用于扩增土壤线虫CO I基因的简并引物组合及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103045589 B (45)授权公告日 2014.02.19 CN 103045589 B (21)申请号 201210571488.4 (22)申请日 2012.12.25 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 北京大学 地址 100871 北京市海淀区颐和园路 5 号 (72)发明人 许崇任 王戎疆 李家练 雷莹 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 用于扩增土壤线虫CO I基因的简并引物组合 及其应用 (57) 摘要 本发明提供一。

2、种用于扩增土壤线虫 COI 基因 的简并引物组合， 所述引物组合包括 7COX1JB-F1 和 7COX1JB-R1 以 及 7COX1JB-F2 和 7COX1JB-R2 （如 Seq ID No.1-4 所示） 。本发明利用巢式 PCR 的方法扩增出土壤线虫的部分 COI 基因片段， 利 用该片段可以有效地对土壤线虫进行分类鉴定， 对操作人员要求不高， 只需熟练 PCR 操作即可， 即 使完全没有线虫形态分类鉴定知识的人也可轻松 完成， 且一次巢式 PCR 就可以同时完成大量样品 的分类鉴定， 节约了鉴定时间， 与传统方法相比， 本发明选择了 COI 基因， 分辨率更高， 可以更有效 地对。

3、土壤线虫进行种的区分， 同时填补了土壤线 虫分类鉴定领域的空白。 (51)Int.Cl. 审查员 李宁 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103045589 B CN 103045589 B 1/1 页 2 1. 用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并引物组合， 其特征在于， 包括 ： 第一对引物 ： 7COX1JB-F1:5 -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3 ， 7COX1JB-R1:5 -AYACCHG。

4、TTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3 ； 以及 第二对引物 ： 7COX1JB-F2:5 -GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3 ， 7COX1JB-R2:5 -ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3 ； 其中， Y 代表碱基 C 或 T， W 代表碱基 A 或 T， K 代表碱基 G 或 T， D 代表碱基 G、 A 或 T， R 代表碱基 A 或 G， M 代表碱基 A 或 C， H 代表 A、 T 或 C， S 代表 G 或 C， N 代表 A、 T、 C 或 G。 2. 含有权利要求 1 所述简并引物组合的用于检测或进行分类学鉴定土壤线虫的试。

5、剂 盒。 3. 根据权利要求 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括 dNTPs、 LA Taq DNA 聚合酶、 PCR 反应缓冲液中的一种或多种。 4. 根据权利要求 2 或 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒还包括标准阳性模板。 5.权利要求1所述简并引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测或进行分类 学鉴定土壤线虫中的应用， 所述应用是非诊断的目的。 6. 根据权利要求 5 所述的应用， 其特征在于， 包括以下步骤 ： 1） 提取样品中的 DNA ； 2） 以步骤 1） 中提取的 DNA 为模板， 进行巢式 PCR 扩增反应 ； 3） 分析 PCR 产物。 。

6、7. 根据权利要求 5 或 6 所述的应用， 其特征在于， 第一轮 PCR 反应体系以 25L 计 为 ： 10M5 端引物 7COX1JB-F12L， 10M3 端引物 7COX1JB-R12L， 10LA Taq 缓冲液 2.5L， 2.5mM dNTP2.5L， 5U/L LA Taq 酶 0.3L， 线虫 DNA2L， ddH2O13.7L ； 第二轮 PCR 反应体系以 50L 计为 ： 10M5 端引物 7COX1JB-F24L， 10M3 端引物 7COX1JB-R24L， 10LA Taq 缓冲液 5L， 2.5mM dNTP5L， 5U/L LA Taq 酶 0.5L， 第 。

7、一轮 PCR 产物 2L， ddH2O29.5L。 8. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 第一轮 PCR 反应条件为 ： 94 5min ； 94 20s， 60 -50 20s， 72 1min， 20 个循环， 上述 60 -50 20s， 每循环降低 0.5 ； 94 20s， 50 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72 10min。 9. 根据权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 第二轮 PCR 反应条件为 ： 94 5min ； 94 20s， 56 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72 10min。 权 利 要 求 书 CN 10304。

8、5589 B 2 1/6 页 3 用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并引物组合及其应用 技术领域 0001 本发明涉及巢式 PCR 技术， 具体地说， 涉及一种用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简 并引物组合及其应用。 背景技术 0002 几乎在所有类型的生态系统中， 从海洋到淡水、 土壤， 从热带到极地地区， 从海拔 最高到海拔最低的区域都有线虫的存在。线虫可以分为自由生活和寄生生活两大类， 自由 生活线虫的取食范围包括细菌、 真菌、 藻类、 原生动物以及腐殖质等， 而寄生性线虫则在动 物和植物中均有发现。土壤线虫是土壤食物链的一个关键环节， 在三条土壤的基本能量通 路 （植物组织、 细菌。

9、和真菌） 中， 致病性线虫参与了植物组织通路， 食细菌和食真菌的线虫参 与了细菌和真菌通路， 而杂食性的线虫则涵盖了所有通路， 这使得线虫越来越多的被应用 于土壤生态系统的指示生物 (Yeates.,G.W.， Bongers,T.,de Goede,R.G.M.,Freckman,D. W.and Georgieva,S.S.1993.Feeding habits in soil nematode families and genera-an outline for soil ecologists.Journal of Nematology， 25:31531)。与其他的土壤 动物相比， 线。

10、虫作为指示生物的优势在于 ： 1) 数量大并且种类丰富， 原生动物的数量也很 丰富， 但是缺乏形态学特征难以分类鉴定， 并且单细胞结构太过简单 ； 2) 生境广泛， 在很多 极端环境都有线虫的存在 ； 3) 容易培养且研究的方法多样 (Andr,H.M.,Ducarme,X.and Lebrun,P.2002.Soil biodiversity:myth,reality or conning?Oikos,96(1):3-24)。 0003 线虫在自然界中数量众多且种类丰富， 仅生活在海洋中的线虫种类可能就超过 100 万种， 而其中只有大概 1000 种得到了鉴定和描述。这是因为从形态学上对线。

11、虫进行 分类鉴定存在非常大的困难 ： 线虫个体小且缺乏鉴定的特征， 在依赖传统光学显微镜的 情况下也难以对鉴定特征进行量化 (De Ley， P.,De Ley， I.T.,Morris,K.et al.2005. An integrated approach to fast and informative morphological vouchering of nematodes for applications in molecular barcoding.Philosophical Transactions of the Royal Society B:Biological Scienc。

12、es,360(1462):1945-1958)。为了解决这个 问题， 越来越多的研究者开始选择利用保守的分子序列来构建分子系统发育树 （molecular phylogenetic tree）来确立分子操作分类单元 （molecular operational taxonomic units,MOTU） 。用于分析的基因序列就称为 “DNA 条码 （DNA barcode） ” ， 而 MOTU 就对应 着传统分类学上 “种” 这个概念 (Blaxter,M.L.2004.The promise of a DNA taxonomy. Philosophical Transactions of 。

13、the Royal Society of London.SeriesB:Biological Sciences,359(1444):669-679)。应用 MOTU 系统可以快速有效地对大多数物种进行鉴定， 因此有很多线虫分类学家开始使用 DNA 条码的方法对线虫进行鉴定分类以及演化过程的 研究。 0004 目前， 利用 DNA 条码技术对线虫进行分类的研究， 相对于线虫庞大的种类数目来 说还远远不够。在绝大部分线虫 DNA 条码的研究中目前较为常用的保守序列片段为 18S rDNA， 但是 18S rRNA 在建树过程中多用于分析属以上的分类单元， 在对一些亲缘关系较近 说 明 书 CN 1。

14、03045589 B 3 2/6 页 4 的物种来说就会显得分辨率不够 (Meldal,B.H.M.,Debenham,N.J.,De Ley， P.et al.2007. An improved molecular phylogeny of the Nematoda with special emphasis on marine taxa.Molecular Phylogenetics and Evolution,42(3):622-636)。虽然有些研究者开始 尝试使用另一个常用的位于线粒体的细胞色素 C 氧化酶亚基 I 基因 （cytochrome oxidase csubunit I,。

15、CO I） 来对线虫进行分类 (Derycke,S.,Vanaverbeke,J.,Rigaux,A.,Backelja u,T.and Moens,T.2010.Exploring the use of cytochrome oxidase c subunit I(COI) for DNA barcoding of free-living marine nematodes.PLoS ONE,5(10):e13716)， 但是 这部分研究多集中于海洋线虫和寄生性线虫， 对于土壤线虫的分类几乎没有。由于海洋线 虫和寄生性线虫的线粒体基因在线粒体上的排列顺序和核酸序列， 与自由生活的土壤线虫 差异。

16、很大， 这些研究所提供的扩增 CO I 的通用引物并不适合土壤线虫 CO I 基因的扩增。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并引物组合。 0006 为了实现本发明目的， 本发明的一种用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并引物组 合， 包括 ： 0007 第一对引物 ： 0008 7COX1JB-F1:5 -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3 ， 0009 7COX1JB-R1:5 -AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3 ； 以及 0010 第二对引物 ： 0011 7COX1JB-F2:5 -GGDGCHC。

17、CTGATATRAGNTTYCCHCG-3 ， 0012 7COX1JB-R2:5 -ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3 ； 0013 其中， Y 代表碱基 C 或 T， W 代表碱基 A 或 T， K 代表碱基 G 或 T， D 代表碱基 G、 A 或 T， R 代表碱基 A 或 G， M 代表碱基 A 或 C， H 代表 A、 T 或 C， S 代表 G 或 C， N 代表 A、 T、 C 或 G。其中， 第一对引物有 2*2*2*2*2*3*2*2*3*2*2*3*3=41472 种组合形式， 第二对引物有 3*3*2*4*2*2*3*3*4*3*4=124416 。

18、种组合形式。在进行巢式 PCR 时， 第一轮 PCR 使用的是第 一对引物的 41472 种排列组合的混合物， 第二轮 PCR 使用的是第二对引物的 124416 种排列 组合的混合物。 0014 本发明还提供含有所述简并引物组合的用于检测或进行分类学鉴定土壤线虫的 试剂盒。 所述试剂盒还包括dNTPs、 LA Taq DNA聚合酶、 PCR反应缓冲液等中的一种或多种。 优选地， 所述试剂盒还包括标准阳性模板。 0015 本发明还提供所述简并引物组合或所述试剂盒在检测或进行分类学鉴定土壤线 虫中的应用， 包括以下步骤 ： 1） 提取样品中的 DNA ； 2） 以步骤 1） 中提取的 DNA 为。

19、模板， 进行 巢式 PCR 扩增反应 ； 3） 分析 PCR 产物。 0016 巢式 PCR 扩增反应如下 ： 0017 第一轮 PCR 反应体系为 25L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F1（10M） 2L， 3 端 引物 7COX1JB-R1（10M） 2L， 10LA Taq 缓冲液 2.5L， dNTP（2.5mM） 2.5L， LA Taq 酶 （5U/L） 0.3L， 线虫 DNA2L， ddH2O13.7L。 0018 第一轮PCR反应条件为 ： 945min ； 9420s， 60-50 （每循环降低0.5） 20s， 72 1min， 20 个循环 ； 94 20s。

20、， 50 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72 10min。 说 明 书 CN 103045589 B 4 3/6 页 5 0019 第二轮 PCR 反应体系为 50L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F2（10M） 4L， 3 端 引物 7COX1JB-R2（10M） 4L， 10LA Taq 缓冲液 5L， dNTP（2.5mM） 5L， LA Taq 酶 （5U/L） 0.5L， 第一轮 PCR 产物 2L， ddH2O29.5L。 0020 第二轮 PCR 反应条件为 ： 94 5min ； 94 20s， 56 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72。

21、 10min。 0021 具体地， 本发明利用几种已知的线虫的 CO I 基因进行序列比对， 根据保守区域设 计通用引物， 再利用通用引物扩增未知种类土壤线虫的 CO I 片段进行验证。流程如下 ： 0022 1） 通用引物设计 0023 从 NCBI 网站上下载七种已知线虫 （秀丽小杆线虫 Caenorhabditis briggsae、 秀 丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans、 嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora、 粪类圆线虫 Strongyloides stercoralis、 小卷蛾斯氏线虫 Steinernema carpoc。

22、apsae、 Strelkovimermis spiculatus 和 Pristionchuspacificus） 的 CO I 基因序列， 其基因 ID 分 别为 5666636、 2565700、 4421891、 37805768、 326200256、 2846681 和 4078882。利用 Clustal X2 软件对这七条序列进行比对， 找出保守的区域， 设计两对简并引物 （Seq ID No.1-4） ： 0024 第一对引物 （扩增长度约为 860bp） ： 0025 7COX1JB-F1:5 -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3 ； 0026 7CO。

23、X1JB-R1:5 -AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3 。 0027 第二对引物 （扩增长度约为 695bp） ： 0028 7COX1JB-F2:5 -GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3 ； 0029 7COX1JB-R2:5 -ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3 。 0030 其中， Y 代表碱基 C 或 T， W 代表碱基 A 或 T， K 代表碱基 G 或 T， D 代表碱基 G、 A 或 T， R 代表碱基 A 或 G， M 代表碱基 A 或 C， H 代表 A、 T 或 C， S 代表 G 或 C， N 代表 A、。

24、 T、 C 或 G。 其中， 第一对引物有41472种组合形式， 第二对引物有124416种组合形式。 在进行巢式PCR 时， 第一轮 PCR 使用的是第一对引物的 41472 种排列组合的混合物， 第二轮 PCR 使用的是第 二对引物的 124416 种排列组合的混合物。 0031 2） 土壤线虫的分离 0032 在直径为 12cm 的玻璃漏斗末端接一段橡皮管， 橡皮管末端用铁夹夹紧， 固定于铁 架台上， 在漏斗内加入一定量的去离子水。将 200g 土壤样品分别用一层纸巾和一层纱布包 裹， 放置于漏斗内， 并补入足量的去离子水使土壤完全浸没， 置于室温条件下分离。分别在 经过 24h、 48。

25、h、 72h 后， 打开铁夹， 放出橡皮管末端内 2mL 左右的水于 50mL 离心管中。最后 一次收集后， 8000g离心5min， 弃上清， 将管底的线虫悬液转移到1.5mL离心管中， 加入等体 积的冻存液 （NaCl5.85g， K2HPO46.8g， 甘油 300g， 1mol/L NaOH5.6mL， 用去离子水定容至 1L， 高温灭菌后， 加入 0.1mol/L MgSO43mL） ， 立即放入液氮中急冻， 再转入 -80冰箱保存。 0033 3） 土壤线虫 DNA 的提取 0034 使用 TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit（血液 / 细胞 / 组织基因。

26、组 DNA 提取试 剂盒） 中的部分试剂。 0035 a. 挑取单条线虫于 200L 缓冲液 GA 中， 加入 20L 蛋白酶 K 溶液， 混匀， 在 56 消化 3h。 0036 b. 加入 200L 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70放置 10min。 说 明 书 CN 103045589 B 5 4/6 页 6 0037 c. 加入等体积的酚 / 氯仿 / 异戊醇 （25 ： 24 ： 1） ， 混匀， 于 12,000rpm 离心 10 分钟。 0038 d. 将上层水相吸入一个新的 1.5ml EP 管中， 加入两倍体积无水乙醇， -20沉淀 30min。 0039 e.12,00。

27、0rpm离心10min， 弃上清， 加入600L漂洗液PW， 混匀， 于12,000rpm离心 10min。 0040 f. 弃去上层的漂洗液， 并在室温彻底晾干。 0041 g. 加入 50L 去离子水溶解 DNA。 0042 4） PCR 扩增及测序 0043 利用巢式 PCR， 分别进行两轮 PCR 来扩增目的片段。 0044 第一轮 PCR ： 0045 第一轮 PCR 反应体系为 25L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F1（10M） 2L， 3 端 引物 7COX1JB-R1（10M） 2L， 10LA Taq 缓冲液 2.5L， dNTP（2.5mM） 2.5L， LA 。

28、Taq 酶 （5U/L） 0.3L， 线虫 DNA2L， ddH2O13.7L。 0046 PCR 条件 ： 94预变性 5min ； 94 20s， 60 -50（每循环降低 0.5） 20s， 72 1min， 20 个循环 ； 94 20s， 50 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72延伸 10min。 0047 第二轮 PCR ： 0048 第二轮 PCR 反应体系为 50L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F2（10M） 4L， 3 端引 物 7COX1JB-R2（10M） 4L， 10LA Taq 缓冲液 5L， dNTP（2.5mM） 5L， LATaq 酶。

29、 （5U/ L） 0.5L， 第一轮 PCR 产物 2L， ddH2O29.5L。 0049 PCR 条件 ： 94预变性 5min ； 94 20s， 56 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72延伸 10min。 0050 将第二轮 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小， 并送公司测序， 在 NCBI 上 Blast 比对鉴定序列信息。 0051 本发明通过设计两对通用引物， 利用巢式PCR法扩增出土壤线虫的部分CO I基因 片段， 利用该片段对土壤线虫进行分类。本发明提供的用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并 引物组合， 可用于自由生活的土壤线虫 CO I 基因。

30、片段的扩增， 利用这段序列可以有效地对 土壤线虫进行分类鉴定。 0052 本发明具有以下优点 ： 0053 （一） 简易性 ： 传统利用光学显微镜做土壤线虫的形态分类鉴定， 对鉴定人的要求 很高， 没有大量土壤线虫形态鉴定经验的人很难胜任。 而利用本发明的通用引物， 只需熟练 PCR 操作即可， 即使完全没有线虫形态分类鉴定知识的人也可轻松完成。 0054 （二） 高效性 ： 传统的形态鉴定需要花费大量时间一个个鉴定标本， 利用本发明的 通用引物， 一次巢式 PCR 就可以同时完成大量样品的分类鉴定， 大大节约了鉴定时间。 0055 （三） 实用性 ： 与其他利用 18S RNA 基因设计引物。

31、做线虫 barcoding 的方法相比， 本 发明选择了CO I基因， 分辨率更高， 可以更有效地对土壤线虫进行种的区分， 同时填补了土 壤线虫分类鉴定领域的空白。 附图说明 0056 图 1 为本发明实施例 2 中利用所述简并引物组合及巢式 PCR 法扩增 20 条线虫的 说 明 书 CN 103045589 B 6 5/6 页 7 CO I基因的PCR产物电泳结果 ； 其中， 最左侧泳道为DNA Marker， 120泳道为120号样品， 21 泳道为空白对照。 具体实施方式 0057 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 均按照常规实验条件， 如。

32、 Sambrook 等分子克隆实验手册 （New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989） 。所用原料均为市售商品。 0058 实施例 1 用于扩增土壤线虫 CO I 基因的简并引物组合的设计 0059 从 NCBI 网站上下载七种已知线虫 （秀丽小杆线虫 Caenorhabditis briggsae、 秀 丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans、 嗜菌异小杆线虫 Heterorhabdtis bacteriophora、 粪类圆线虫 Strongyloides stercoralis、 小卷蛾斯氏线虫 Steinerne。

33、ma carpocapsae、 Strelkovimermis spiculatus和Pristionchus pacificus） 的CO I基因序列， 其基因ID分 别为 5666636、 2565700、 4421891、 37805768、 326200256、 2846681 和 4078882。利用 Clustal X2 软件对这七条序列进行比对， 找出保守的区域， 设计两对简并引物 （Seq ID No.1-4） ： 0060 第一对引物 （扩增长度约为 860bp） ： 0061 7COX1JB-F1:5 -ATACCTWSWWTAATYGGDGGKTTTGG-3 ； 0062。

34、 7COX1JB-R1:5 -AYACCHGTTAAMCCRCCHAHAGTAAA-3 。 0063 第二对引物 （扩增长度约为 695bp） ： 0064 7COX1JB-F2:5 -GGDGCHCCTGATATRAGNTTYCCHCG-3 ； 0065 7COX1JB-R2:5 -ACYTTHACHCCNGTHGGNACAGCAAT-3 。 0066 其中， Y 代表碱基 C 或 T， W 代表碱基 A 或 T， K 代表碱基 G 或 T， D 代表碱基 G、 A 或 T， R 代表碱基 A 或 G， M 代表碱基 A 或 C， H 代表 A、 T 或 C， S 代表 G 或 C， N 代。

35、表 A、 T、 C 或 G。其中， 第一对引物有 2*2*2*2*2*3*2*2*3*2*2*3*3=41472 种组合形式， 第二对引物有 3*3*2*4*2*2*3*3*4*3*4=124416 种组合形式。在进行巢式 PCR 时， 第一轮 PCR 使用的是第 一对引物的 41472 种排列组合的混合物， 第二轮 PCR 使用的是第二对引物的 124416 种排列 组合的混合物。 0067 实施例 2 土壤线虫的分类鉴定 0068 1. 土壤线虫的分离 0069 土壤样品来源于河南安阳。在直径为 12cm 的玻璃漏斗末端接一段橡皮管， 橡皮管 末端用铁夹夹紧， 固定于铁架台上， 在漏斗内加。

36、入一定量的去离子水。将 200g 土壤样品分 别用一层纸巾和一层纱布包裹， 放置于漏斗内， 并补入足量的去离子水使土壤完全浸没， 置 于室温条件下分离。 24小时后， 打开铁夹， 放出橡皮管末端内2mL左右的水， 解剖镜下观察， 用移液枪随机吸取 20 条土壤线虫， 分别放入 20 个 1.5mL 离心管中。 0070 2. 土壤线虫的 DNA 提取 0071 使用 TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit（血液 / 细胞 / 组织基因组 DNA 提取试 剂盒） 中的部分试剂。 0072 1） 在每个含有线虫的 1.5mL 离心管中加入 200L 缓冲液 GA， 加入 2。

37、0L 蛋白酶 K 溶液， 混匀， 在 56消化 3h。 0073 2） 加入 200L 缓冲液 GB， 充分颠倒混匀， 70放置 10min。 说 明 书 CN 103045589 B 7 6/6 页 8 0074 3） 加入等体积的酚 / 氯仿 / 异戊醇 （25 ： 24 ： 1） ， 混匀， 于 12,000rpm 离心 10min。 0075 4） 将上层水相吸入一个新的 1.5mL 离心管中， 加入两倍体积无水乙醇， -20沉淀 30min。 0076 5） 12,000rpm 离心 10min， 弃上清， 加入 600L 漂洗液 PW， 混匀， 于 12,000rpm 离 心 10。

38、min。 0077 6） 弃去上层的漂洗液， 并在室温彻底晾干。 0078 7） 加入 50L 去离子水溶解 DNA。 0079 3. 巢式 PCR 扩增目的片段 0080 PCR 反应时使用去离子水作为空白对照。 0081 第一轮 PCR ： 0082 第一轮 PCR 反应体系为 25L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F1（10M） 2L， 3 端 引物 7COX1JB-R1（10M） 2L， 10LA Taq 缓冲液 2.5L， dNTP（2.5mM） 2.5L， LA Taq 酶 （5U/L） 0.3L， 线虫 DNA2L， ddH2O13.7L。 0083 PCR 条件 ： 。

39、94预变性 5min ； 94 20s， 60 -50（每循环降低 0.5） 20s， 72 1min， 20 个循环 ； 94 20s， 50 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72延伸 10min。 0084 第二轮 PCR ： 0085 第二轮 PCR 反应体系为 50L， 包括 ： 5 端引物 7COX1JB-F2（10M） 4L， 3 端 引物 7COX1JB-R2（10M） 4L， 10LA Taq 缓冲液 5L， dNTP（2.5mM） 5L， LA Taq 酶 （5U/L） 0.5L， 第一轮 PCR 产物 2L， ddH2O29.5L。 0086 PCR 条件 ：。

40、 94预变性 5min ； 94 20s， 56 20s， 72 1min， 40 个循环 ； 72延伸 10min。 0087 第二轮 PCR 产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测， 鉴定片段大小， 结果如图 1 所示， 全部 线虫样品均可扩增出条带， 片段大小符合预期。 0088 4.BLAST 检索结果 0089 将 PCR 产物送公司测序， 获得序列后在 NCBI 网站上进行 Blast 比对鉴定序列信 息。结果显示， 从土壤中随机分离出来的 20 条线虫， 分属于 5 种线虫， 包括秀丽隐杆线虫 Caenorhabditis elegans、 与线虫 Cooperia oncophora。

41、 相似度为 90% 的一种线虫、 与线虫 Stronngyloides mirzai相似度为89%的一种线虫、 与线虫Stronngyloides mirzai相似度 为 89% 的另一种线虫、 与线虫 Ancylostoma caninum 相似度为 81% 的一种线虫。 0090 以上结果表明， 根据从土壤中随机分离出的 20 条线虫， 利用本发明的简并引物组 合， 采用巢式 PCR 的方法全部可以扩增出条带， 经过序列鉴定可分为 5 个种， 特异性强。即 使单条线虫的 DNA 样品， 也可实现精准检测， 灵敏度高。 0091 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的。

42、描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103045589 B 8 1/4 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103045589 B 9 2/4 页 10 0003 序 列 表 CN 103045589 B 10 3/4 页 11 0004 序 列 表 CN 103045589 B 11 4/4 页 12 序 列 表 CN 103045589 B 12 1/1 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 103045589 B 13 。