常光照条件下 是很不稳定的；第三，它没有一个部分能把它们专一的瞄准到恶性组 织上。由于这些局限性，这些光合成色素作为PDT的致敏剂的可能 性目前难以实现。人们很希望合成能够克服上述缺点又能成功地用于 PDT的Chl和Bchl衍生物。本发明的目的就是提供这们的衍生物。
Chl和Bchl的侧链基团决定了分子对不同环境的总的亲合力。
根据本发明，已经发现修饰Chl和Bchl结构C17-丙酸侧基上的 酯基可以制出在治疗和诊断中能用作光敏剂的新的Chl和Bchl衍生物。
因此，本发明涉及通式I的新颖Chl和Bchl衍生物
X-CO-Y-A-R I 其中
X-CO-表示C17-丙酰基Chl和Bchl残基；Y是O，S或
NH；A是共价链或是含有2-20个碳原子的直链或支链、饱
和或不饱和烃基链，它可以是取代的和/或被官能团、杂原子和
/或碳环或杂环部分断开；以及R是氨基、肽或蛋白质残基或其
衍生物。
这里的术语“Chl和Bchl残基”是指任何Chl和Bchl衍生物，包括 天然和合成衍生物，包括其中心Mg原子被消除或被其它二价金属， 如Zn、V、Cu、Co、Ni或Sn取代的化合物。根据本发明 Bchl是优选的。
在优选实施方案中，Y是O和X-CO-是分别如图2和图3所 示的Chla或Bchla的残基。
烃基链A优选具有5-20个碳原子，可以是取代的或未取代的， 可被杂原子，如O、N、和/或S断开，和/或被单-或多-碳环或 杂环部分，和/或被官能团，如OH、NH2、CONH2、COOH等取代或断开。例如A可以包括或者可以是碳水化合物如单糖或低聚 糖、或甘油三酯或其它类脂部分的残基，多碳环化合物例如甾类化合 物，如胆甾醇的残基，或杂环化合物如vracyl和2，5-二氧代- 3，6-二羟甲基哌嗪的残基以及vracylA，可通过例如酯、酰胺、 醚等官能团连接于R。
R基团可由氨基酸或其衍生物衍生，如由丝氨酸、酪氨酸和赖氨 酸或其衍生物如L-丝氨酸或赖氨酸甲酯衍生，或者由肽，如丝氨酰 丝氨酸甲酯、促黑激素(MSF)，衍生，或由蛋白质衍生。
特别是由本发明可预计到Chl和Bchl和不同氨基酸的接合， 以及这些Chl/Bchl氨基酸接合体与激素、生长因子或其衍生物或肿 瘤特异性抗体，或任何其它细胞特异性配体的进一步接合可得到适当 的定位(Site-directed)的光敏剂(SPD)。本发明中所用 的肽类激素的实例是一种促黑激素(MSH)(melanotropins)， 如α-，β-或γ-MSH，它们特异性地键合于黑素细胞受体，因 此可以使光敏剂部分瞄准到黑素瘤肿瘤上。
本发明还包括制备式I化合物的方法。
本发明还包括含有式I化合物的、用于诊断或光动力治疗目的的 组合物，以及癌症患者的光动力治疗方法，该方法包括用式I化合物 对患者进行处理接着局部照射。
附图说明
图1血卟啉结构，HP：R1＝R2-＝-CHOH-CH3。
图2 Chla结构(M＝Mg，R＝植基)，Chlidea(M＝Mg， R＝H)和pheoa(M＝2H，R＝植基)。
图3 Behla结构(M＝Mg，R＝植基)，Bchlidea(M＝ Mg，R＝H)和Bpheoa(M＝2H，R＝植基)。
图4在叶绿素酶(Chlase)存在下使Chla与L-丝氨酸甲酯 (L-Ser-OMe)的酶催化酯转移作用流程图。
图5 Bchlidea与苄酯基丝氨酰丝氨酸甲酯(Z-Ser2- OMe，其中Z是苄酯基)的催化酯化流程图。
图6下述化合物在100％丙酮中的光吸收谱：(a)Chla， (b)Chla-L-Ser-OMe，(c)Bchla，和(d)Bchla -L-Ser-OMe。
图7 100％丙酮中的光吸收谱：(a)pheoa-L-Ser- OMe，(b)Zn-Pheoa-L-Ser-OMe(c)Cu-Pheoa -L-Ser-OMe。
图8固体的付立叶红外光谱(FTIR)图：(a)Chla， (b)Chlidea和(c)Chla-L-Ser-OMe。
图9固体的付立叶红外光谱(FTIR)图：(a)Bchla， (b)Bchlidea和(c)Bchla-L-Ser-OMe。
图10吸收于培养物的M2R黑素瘤细胞中的Chlidea(用三 角形表示)，Chla-L-Ser-OMe(用圆点表示)和HPD (用方块表示)与培养基中色素浓度的关系曲线。
图11吸收于培养物的M2R黑素瘤细胞中的Bchla-L-Ser -OMe(用圆点表示)和Bchlidea(用三角形表示)与培育基色 素浓度析关系曲线。
图12A-C说明先在有(亮)再在光(暗)照射下用Chla-L -Ser-OMe处理。用下述细胞与[3H]胸苷的结合表明的 PDT效果：(A)M2R小鼠黑素瘤细胞，(B)FS-11人体 包皮纤维细胞，(C)T47D人体乳腺癌细胞。
图13说明光在有(亮)再在无亮(暗)照射下用Chla-L- Ser-OMe处理，以M2R黑素瘤细胞无性繁殖的增加表示的 PDT效果。
图14表明M2R单层细胞与4×10-6M Chla-L- Ser-OMe一起培养1小时并用670nm激光(5MW)照射10 分钟后的相对比度(左)和荧光(右)显微照片。3小时后，将细胞 用propidium Iodide(PID)处理并测定其PID荧光。激光 束照射的环形区域(A)说明了损伤的细胞和从其中分离出死亡细胞 的区域。此区域内的细胞环绕着的保持黑暗的照射区(B)具有正常 的形态(左)。在同样的单层细胞的荧光显微照片(右)中，所有留 在区域(A)中的损伤细胞被PID标记，而区域(B)中的细胞仍 未被染色，因此被认为是未受损伤的。
图15显示了如图14所述处理的M2R单层细胞的相对比度/ 荧光显微照片，照片表示了照射区的界限，可以看出在此区域内在损 伤细胞上PID标记的核(Nu)与对照细胞(C)紧紧相邻，它们 未经照射，所以是正常的形态并有未染色的核。
图16表明未加致敏剂的M2R单层细胞照射10分钟后的相对 比度显微照片，可以看到细胞的形状未有变化，也没有细胞由PID 染色标记(未显示)。
图17为经光动力治疗的裸鼠皮肤的横切面(A：mag×30； B：mag×70)。把裸鼠用Chla-L-Ser-OMe(20mg/Kg)处 理，24小时后照射4小时。再过24小时后将小鼠处死。解剖取下 皮肤并立即用Bouin 固定液固定。把照射过的皮肤组织的石腊断面 用改性trichrome(苏木紫(hematoxilin)/曙红/淡绿，偶磷钼 酸)(phosphoro molybdic acid)染色，在整个试验中照射区的 方位不变。取通过坏死区域(NC)中心的断面，在坏死区域的两边 可以看到未照射的正常皮肤(A)。坏死穿过真皮和表皮，达到皮下 脂肪层，在脂肪脂肪层内典型地带有脂肪液滴。也可看到在坏死区域 正下方的白细胞(LU)的渗透。
图18A-C说明在用Bchla-L-Ser-OMe处理过的CD1裸 鼠体内植入的M2R黑素瘤(T)磁共振图像(MR1)，(A)为 处理前，(B)为第一次处理两周后，(C)为第二次处理两周后。 (B)中可看到某些复发，在(C)中无复发。
图19显示了处理12小时后在CD1裸鼠的几个器官内Chla- L-Ser-OMe的分布。
图20说明了在小鼠MR2黑素瘤细胞培养物中由Chla-α- MSH(实心点)和由α-MSH类似物(园圈)诱导的cAMP的 形成。Chla-α-MSH浓度是由Chl部分的最低可能消光系数测定 的。
本发明提供了Chl和Rchl与氨基酸、肽和多肽的接合体。特别重 要的是下面所得到的接合体：(a)Chl和Bchl与不同的氨基酸及其 衍生物的接合；(b)Chl-和Bchl-氨基酸接合体与激素如α-促 黑激素或(c)与肿瘤特异性受体的进一步接合；和(d)在Chl和 Bchl接合体中的中心Mg被金属取代，它们改进了三线态的产率。
在一优选实施方案中A是共价键，Y是O以及R残基是通过酯键 直接接到Chl或Bchl的C17-丙酸基团上。这些化合物是用下面二 种方法之一制备的：
(1)如图4所示用叶绿素酶(Chlase)的酶催化酯转移作用的 新方法，该酶是由丙酮从植物的叶绿体萃取的并以丙酮粉末的形式贮 存。于37℃，在含有洗涤剂的缓冲溶液中把叶绿素酶丙酮粉末与伯 醇R-OH，如L-丝氨酸甲酯一起培养1小时，然后在得到的悬浮 液中加入Bchl或Chl的衍生物，如Bchla或Chla，再于37℃下培养。 去除固体丙酮粉末后，由反应混合物中萃取所需酯并进行纯化。
(2)使Chlide和Bchlide衍生物，如Chlidea或Bchlidea与 R-OH化合物，如Z-Ser2-OMe催化缩合的新方法，使用N-羟 基琥珀酰亚胺(NHS)和二环己基碳化二亚胺(DCC)或4-二 甲氨基吡啶(DMAP)和DCC活化Chlide或Bchlide的羧基(图 5)。后一方法可用于脱镁叶绿素甲酯-酸和细菌脱镁叶绿酸甲酯- 酸，它们分别是Chlidea和Bchlidea的无镁类似物，在此方法中它们 在与1，2-乙二醇缩合前先要活化(Wasielewski 1980)。
用上述方法可制备几种与丝氨酸或其衍生物，如L-丝氨酸甲酯 盐酸化物、N-三苯甲基-L-丝氨酸甲酯、苄酯基丝氨酰-L-丝 氨酸甲酯的酯。这些衍生物本身可用于本发明，或者可以用作把其它 适当分子连接于Chl或Bchl大环上的桥。
当需要酯面所需的肽或蛋白质上又没有含羟基的氨基酸残基时， 首先把Chl或Bchl的大环通过天然化合物的酯转移或通过相应游离酸 (Chlide或Bchlide)的酯化连接于丝氨酸或其它含羟基氨基酸上， 然后通过这种氨基酸或基把肽或蛋白质连接在大环上。
其中Y为S，A为共价键的式(I)接合体可由下面二种方法之 一获得：Chl或Bchl衍生物与叶绿素酶和化合物R-SH，如半胱氨 酸或其衍生物或者含有半胱氨酸的肽或蛋白质的酶催化酯转移作用， 或者是在DCC和DMAP存在下Chlide或Bchlide衍生物与 R-SH化合物的催化缩合作用。
其中Y是NH和A是共价键的式I接合体可以在有DCC和 DMAP存在下或通过NHS和DCC，使Chlide或Bchlide衍生物 与化合物R-NH2，如氨或肽或蛋白质的末端氨基进行催化缩合制 得。
当Chlide或Bchlide衍生物与有含羟基、巯基和/或氨基基团的 氨基酸部分的肽或蛋白质进行反应时，它是否通过O还是S，还是通 过NH基团结合常常是不清楚的，但是不管这些结构的鉴定结果如何， 所有这些结合体都包含于本发明之中。
要制备金属取代的Chl和Bchl衍生物，要在色素与氨基酸或特异 细胞配体结合和取代Mg，将Chl和其衍生物的中心Mg用Cu、 Ni、Zn、V、Co和其它二价金属取代可用标准方法完成，例如 在室温下，于绝对乙醇之中将相应的脱镁叶绿素用所需金属的盐，如 乙酸锌或乙酸铜进行处理(Hambright，1975；Hgnninen 1991)。在Bchl和其衍生物的情况下，要使中心镁被Zn或Cu取代可用类似方法，包括在提高的温度下，氩气中，在冰乙酸中用乙 酸锌或铜进行处理(Fiedor等，1992)。
当A为上文定义的烃基链时，它要含有一个末端官能团，通过该 基团可将其连接于R残基。例如，A的末端羧基与氨基酸的羟基反应， 或者是A的末端羟基与氨基酸的羧基反应形成酯基；使A的末端羧基 与氨基酸的氨基或者使A的未端氨基与氨基酸的羟基反应形成酰氨基 等等。
新的酯分别与Chls和Bchls具有相同的光吸收和光物理特性，因 此，当存在于治疗过的组织中时，可预期新的Chl和Bchl酯是有效的 光动力剂。
把蛋白质，如激素，生长因子或其衍生物和抗体，以及细胞营养 物如酪氨酸接合于Chl或Bchl部分意味着它们在肿瘤和在治疗部位的 滞留增加。增大向红效应使穿选深度更大同时还保持天然体系的随机 性，用其它金属取代镁意味着优选选择Chl或Bchl部分本身固有的和 代谢的稳定性，优选选择至激发三线态的系统间过渡，以及开发新诊 断方法的可能性。
肿瘤特异性抗体使Chl和Bchl部分仅仅瞄准肿瘤或治疗过的部位， 同时激素和细胞营养素还可以被正常的非转化对抗部分吸收。但是， 被选作激素和细胞营养素的靶细胞，例如黑素细胞，在正常条件是分 散于其它细胞之中的，在转化成恶性细胞后，聚集成为固体肿瘤。结 果，预计在恶性组织中的光敏剂浓度相对于正常组织中的浓度会显著 增加，当细胞更分散时，肯定会加强肿瘤部位的PDT效果。这样就 能有效利用比正常组织的损伤阈值更低的光照剂量，因此就降低了对 确定辐射剂量需要。此外它有很强的荧光，定位Chl或Bchl可用作肿 瘤部位或其它目标靶的荧光标记。
本发明的新Chl和Bchl光敏剂选用于治疗黑素瘤，理由如下： (a)早期(非转移的)、恶性黑素瘤和其它皮肤肿瘤很容易进行 PDT；(b)到目前为止对黑素瘤的治疗用绿光的光动力治疗以及 常规的化学治疗和放射治疗都不成功；(c)但是有几种黑素瘤特异 配体，它们可以使光致敏部分瞄准肿瘤部位，以及(d)用长波激发 Chl和Bchl部分可能会克服常规光敏剂和缺点，该常规光敏剂屏蔽黑 色素的吸收。
黑素瘤是由黑素细胞致癌转化形成的(包括UV-诱导的诱变作 用)。正常的黑素细胞包括有少量百分数的正常人体皮肤细胞，并且 通常会发现它是在表皮和真皮之间的基细胞层内，表皮和真皮之中的 每一种都由30-40个角度化细胞和一个朗格罕氏细胞所包裹。在 治疗黑素瘤时PDT面临着特别困难的问题，因为黑素瘤细胞中会含 有不溶性黑eumelanins(聚-5，6-吲哚醌)，它在540nm左 右有宽的吸收谱带，因此，对波长小于650nm的射线，它们与任何 光敏剂都有一个竞争的问题，此外，黑色素分子能抑制已经形成的那 些氧原子团，从而防止有生命力的细胞的细胞器中毒。因此，用通常 使用的HPD进行黑素沉着病的黑素瘤的PDT不是很有希望的。但 由于激发的Chls和Bchls和它们的合成衍生物在650nm以上的波长 有最大的光吸收，所以它们不会被黑色素遮盖。再者，黑素瘤细胞 (即转化的黑素细胞)在合成黑色素过程中要消耗相当大量的酪氨酸， 它们对促黑激素(melanotropins)(垂体的α-，β和γ-促黑 激素(MSH)))和某些已知的抗体有高亲合力。所以它们是Chl 和Bchl的酪氨酸-，melanocortin-或抗体-接合体的良好目标靶， 条件是其接合不能通过细胞受体对配体的识别大的影响。由于在黑 素瘤部位折黑素细胞浓度以40左右的倍数增加(相对于正常皮肤组 织)，预计光动力效应要大大增加。
因此，本发明提供了含有本发明的Chl或Bchl衍生物的药物组合 物，它们可用于几类癌症的光动力治疗，包括脑、卵巢、乳房肿瘤和 皮肤、肺、食道和膀胱的癌症以及其它对激素敏感的肿瘤。
在一实施方案中，本发明涉及恶性黑素瘤的光动力治疗。可以监 测到化合物对肿瘤和细胞培养物中的黑素瘤细胞的光动力效应。可用 于此目的衍生物实例是Chl或Bchl与α-促黑激素的接合体，通过丝 氨酸、酪氨酸或赖氨酸残基连接于色素部分或者通过末端氨基连接于 色素部分。
本发明的药物组合物可以PDT所用的标准方法给患者用药。用 药量和用药途径可根据肿瘤的种类、疾病的不同阶段、患者的年龄和 健康状况来决定，但要比Photofrin II的常用剂量20-40mg HPD/Kg体重左右要低得多。优选的用药途径是把含有常规药用载 体和添加剂活性化合物的含水溶液进行静脉注射或直接注射到固体肿 瘤中，并用适当的局部用组合物进行皮肤肿瘤的局部治疗。
本发明还涉及癌症的光动力治疗方法，包括给受到固体肿瘤癌症 折磨的患者施用含有本发明Chl或Bchl衍生物的药物组合物，然后用 670-780nm的强光源照射肿瘤部位。
由此可预见到本发明的Chl和Bchl衍生物的几种应用，例如用定 位光动力治疗(SDP)对良性或恶性细胞或组织进有光破坏。接合 体把Chl或Bchl分子带到肿瘤组织中通过转移聚集起来的细胞中，并 且能同正常组织中的细胞互分离(如黑素瘤中的黑素细胞)。其结果， 在肿瘤中光敏剂的光动力效应比在正常组织中的效应可以高出数个数 量级。因此，对肿瘤是破坏性的光照阈值可以减低到对正常细胞为非 破坏性的水平。在这种情况下，即使在非特异性照射下光毒作用也限 于在肿瘤部位。这种应用对于不适于作常规外科手术的肿瘤是特别重 要的。
用双光子过程的光动力治疗(Leupold和Freyer，1992) 是把敏化作用扩展到近红外范围的另一方法。Chl和Bchl衍生物的高 系统间过渡速率以及对长波的最大吸收使它们成为此类PDT中的良 好选择。
本发明的接合体还可用于在有或没有SDP的培养物中的衍生物 以及正常或恶性动物体细胞的光破坏，能够选择性地光破坏在培养物 中的某些类型细胞或病原体的试剂；通过把Chl和Bchl-丝氨酸接合 体连接于特定的多肽，如激素或其它受体的配体，连接于细胞或组织 特异性抗体或连接于其它配体，如卵磷脂，从而使卟啉部分能瞄准选 择的细胞；为实验、诊断和工业应用，为分析目的将分子进行荧光标 记；为实验、诊断或工业应用把动物细胞或衍生物体或粒子进行荧光 标记。由于它们良好的消光系数和高荧光量，可用来代替目前使用的 荧光标记物，如荧光素异硫氰酸酯(FITC)或Phicoerythrine。
为进行诊断，本发明的Chl和Bchl衍生物可用标准方法进行放射 性标记，例如用67Ga、111In、201Tl 99mTc标记， 将放射性诊断剂施用于患者，优选用静脉内注射的方法，几个小时以 后，癌症的部位就可用标准方法成象。
用定位敏化剂进行PDT的好处量大大减少副作用和敏化剂的使 用剂量。用本文提出的Chl和Bchl接合体作PDT的一些特别的好处 是：
(1)这些化合物在人体/动物体组织的光吸收/衰减大大减小 的波长范围内(在单体形式下为660-830nm，在二聚体或更 大聚集体形式下高至1000nm)有最大的光吸收。在光散射减小 的同时，也使穿透深度更大或使用更小的强度和更便宜的光源。
(2)在可见光和近红外波长它们的消光系数比现在PDT所用 的卟啉大差不多10倍。
(3)由于光敏剂有更高的三线态产率，因此中心Mg原子被其 它金属原子取代就增加了单线态氧的产量，并且也使化合物更稳定。
(4)对靶细胞的识别显示出更大的特异性，因此，较低的光敏 剂剂量就足以使细胞坏死。此外，Chl和Bchl结合体比现在所用的许 多荧光剂显示出更优良的光化学性质，所以在其它应用上也是实用的。
(5)一些报告指出某些Chl衍生物由身体中消除的速率高 (Spike和Bommer，1991)。
(6)通常是用激光光源照射，如Ar-抽气染料激光器(Ar- pumped dye laser)调频后发射光为630nm，或者金蒸发激光 器(脉冲式)，发射光为628nm，由于这些设备很昂贵，使 PDT的应用限于较大的医疗中心。使用本发明的红或近红外吸收光 敏剂开创了更方便和更低廉的手段，例如氙闪光灯、卤灯、碘激光器 或直接用太阳光照射。
(7)放射性的或活化标记的Chl和Bchl衍生物可同时用于诊断 和治疗。
用下面的非限定实施例说明本发明。 实施例1：叶绿素a的制备
从Spirullina Galtieri纯化叶绿素a的方法如下：将低压升 华法干燥过的晶粒研成粉末，用丙酮(10ml)萃取三次，过滤萃取 液并弃之。将棕绿色残余物通过研磨用甲醇再萃取，过滤后，弃去淡 灰色固体并从萃取液中真空蒸发溶剂。将绿色残余物再溶解在丙酮中 并在5℃在二乙氨基乙基琼脂糖(Pharmacia Fine Chemicals， DEAE-Sepharose CL-6B)的柱(直径1.5cm，长6cm) 上进行色谱分离。用丙酮洗涤该柱以除去黄色物质(类叶红素)，然 后用甲醇/丙酮(1∶3，V/V)洗脱Chla的深蓝色溶液。色谱分 离所需总时间为10-12分钟。用TLC检测Chla并用分光光度分 析残余的类叶红素和其它杂质如脱镁叶绿素或二氢卟酚，必要时再进 行色谱分离。然后蒸发甲醇/丙酮，将固体Chla在真空下充分干燥并 在-20℃暗中贮存。所有操作均在微亮或暗中进行，并且应尽快完 成以减少降解。使用分析级溶剂，没有进一步纯化。 实施例2：叶绿素酶的制备
由中国楝树(Melia azedarach L China)树叶的叶绿素体制 备叶绿素酶(Chlase)丙酮粉末。将新鲜叶子(50g)与350 ml冷丙酮(-20℃)在捣碎器中捣碎。用纱布过滤匀浆并将滤液在 5℃放置过夜以使叶绿体沉积。过滤除去丙酮并将所得粉末用95％ 丙酮洗涤几次，最后用100％丙酮洗涤，将得到的叶绿素酶丙酮粉 末真空干燥。它可在-20℃贮存至少几个月。 实施例3：丝氨酸衍生物的制备
将下列丝氨酸衍生物用于Chla/Bchla的酯基转移反应：
(a)L-丝氨酸甲酯盐酸化物(L-Ser-OMe·HCl)从Sigma 化学公司购买。
(b)苄酯基丝氨酰丝氨酸甲酯(Z-Ser2-OMe)：此新衍 生物的合成用Nicolaides等人，1968，J.Med.Chem.11： 74-79中所述方法进行。向6.45g(0.027mol)苄酯 基丝氨酸(Z-Ser)的50ml DMF的冷却(5℃)溶液中加入 3.9g(0.028mol)对-硝基苯酚和5.8g(0.028 mol)DCC。将该混合物在5℃放置5小时并过滤。向滤液中加入 从4.2g丝氨酸甲酯盐酸化物和2.7g(0.027mol) Et3N的50ml DMF溶液制备的经过滤的溶液。将反应混合物 在25℃放置18小时然后蒸发至小体积。将残余物溶解在100ml EtOAc中，并用H2O，5％Na2CO3溶液，和稀HCl洗 涤，干燥并蒸发至约30ml。加入石油醚并除去所得固体，从 EtOAc-MeOH-Et2O中重结晶得到Z-Ser2-OMe， mp190-192℃。
(c)苄酯基丝氨酸(Z-Ser)：用于上文(b)合成的此衍生 物的合成按照Moore等人，1954，JACS.76：2884- 2887中所述方法进行。向NaOH(212ml，2N)的冷(5 ℃)溶液中加入44.3g(0.42mol)L-丝氨酸，达到PH 为9.8。在10-15分钟内，将氯甲酸苄酯分批(4-5g)加 入，并用1N NaOH溶液调节PH为9.8，继续加入至到加入 80g(0.46mol)氯甲酸苄酯。然后在10℃保持PH10 0.5小时。将碱性溶液先用150ml再用100ml乙醚萃取并将 1L EtOAc加到水溶液中。通过加入30-35ml浓HCl使 该溶液酸化至PH3并先用250ml EtOAc，再用150ml EtOAc萃取水相。用MgSO4干燥EtOAc溶液并真空浓缩 至Z-Ser已经沉淀。将其从EtOAc中重结晶得到纯晶，mp 117-119℃，总产量79g(78％)。
(d)N-三苯甲基-L-丝氨酸甲酯(Tri-Ser-OMe)： 此衍生物的合成用Guttmann，1962，Helv.Chem.45： 2622所述方法进行。向15.5g(0.01mol)L-Ser- OMe的150ml氯仿冷溶液(0℃)中加入31ml(0.22mol) Et3N和26.7g(0.11mol)三苯基甲烷。将该溶液在0 ℃放置3小时，然后用水洗涤并用Na2SO4干燥。真空蒸发溶剂， 并通过将固体残余物从苯-石油醚(1∶1)的混合物中重结晶得到 纯品28g(77％)。 实施例4：用Chla和L-丝氨酸甲酯的酶催化酯基转移制备L-丝氨 酰甲酯脱植基叶绿素(Chla-L-Ser-OMe) 4.1 Chla-L-Ser-OMe的制备
将200mg叶绿素酶丙酮粉末(实施例2)悬浮在PH为7.6 的6ml 0.5M磷酸钠缓冲液中，其中含有0.7％TX-100 (Triton X-100，Sigma Chem.Co.)，400mg L-丝氨 酸甲酯盐酸化物(Sigma)和70mg抗坏血酸(Merck)。将悬浮液 均化5分钟然后在室温搅拌1小时。将所到悬浮液与5mg固体Chla进 一步均化并用氩气(Ar)饱和。将该混合物在36℃，完全黑暗的 情况下密封培养7小时，同时搅拌。反应过程用硅胶(Merck)TLC 监测，用正己烷∶丙酮-6∶4或1-丁醇作展开剂。可观察到相应 的Chla、Chlidea和标题化合物Chla-L-Ser-OMe三条带。 4.2 Chla-L-Ser-OMe的纯化
将反应混合物加到含有2g NaCl和100mg抗坏血钠 (Sigma)的20ml水中，并在低真空过滤。用丙酮洗涤蓝绿色残余 物并再过滤。合并滤液，用NaCl饱和并且在一个分液漏斗中与乙 醚振摇。收集乙醚相并保持在有固体NaCl存在下约10小时，然 后在干燥氮蒸气中蒸发，将所得蓝绿色生物色素真空干燥。将残余物 溶解在丙酮中并在5℃经过用丙酮平衡的CM-Sepharose CL- 6B柱。用丙酮洗涤该柱至到脱镁叶绿素的棕色带出现，并与Chla- L-Ser-OMe接合体带分离，它保留在柱顶部为蓝绿色带，分别用5 ％甲醇/丙酮和8％甲醇/丙酮洗脱脱镁叶绿甲酯一酸。然后洗脱脱 植基叶绿素，最后用25％甲醇/丙酮洗脱Chla-L-Ser-OMe接合 体。收集最后的蓝绿色级分，用TLC在硅胶上检测纯度，用1-丁 醇展开；用N2吹至干燥，然后真空干燥并在氩气下密封，于-20 ℃黑暗中贮存。产率75％。 4.3 Chla-L-Ser-OMe接合体的结构
Chla、Chlidea和Chla-L-Ser-OMe接合体的光学吸收和 FTIR谱分别如图6和8中所示。每个化合物(在反应混合物中) 在硅胶TLC上出现清晰的点。Chla-L-Ser-OMe接合体(IV)于 CD3OD中的1H-NMR与起始Chlidea比较(表1中列出化学 位移)，与丝氨酸部分的甲基相对应，在3.57ppm和5.31 -5.37ppm有新的单峰，该峰说明再现了酯基带。所有的化合 物都显示出完整的大环结构，但是Chla-L-Ser-OMe接合体IV和 Chlidea没有植基带。
Chla(a)和Chla-L-Ser-OMe接合体(c)(在1728 cm-1具有酯带)的FTIR相似，但是如图8中所示它明显不同于 Chlidea(b)谱。 实施例5：Chla与Z-Ser2-OMe和Tri-Ser-OMe的酶催化酯基 转移
Chla与丝氨酸衍生物Z-Ser2-OMe和Tri-Ser-OMe(上述 实施例3的化合物(b)和(d))的酯基转移如上面实施例4中的 方法进行。TLC说明Chla-丝氨酸衍生物接合体产率为35％并且 没有水解产物。 实施例6：通过Bchla与L-丝氨酸甲酯的酶催化酯基转移制备L- 丝氨酰甲酯细菌脱植基叶绿素(Bchla-L-Ser-OMe)
Bchla与L-丝氨酸甲酯的酯基转移如实施例4中所述方法进有， 生成Bchla-L-Ser-OMe，产率35％。用TLC检测接合体纯度。 Bchla和Bchla-L-Ser-OMe接合体的光学吸收和FTIR谱分别 如图6和9所示。(化学位移列在表1中(化合物VII))。
表1
Chlidea，Bchlidea和它们的衍生物在CD3OD
中的1H化学位移(仅高场强单峰)，ppm 质子 Chlidea Bchlidea IV V VIII IX I II III C-10 9.16s 8.60s 9.6s 9.65s 8.80s 8.80s - - - C-5 9.48s 8.25s 9.5s 9.33s 8.42s 8.45s - - - C-20 8.34s 8.18s 8.55s 8.45s 8.25s 8.34s - - - “酯 - - 5.33m 5.10m 5.33m - - - - 带”* “氨基酸- - - 7.35m 7.35m 6.7-7.35m-6.7- 残基” 7.0q 7.0q C-132 6.46s 6.15s 6.40s 6.70s 6.80s 6.80qs - - - * “酯带“是根据图5的Rchlidea和Z-Ser2-OMe之间的羧基的
酯带。 I Z-Ser2-OMe—苄酯基丝氨酰-丝氨酸甲酯 II L-丝氨酸—L-丝氨酸甲酯 III N-tBOC-Tyr-OMe—N-叔丁氧羰基酪氨酸甲酯 IV L-丝氨酰甲酯脱植基叶绿素a V 苄酯基丝氨酰-丝氨酰甲酯脱植基叶绿素a VII 苄酯基丝氨酰-丝氨酰甲酯细菌脱植基叶绿素a IX N-叔丁氧羰基酪氨酰甲酯细菌脱植基叶绿素a 实施例7：通过Chlidea与Z-Ser2-OMe的催化酯化制备苄酯基丝 氨酰丝氨酰甲酯脱植基叶绿素a
将干燥的Chlidea(3mg)，DCC(5.1mg)，DMAP (1.2mg)和Z-Ser2-OMe(5倍过量)溶解在1ml无水二氯甲 烷中，在Ar中密封并在黑暗中于室温搅拌36小时。在制备硅胶 TLC板上分离标题产物(V)然后在DEAE-Sepharose柱上 纯化。最终产品的NMR如表1中所示。产率81％。 实施例8：通过Chlidea与N-叔丁氧羰基酪氨酰甲酯(N-tBOC- Tyr-OMe)的催化酯化制备N-叔丁氧羰基酪氨酰甲酯脱植基叶绿 素a
将干燥的Chlidea(3.4mg)，DCC(58mg)，DMAP (1.38mg)和N-tBOC-Tyr-OMe(Sigma)(15倍过量) 溶解在1ml无水二氯甲烷中，在Ar中密封并在室温于黑暗中搅拌 40小时。在制备硅胶TLC板上分离该产物并在DEAE- Sepharose柱上进一步纯化。产率25％。 实施例9：通过Bchlidea与Z-Ser2-OMe和N-tBOC-Tyr- OMe的催化酯化制备Bchla-丝氨酸和Bchla-酪氨酸接合体
Bchlidea与上面的每个化合物酯化(缩合)分别如实施例7-8 中关于Chlidea所述方法进行。表1给出了N-叔丁氧羰基酪氨酰甲 酯细菌脱植基叶绿素a(Bchla-N-tBOC-Tyr-OMe：化合物IX) 和苄酯基丝氨酰丝氨酰甲酯细菌脱植基叶绿素a(Bchla-Z-Ser2-OMe：化合物VIII)的NMR位移。 实施例10：用Zn和Cu取代Chls和Bchls中的中心Mg
要将Zn或Cu插入到Chlidea-L-Ser-OMe，于室温下， 在非常温和条件下很容易进行。
通过Chla-L-Ser-OMe与冰酯酸反应的脱金属化得到L-丝氨 酸甲酯脱镁叶绿甲酯-酸a(Pheo-Ser-OMe，化合物X)。将少量 Chla-L-Ser-OMe溶解在几滴乙酸中，10-15秒后，在N2下 蒸发该酸。将带褐色的Pheo-Ser-OMe残余物溶解在2ml 0.1M乙 酸锌(或乙酸铜II)的乙醇溶液中，在搅拌的同时于Ar气氛中在室 温，黑暗中放置20分钟。伴随着可见光范围内吸收光谱的改变同时 发生大环化合物配位状态的改变，并且利用光谱方法可以跟踪反应进 程。该产品的可见吸收光谱如图7所示。在这些条件下，金属化反应 几乎是定量的并且产生纯的Chla-L-Ser-OMe的Zn和Cu衍生 物。 实施例11：培养物中的黑素瘤细胞对Chlidea、Bchlidea以及Chla
和Bchla-丝氨酸接合体的吸附
(a)体外试验
按下述方法进行Chl和Bchl衍生物对黑素瘤细胞亲和力的测试： 将M2R小鼠黑素瘤细胞(Gerst等人，1986)在含有10％ 马血清的DMEM/F12中，在37℃在湿润的8％CO2气氛中 进行单层细胞培养(至100％融合)。48小时后，用不同浓度 (1-100μm)的Chlidea、Bchlidea、Chla和Bchla-丝氨 酸接合体和HPD(Photofrin II)处理上述细胞3小时。为了测 定Chl或Bchl衍生物吸附细胞的程度，抽吸培养基，用磷酸盐缓 冲盐水(PBS)洗涤细胞三次并用丙酮萃取色素。通过将它们的光 学吸收和荧光与丙酮中已知色素不同浓度的光学吸收和荧光进行比较 测定溶液中Chla和Bchl衍生物的浓度。
在马血清存在下培养3小时，吸附于M2R细胞的Chlidea和 Chla-L-Ser-OMe和相应的Bchla衍生物分子的数目如图10和 11所示。正如所看到的，和PhotofrinII(HPD)相比， Chlidea和Chla-L-Ser-OMe可更好的吸附于M2R黑素瘤细胞。 Bchlidea和Bchla-L-Ser-OMe以相同的程度吸附于黑素瘤细胞， 并且分别比photofrin II小1.5倍。吸附分子的数目线性的依赖 于它们在培养基中的起始浓度并且在第1个小时培养期间色素吸附达 到平衡(表2)。在没有血清存在下，Chla-L-Ser-OMe吸附约比 Chla好15倍(没有给出数据)。
表2
细胞吸附
Chla-L-Ser-OMe(2.7×10-5M)与时间的关系 时间，小时 Chla-L-Ser-OMe分子/细胞 1.0 2.7×1071.5 1.3×1082.0 1.3×108
(b)体内测定
将溶解在10％乙醇/PBS的Chl和Bchl经腹膜内(i. p.)注射到小鼠体内。作为对照组，使用不注射的或注射载体的小 鼠。解剖动物组织部分或完整器官(例如脾、肝、脑，等)，在丙酮 中均化然后离心。上清液中含有色素。通过荧光光谱测定上清液中色 素的浓度。 实施例12：Chl和Bchl衍生物对培养物中黑素瘤细胞的毒性
Chlidea和Chla-L-Ser-OMe接合体对培养物中黑素瘤细胞的 光动力效应试验如下：将M2R小鼠黑素瘤单层细胞(至100％融 合)用色素Chla、Chlidea和Chla-L-Ser-OMe处理30分钟。接 着用5mW GaAs二极管激光器在670nm(光源A)， 150W氙灯在500μ爱因斯坦/cm2(光源B)，或90W卤灯 在1500μ爱因斯坦/cm2(光源C)从顶部照射培养物10分钟。 对照组包括未处理细胞，保存在暗中的用色素处理过的细胞和照射过 的未处理细胞。照射三小时后，通过相对照显微镜检查法检查由于照 射引起细胞组织的改变。
对各种Chl和Bchl衍生物的细胞溶解活性进行评价是通过对用 PID染色的单层细胞的光动力处理区域内死亡细胞的估算和对这些 细胞红荧光的监测实现的，这要排除完整的/活细胞和损伤细胞核的 选择性积累，PID为Propidium Iodide([2，7-二氨基- 9-苯基-10-(二乙氨基丙基)菲啶鎓(phenathridium)碘化 物甲碘化物])。通过荧光显微镜测试染色培养物中的发荧光核 (Yeh，1981)。其结果表示在图14和15中。然而，由于这 种方法是以对处理过的细胞培养物的显微镜检测为基础，要对用于大 量细胞培养物的PDT药物进行系统定量筛选和对细胞溶解活性进行 评价时此方法不是最合适的。
另一方面，通过[3H]胸苷结合测定光动力毒性。在这种情况 下，在PDT以后[3H]胸苷结合率的变化用下法测定：将细胞培 养物(4-5×104细胞/穴，约40-50％融合，生长在10 ％牛胎儿血清中)与1μ Ci/ml胸苷[甲基-3H]一起在37 ℃振动2小时。用冷磷酸盐-缓冲盐水(PBS)洗涤培养物两次， 用7.5％冰冷的三氯乙酸(TCA)在4℃处理30分钟，用乙醇 洗涤2次。然后将细胞在37℃溶解在0.3ml 1M NaOH中 15分钟。用100μl 1N HCl和4ml 0.1M咪唑中和 100ml样品并且在20∶8(体积/体积)二甲苯闪烁剂/Lumax 混合物中计数。在用图12A说明的实验中，用数个逐渐增大浓度的 Chla-L-Ser-OMe处理M2R细胞60分钟，接着用光源B照射。 我们知道光动力损伤可以用剂量与24小时后细胞结合[3H]胸苷 能力的减少的相关性来表达。其效果绝对是光依赖的而且在黑暗中的 对照组和未经处理的光照对照组中观察不到。用FS11人包皮纤维 细胞(图12B)和人T47D乳房癌细胞(图12C)(用光源B) 可以获得类似结果。结果用三次重复测定的平均值±SD(标准偏差) 给出。
通过导致无性繁殖系细胞形成的试验测定PDT效果：用各种 Chla-L-Ser-OMe浓度处理细胞并完成照射步骤24小时后，如 上所述(图12A)将培养物进行胰蛋白酶消化作用并且通过台盼蓝 排阻测定可见细胞数。进行适当稀释并将250细胞/穴接种到6- Costar盘中。培养11-12天后，抽出培养基，固定菌落，用甲醇 中的晶体紫染色及在解剖显微镜下统计菌落的数量(每一菌落多于 40个细胞)如在图13中可以看到的，就Chla-L-Ser-OMe而言， 光动力处理减少了以剂量依赖方式生存的细胞数量，但黑暗中的或是 未经处理的照射对照组不是这样。比较图12A和图13的结果说明 了两种方法之间的良好的相关性。结果用三次重复测定的平均值 ±SD给出。
为了使细胞溶解可使用的其它方法包括：(1)按照处理细胞的 [3H]腺嘌呤负载测定细胞溶解活性，(2)通过51Cr负载测定 细胞溶解活性，以及(3)利用电视-录在胶片上的技术测定坏死面 积。当PID的利用仅仅是根据损伤细胞对荧光染料的选择性吸收时， 方法1和2是根据在预培养阶段对放射性示踪剂的吸收以及在第二阶 段中的药物诱导的放射性释放。后二种方法适用于要求对数十个至数 百个样品进行适当重复试验的精细滴定的多次试验。
图14显示了在黑素瘤单层细胞上与4×10-6M Chla-L -Ser-OMe培养30分钟的2个区域。区域A(图14，左)是当区 域B保存在暗中时被照射的区域，经过照射的细胞(区域A)出现明 显缩小，似乎与玻片有些分离，并且它们的细胞膜看起来成为碎片并 且是不规则的。相同培养物(图14，右)的PIDP荧光显微检查 说明细胞损伤被限制在光动力处理区域并且在形态改变和细胞死亡之 间是1∶1关系，同时活的细胞核不显示任何PID荧光(参见图 14左和右的区域A和B)。将照射区的边缘高倍放大显示了带有荧 光核的经PID处理过的细胞，它们是照射过的且与有正常形态和未 染色核的未照射对照组细胞相邻(图15)。在经过同样照射的未处 理对照细胞中可以检测出没有损伤的细胞(图16)。把与4× 10-6M Chlidea一起培养的黑素瘤细胞照射10分钟后，可以 观察到类似的形态变化(没指出)。 实施例13：用Chla和Bchl接合体处理小鼠
(a)肿瘤植入：将M2R细胞按常规保持为单层。将细胞 借助于橡皮淀帚弄碎并悬浮在一般盐水中。在一批C57B1或 CD1雄性裸鼠的胁腹经皮下注射1×106细胞/0.1ml。大约 3-5周后，可以看见肿瘤。这些肿瘤长成一定结构的实心体，植入 7-8周后其质量可达到约10g。用相似的方法将小鼠M2R或人 体黑素瘤肿瘤(FO1，MR1/H/221，HS695T无黑色 素的黑素瘤或SK/MEL/28)植入裸鼠。
(b)注射和照射：
将20mg/Kg Chl和Bchl衍生物Chla-L-Ser-OMe和Bchla- L-Ser-OMe的10％乙醇-PBS溶液经腹膜给小鼠注射。5小时 后，将肿瘤照射1小时。将对照小鼠(i)用乙醇-PBS溶液注射 并照射1小时；(ii)用Chl和Bchl注射并放置于黑暗中。
(c)照射24小时后，通过颈脱臼将小鼠处死。根据需要借助 于组织染色保存肿瘤的部位并且通过标准组织学的切开术途径将肿瘤 进一步处理。
(d)通过注射溶液在10％乙醇/PBS中的化合物来评估在 正常食宿条件下和在没有照射情况下Chl和Bchl-丝氨酸接合体Chla -L-Ser-OMe和Bchla-L-Ser-OMe对C57B1小鼠的毒性。 对照用小鼠仅注射载体。发现注射高达40mg/Kg体重对小鼠行为没 有明显的影响而且至到14天小鼠很好。这个药物剂量是远远大于所 用最高剂量并且还测定了LD50与治疗的EC50值之比(治疗指数的 临界值)。
(e)试验由于病灶照射(5mW Ga/As二极管激光器 670nm)引起的对Chla-L-Ser-OMe-处理的裸鼠的皮肤细胞 毒性。将Chl/Bchl-接合体(20mg/Kg)的10％乙醇/PBS 注射(i.v.)至裸鼠体内，24小时后，照射小鼠皮肤4小时。 对照组小鼠(i)注射乙醇-PBS溶液并放于黑暗中；(ii)不处 理但照射(光源A)4小时。照射24小时后，通过颈脱臼将小鼠处 死。根据需要借助于组织染色方法保存照射区的部位并且将皮肤样品 通过标准组织学的方法进一步处理。发现(图15)对实验动物皮肤 的照射在照射部位造成损伤，形成了穿过真皮、表皮和皮下脂肪层 (SF)的组织坏死。在正对坏死区域下方的范围内通过白细胞的浸 润表明了清楚的免疫应答。邻近坏死区域的非照射皮肤是正常的。在 对照组中没有观察到皮肤照射的迹象(没有给出数据)。
(f)用Bchla-L-Ser-OMe对M2R黑素肿瘤进行光动力处 理：将0.05ml1∶1乙醇∶盐水中的50-150μg Bchla- L-Ser-OMe在麻醉下(戊巴比妥钠，6.0mg/Kg)注射到经预 先植入CD1裸鼠的直径约5-6mm肿瘤中。注射是通过从肿瘤处插 入针头穿过皮肤10-15mm并且从肿瘤内表面将药物传送到肿瘤本 身，以便使肿瘤上面的皮肤和肿瘤的外表面保持完整。然后将麻醉过 的小鼠放在一个床上并且用白卤灯以强度为19000μ爱因斯坦/ cm2照射肿瘤部位60分钟。照射部位的直径为9mm。仅覆盖肿瘤区 域。在几星期内用磁共振成像法(MRI)检测肿瘤结构和大小的变 化。在处理前后肿瘤形状的不同如图18所示。在图18A由高 MR1信号可以清楚地观察到植入在前胸接近肩胛骨处的肿瘤在治疗 前为一亮结构(T)，而84小时后基本消除。两星期后，有点复发 (图18B)。3星期后第二次治疗(Bchla-L-Ser-OMe照射) 没有产生复发。
(g)评价在治疗过的裸鼠和黑鼠的不同组织、器官和肿瘤中的 Chla-L-Ser-OMe残留。将Chla-L-Ser-OMe的10％乙醇/ PBS经腹膜内注射到C57B1雄性、CD1雄性和雌性裸鼠 (20mg/Kg，平均为5-10只小鼠)。将组织样品(脂肪、肌肉、 皮肤、血液)、完整的器官(脾、肝、脑、肺、心等)和肿瘤取出，在 丙酮中均化然后离心。通过荧光光谱测定上清液中色素的浓度。12 小时后Chla-L-Ser-OMe在肿瘤和不同组织与器官中的分布如图 19所示。 实施例14：酪氨酰乙酯脱植基叶绿素和细菌脱植基叶绿素
(a)用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化Chlidea或 Bchlidea
将真空干燥过的Chlidea或Bchlidea(5mg)和无水NHS (9.6mg)和DCC(5mg)的混合物溶解在用氧化铝干燥过的 2ml四氢呋喃(THF)中，将反应混合物在氩气中密封并在室温 搅拌48小时然后再在5℃保存48小时。每步均在黑暗中进行。反 应完成后，在N2中蒸发溶剂并将绿色残余物再溶解于丙酮，使之经 过一个用丙酮平衡过的小的CM-Sepharose柱(Pharmacia， 0.5×0.5cm)，用15-20ml丙酮洗涤该柱并用3-5％甲 醇的丙酮溶液洗脱活化的Chlide(NHS-Chlidea或NHS- Bchlidea)。将洗脱的NHS-Chlidea或NHS-Bchlidea用相 同方法进一步纯化。产量：2.95-4.15mg(50-80 ％)。
(b)将NHS-Chlidea和NHS-Bchlidea和酪氨酸乙酯 (Tyr-OEt)催化接合
将上面步骤中纯化过的NHS-Chlidea或NHS-Bchlidea (2mg)溶解于1ml无水THF并将5mg酪氨酸乙酯(Sigma)加入 到上述溶液中。将反应混合物在Ar中密封并在室温搅拌48小时， 然后在5℃黑暗中放置48小时。用Vydac C-18 HPLC柱 (Alltech Associate Inc.，Deerfield I 11，USA)分析 反应混合物中的组分。分离条件如下：柱-250mm×4.6mm， 填料-Vydac 218TP，颗粒尺寸10μ，孔径尺寸300_；流 动相-乙腈/水(7∶3)；流速-1ml/分钟。在保留时间为 9.5分钟时洗出Chlidea-Tyr-OEt或Bchlidea-Tyr-OEt 接合体。反应产物用CM-Sepharose如实施例4中进行纯化。 实施例15：Chla-和Bchla-α-MSH接合体的制备
α-促黑激素(MSH)具有下式：
Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Tyr- Gly-Lys-Pro-Val-NH2。
氩气下在聚乙烯试管中放入1mg α-MSH于8∶2乙腈和 水混合物中的搅拌过的溶液，试管中还含有0.07mg三乙胺，向其 中加入于小体积乙腈(约0.2ml)中的2.15mg NHS- Chlidea(实施例14a中制备)并且经短时间超声波处理。将反应 混合物在Ar中密封，在室温，黑暗中搅拌66小时。在反应期间， 从反应开始；在0、3、19、45和66小时后由反应混合物中取 出小量试样15μl进行HPLC分析。
将反应混合物的每个试样(15μl)在N2下干燥并再溶解在 含有0.1％TFA的50-100μl 20％乙腈的水溶液(均为 V/V)中。将该溶液注射到C-18HPLC柱。收集下列保留时 间的组分：24分钟-未反应α-MSH；36分钟-Chla-α- MSH接合体；76分钟-Chlidea。分离条件如下：柱-250mm ×46mm；填料-Vydac 218TP，颗粒尺寸10μ，微孔尺寸 300_；流动相A-含0.1％TFA的水；流动相B-含0.1 ％TFA的乙腈；梯度-从0-5分钟为20％B；然后在10分钟 内由20至55％的B和在25分钟内从55到80％的B，然后， 用80％B洗涤；流速1ml/分钟。
用类似方法制备Bchla-α-MSH接合体，但起始物用 Bchlidea。纯化后，收集具有肽和Bchla光谱结构的组分。
将Chla-α-MSH接合体与有效的类似物[Nle4，D- Phe7]-MSH相比较，通过测定其刺激小鼠M2R细胞培养物中 的环状AMP(cAMP)的能力来评价它的生物活性。按Gerst等 人，1986所述可进行cAMP积累。如图20所示，当与α- MSH类似物的活性进行比较时，Chla-α-MSH接合体保持相同 的效力。 实施例16：Chla和Bchla-蛋白质接合体的制备
把几毫克选自牛血清白蛋白(BSA)，γ-免疫球蛋白G (IgG)和花生凝集素(PNA)的蛋白质于缓冲液PBS(0.1 M磷酸盐缓冲溶液，PH＝7.6)中的1ml经过搅拌的溶液在氮气 下装入聚乙烯试管中，其中还含有0.1mg三乙胺(TEA)，将在 实施例14a中制备的过量的NHS-Chlidea或NHS-Bchlidea 的浓丙酮溶液(以10μl一份分成数份在30分钟内加入其中，接 着经短时间超声波处理。
在每种情况下试剂的量如下：
-2.5mg BSA-0.045mg NHS-Chlide
-3mg IgG-0.041mg NHS-Chlide
-1mg PNA-0.070mg NHS-Chlide
将反应混合物在Ar下密封，在室温黑暗中搅拌24小时。
将Chla-或Bchla-蛋白质接合体在Bio-Gel P-10微型柱 (0.5cm×5cm)(Bio-Rad，Hercules Ca.，USA)上纯化。 用在PBS中预膨胀的凝胶制备该柱的方法如下：用PBS平衡后， 用几毫升BSA(1-2mg)的PBS溶液洗涤该柱，用PBS洗脱 过量的BSA。将反应混合物的少量样品(50-60μl)载于该 柱并用PBS洗脱。未反应的NHS-Chlidea或NHS-Bchlidea 保留在顶部，收集沿柱子移动的接合体的绿色带。
Chla-和Bchla-蛋白质在水溶液中形成绿色沉淀，它可通过超 速离心收集。将沉淀与洗涤剂，例如1％ Triton-X-100通过 超声波处理使其再溶解，这个接合体显示了Chla(或Bchla)和蛋白 质二者的光谱结构。它们在UV范围有强的光吸收并且显示了Chla或 Bchla单体或聚合体的谱带(没有给出数据)。
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