技术领域
本发明属于天然产物分离纯化技术领域中的植物有效成分提取，特别涉及一种玛咖生物 碱的制备方法及应用。
背景技术
玛咖（Lepidium meyenii Walp.）是十字花科独行菜属草本植物，原产于秘鲁海拔 3500m-4450m的安第斯山区，可在昼夜温差较大、无肥、长期冰封和缺氧的特殊条件下生长， 素有“秘鲁人参”的美誉。高营养价值、合理的营养结构以及多种活性次级代谢物使玛咖具有 多种营养保健功能和药理作用，可用于增强精力、提高生育力、改善性功能、治疗更年期综 合症、风湿症、抑郁症、贫血等，还有抗癌和抗白血病功效。
研究表明，生物碱是玛咖的主要活性成分之一，玛咖生物碱作用于脑垂体和视丘下部， 调节内分泌腺（如肾上腺、甲状腺、胰腺、卵巢等），平衡荷尔蒙；玛咖生物碱可用来补充雌 二醇分泌的不足，故可作为外源雌激素替代物来缓解下丘脑和脑垂体功能亢进；含有玛咖酰 胺和玛咖烯等组分可以促进性欲；此外，体外抑制癌细胞实验表明：玛咖咪唑类生物碱 lepidiline A对FDIGROV细胞有抑制作用（ED50为7.39μg/ml），而lepidiline B则对多种癌 细胞有抑制作用，如UMUC3细胞，PACA2细胞，MDA231细胞和FDIGROV细胞（ED50 分别为6.47、1.38、1.66和5.26μg/ml）。
玛咖中的总生物碱含量很低，仅含有0.2%-0.4%，这给玛咖生物碱的提取和分离纯化带 来了困难，目前，现有文献和专利中玛咖生物碱的提取纯化工艺复杂，需要多步的柱层析纯 化，如专利“玛咖独行菜的咪唑生物碱及其用途”（公开号：CN1684680A）先将玛咖根用SDS 萃取得到萃取物，然后将萃取物溶于酸性水-甲醇溶剂，再用二氯甲烷萃取得到提取物AE； 将AE上Diaion HP-20MG进行吸附，然后进行洗脱，得到四个组分，即A1，A2，A3和A4， 再通过薄层色谱检测，发现A2组分中含有生物碱阳性斑点；然后将A2上硅胶柱层析进行洗 脱，得到7个组分，即B1-B7，再将B5组分经酸性氧化铝柱层析得到粗的生物碱级分，该级 分进一步通过柱色谱和制备型硅胶HPLC进行纯化，得到两种生物碱化合物。专利“玛咖咪唑 生物碱在制备心血管药物中的应用”（公开号：CN101756965A）先将玛咖粉经闪式提取后， 提取液经过滤，浓缩，得到提取浸膏；然后将浸膏用20%甲醇溶解，上大孔吸附树脂，收集 含有生物碱的第三洗脱组分，浓缩，得到玛咖咪唑生物碱粗浸膏；将粗浸膏用氯仿溶解后上 正相柱层析（中性氧化铝柱层析或正相硅胶柱层析），收集含有生物碱的第三、四洗脱组分， 浓缩，得浸膏；再浸膏用甲醇溶解后上C18反相硅胶柱进行层析，收集含有玛咖咪唑生物碱 的第二、三、四洗脱组分，回收溶剂，得到玛咖咪唑生物碱组合物；最后，将玛咖咪唑生物 碱组合物用甲醇溶解后上固相萃取柱（以C8或C18硅胶为填料）进一步纯化，结晶，得到 玛咖咪唑生物碱单体。上述专利虽然可以得到高纯度的生物碱，但采用反复层析的方法得到 单体成分，该方法不仅工序复杂，费时费力，且生物碱的回收率较低，消耗溶剂量过大、成 本过高、不适用于工业化大生产。
发明内容
为了克服现有分离玛咖生物碱技术的不足和缺陷，本发明的目的在于提供一种快速、高 效分离玛咖生物碱单体的制备方法，即使用高速逆流色谱法和正相色谱法从玛咖中分离制备 玛咖生物碱单体的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：
（1）提取：将玛咖粉碎，加入5-20倍的醇溶液提取1-3次，过滤，合并提取液，浓缩， 得到浸膏；
（2）除杂：将步骤（1）所得的浸膏用酸性水溶液溶解，过滤，滤液再用碱液调pH值 至9-12，然后用氯仿或乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱粗提物；
（3）高速逆流纯化：以烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水为溶剂系统，按体积比4-10：1-13： 2-13：1-10进行混合，于分液漏斗中静置过夜后分出上相和下相，脱气；将步骤（2）得到的 玛咖生物碱粗提物用上相、下相或者二者等体积的混合溶液进行溶解，过滤，得到样品溶液； 将配好的上相作为固定相，泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，同时调整主机转速，将配好的 下相作为流动相泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根 据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收集，即得一定纯度的玛咖生物碱；
（4）柱层析纯化：将步骤（3）得到的一定纯度的玛咖生物碱进行硅胶柱层析或氧化铝 柱层析，以氯仿-甲醇或苯-氯仿为洗脱溶剂进行梯度洗脱，收集含有生物碱的洗脱液，回收 溶剂，浓缩，干燥，得到玛咖生物碱化合物。
所述步骤（1）中的酸性醇溶液为甲醇溶液、乙醇溶液或上述两种醇的混合溶液，优选为 70%乙醇溶液；提取方法包括超声提取，微波提取，浸提，回流提取，优选为超声提取。
所述步骤（2）中的酸性水溶液为盐酸溶液、醋酸和硫酸溶液中的一种或两种，其中，酸 的质量分数为0.5-5%；碱液为氢氧化钠溶液、氨水和碳酸钠溶液中的一种或两种。
所述步骤（3）中的溶剂系统包括以下两种：烷烃：脂肪酸酯：脂肪醇：水构成的两相溶 剂体系，或在上述两相体系基础上建立的多元两相溶剂体系。
所述步骤（4）中的氧化铝为中性氧化铝或碱性氧化铝。
本发明制备的玛咖生物碱在制备抗肿瘤药物中的应用，将上述制备的玛咖生物碱与医学 上可接受的辅料混合，制成相应的制剂，所述辅料包括羧丙基甲基纤维素、聚维酮、十八醇、 十六醇、硬脂酸镁、微晶纤维素、淀粉、甘露醇、碳酸氢钠，以及对本发明没有明显影响的 抗氧化剂、氨基酸、维生素、碳水化合物和植物提取物。所述制剂包括片剂、胶囊、颗粒剂、 滴丸和注射剂。
本发明的方法与现有制备玛咖生物碱的方法相比，具有如下技术优势：
（1）本发明将玛咖生物碱粗提物先经氯仿萃取除杂，再以高速逆流色谱进行纯化，最后 利用正相色谱法进一步纯化得到玛咖生物碱单体，工艺过程绿色环保，对环境无严重危害。
（2）本发明操作简单，工艺周期短，节省试剂，洗脱剂可回收利用，降低了生产成本， 提取效率高，适于工业化生产。
（3）玛咖生物碱制备量大。根据所需的目标样品量，可选择不同型号的高速逆流色谱仪 进行分离。其中，制备型高速逆流色谱仪进样量可达几克甚至几十克，一次分离出的玛咖生 物碱单体的量即可约达中试水平。
（4）分离得到的玛咖生物碱化合物在体外能有效抑制多种肿瘤细胞的生长,具有显著的 抗肿瘤活性。
具体实施方式
下面用实施例进一步描述本发明，有利于对本发明及其优点、效果更好的了解，但所述 实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实施例1:玛咖生物碱的制备
取玛咖粉1kg，加入6L20%的乙醇溶液，混匀，超声提取35min，过滤，将残渣再按上 述方法超声提取两次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏。用1%HCl溶解上述浸膏，过滤， 滤液再用氢氧化钠调pH值至9，然后用氯仿萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱 粗提物。
将正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水按体积比5:1:5:1比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分 离出上下相，并超声脱气20min备用。取200mg玛咖生物碱粗提物溶于20ml下相中，振荡 使之完全溶解，以备高速逆流色谱分离。将配好的上相作为固定相，以20ml/min的流速泵入 高速逆流色谱仪的螺旋管中，开启循环水浴并设定恒温器温度为35℃，同时调整主机转速为 700r/min，将配好的下相作为流动相，以2ml/min的流速泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态 平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收 集，待进样3h后，停止主机转动，将固定相推出，固定相保留率为70%，得纯度为75%的 玛咖生物碱。
将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上硅胶柱层析，以氯仿-甲醇按照10:1，7:3进行梯 度洗脱，结合液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥， 得到纯度为98%的玛咖生物碱化合物。玛咖生物碱的液相色谱方法如下：色谱柱为Waters C18 柱子（5μm，4.6mm×250mm），柱温为30℃；流动相为乙腈：水=90:10，流速为0.8ml/min； 检测时间为30min，检测波长为280nm。
实施例2:玛咖生物碱的制备
取玛咖粉5kg，加入50L60%的甲醇溶液，混匀，微波提取20min，过滤，将残渣再按上 述方法提取一次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏。用2.5%醋酸溶解上述浸膏，过滤， 滤液再用氨水调pH值至10，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物 碱粗提物。
将正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水按体积比5:5:7:5比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分 离出上下相，上相加入10mM的三乙胺，下相加入10mM的HCl，并超声脱气15min备用。 取300mg玛咖生物碱粗提物溶于20ml下相中，振荡使之完全溶解，以备高速逆流色谱分离。 将配好的上相作为固定相，以10ml/min的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，开启循环水 浴并设定恒温器温度为20℃，同时调整主机转速为800r/min，将配好的下相作为流动相，以 3ml/min的流速泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据 检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收集，待进样4h后，停止主机转动，将固 定相推出，固定相保留率为60%，得纯度为80%的玛咖生物碱。
将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上中性氧化铝柱层析，以苯-氯仿按照1:1进行洗脱， 结合液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到纯度 为96%的玛咖生物碱化合物。玛咖生物碱的液相色谱方法如下：色谱柱为Waters C18柱子 （5μm，4.6mm×250mm），柱温为30℃；流动相为乙腈：水=90:10，流速为0.8ml/min；检测 时间为30min，检测波长为280nm。
实施例3:玛咖生物碱的制备
取玛咖粉3kg，加入45L50%甲醇，混匀，浸提15min，过滤，将残渣再按上述方法浸提 两次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏。用3%HCl溶解上述浸膏，过滤，滤液再用碳 酸钠调pH值至11，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物碱粗提物。
将正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水按体积比6:3:5:7比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分 离出上下相，并超声脱气30min备用。取400mg玛咖生物碱粗提物溶于20ml等体积的上下 相中，振荡使之完全溶解，以备高速逆流色谱分离。将配好的上相作为固定相，以25ml/min 的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中，开启循环水浴并设定恒温器温度为25℃，同时调整 主机转速为900r/min，将配好的下相作为流动相，以2.5ml/min的流速泵入柱内，待柱内溶剂 体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色 谱方法进行收集，待进样2.5h后，停止主机转动，将固定相推出，固定相保留率为65%，得 纯度为85%的玛咖生物碱。
将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上碱性氧化铝柱层析，以氯仿-甲醇按照10:0，8:2 进行梯度洗脱，结合液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩， 干燥，得到纯度为99%的玛咖生物碱化合物。玛咖生物碱的液相色谱方法如下：色谱柱为 Waters C18柱子（5μm，4.6mm×250mm），柱温为30℃；流动相为乙腈：水=90:10，流速为 0.8ml/min；检测时间为30min，检测波长为280nm。
实施例4:玛咖生物碱的制备
取玛咖粉2kg，加入36L80%乙醇溶液，混匀，回流提取40min，过滤，将残渣再按上述 方法回流提取一次，合并滤液减压回收至无醇味，得浸膏。用0.5%硫酸溶解上述浸膏，过 滤，滤液再用氨水调pH值至12，然后用氯仿萃取，萃取液减压浓缩，干燥，得到玛咖生物 碱粗提物。
将正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水按体积比6:2:3:7比例混合，于分液漏斗中静置过夜后分 离出上下相，上相加入5mM的三乙胺，下相加入10mM的HCl，并超声脱气20min备用。 取300mg玛咖生物碱粗提物溶于15ml等体积的上下相中，振荡使之完全溶解，以备高速逆 流色谱分离。将配好的上相作为固定相，以15ml/min的流速泵入高速逆流色谱仪的螺旋管中， 开启循环水浴并设定恒温器温度为18℃，同时调整主机转速为750r/min，将配好的下相作为 流动相，以2ml/min的流速泵入柱内，待柱内溶剂体系建立动态平衡后，取样品溶液由进样 阀进样，根据检测器谱图，结合液相色谱和薄层色谱方法进行收集，待进样6h后，停止主 机转动，将固定相推出，固定相保留率为55%，得纯度为70%的玛咖生物碱。
将逆流纯化得到的玛咖生物碱浓缩后上硅胶柱层析，以苯-氯仿按照1:2进行洗脱，结合 液相色谱和薄层色谱方法收集含有生物碱的洗脱液，回收溶剂，浓缩，干燥，得到纯度为98.6% 的玛咖生物碱化合物。玛咖生物碱的液相色谱方法如下：色谱柱为Waters C18柱子（5μm， 4.6mm×250mm），柱温为30℃；流动相为乙腈：水=90:10，流速为0.8ml/min；检测时间为 30min，检测波长为280nm。
实施例5:玛咖生物碱片剂的制备
取实施例1中制备的玛咖生物碱120g，加入羟丙基甲基纤维素160g，聚维酮K3055g， 十八醇160g，硬脂酸镁5g，混合均匀，干法制粒，压片，制成相应片剂（1000片），每片含 玛咖生物碱100mg。
实施例6:玛咖生物碱胶囊的制备
取实施例2中制备的玛咖生物碱100g，50℃干燥，研磨粉碎，过80目筛，加过80目筛 的药用淀粉97g及硬脂酸镁3g，混匀，用80%乙醇适量制成软材，过30目筛制颗粒，烘干， 使水分小于5%，过40目筛整粒，分装，每粒胶囊中含有玛咖生物碱0.1g，用铝塑复合包装， 即得。
实施例7:玛咖生物碱的抗肿瘤作用
取实施例3制备的玛咖生物碱配成一定浓度的药物供测试用，试验用的癌细胞包括人宫 颈癌细胞株Hela、人肺腺癌上皮细胞株A549、人慢性髓原白血病细胞株K562、肝癌细胞株 HUH7、乳腺癌细胞株MCF-7。
取对数生长期细胞，胰酶消化，调整细胞数至1×105/ml；将细胞悬液加入到96孔板中， 各孔加入细胞100μl，5％CO2，37℃培养24h。加入不同浓度的玛咖生物碱溶液100μl，每个 浓度设5个平行，对照加全培养液100μl，继续培养48hr；每孔加入MTT溶液各20μl （5mg/ml），继续培养4h；弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150μl，轻轻振荡后，使用酶联免 疫仪测定492nm下每孔的OD值。
肿瘤细胞的抑制率％＝[(对照组测定的平均OD值-加药组测定的平均OD值)/对照 组测定的平均OD值]×100％
表1玛咖生物碱对不同肿瘤细胞增殖的半抑制率
肿瘤细胞株 IC50（ug/ml） 人宫颈癌细胞株Hela 3.5 人肺腺癌上皮细胞株A549 6.1 人慢性髓原白血病细胞株K562 4.2 肝癌细胞株HUH7 2.7 乳腺癌细胞株MCF-7 5.3
由表1可知，本发明制备的玛咖生物碱具有明显的肿瘤细胞增殖抑制作用，可作为细胞 增殖抑制剂或抗肿瘤剂用于抗肿瘤的研究。