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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610564377.9 (22)申请日 2016.07.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105969767 A (43)申请公布日 2016.09.28 (73)专利权人 黄冈师范学院 地址 438000 湖北省黄冈市开发区新港二 路146号 (72)发明人 王书珍方元平金卫斌向福 项俊程华 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569 代理人 李娜 (51)Int.Cl. C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/6895(201。
2、8.01) (56)对比文件 CN 105238781 A,2016.01.13, CN 105002569 A,2015.10.28, CN 103642912 A,2014.03.19, CN 105274198 A,2016.01.27, CN 104846093 A,2015.08.19, 李美芹等.杜鹃花EST-SSR标记的开发及遗 传多样性分析. 植物生理学报 .2016,第52卷 (第3期),第356-364页. Zhiliang Li等.EST-SSR Marker-based Genetic Diversity Analysis of Rhododendron simsii 。
3、Germplasm in Guifeng Mountain. Agricultural Science & Technology .2016,第17卷(第5期),第1073- 1076页. 审查员 程珂 (54)发明名称 一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记 引物及其筛选方法与应用 (57)摘要 本发明公开了基于转录组数据开发的杜鹃 花SSR分子标记引物及其具体应用， 属于生物技 术领域。 该引物是基于转录组序列开发得到， 在 转录组测序的基础上， 对大量测序数据进行批量 筛选， 获取SSR序列并进行SSR标记的引物设计， 克服了目前杜鹃花SSR分子标记数量少、 开发效 率低等障碍。 利用。
4、杜鹃花不同品种验证了SSR引 物的有效性， 为杜鹃花遗传多样性研究、 遗传连 锁图谱构、 分子标记辅助育种等奠定了基础。 权利要求书2页 说明书8页 序列表17页 附图1页 CN 105969767 B 2018.10.26 CN 105969767 B 1.一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物， 包括以下引物对： 2.根据权利要求1所述的SSR分子标记引物， 其特征在于： 所述引物对的退火温度54-65 之间， 所述引物长度18-25bp之间， 所述引物的CG含量40-60， PCR产物大小80-300bp。 3.根据权利要求1所述的SSR分子标记引物， 其特征在于： 所述引物对退火。
5、温度为： 权利要求书 1/2 页 2 CN 105969767 B 2 4.根据权利要求1-3任意一项所述的SSR分子标记引物在杜鹃花的品种鉴定中的应用。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105969767 B 3 一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物及其筛选方 法与应用 技术领域 0001 本发明涉及分子标记技术开发及应用领域。 更具体涉及基于杜鹃花转录组数据的 SSR分子标记引物开发和应用， 该引物适用于杜鹃花遗传多样性鉴定、 遗传连锁图谱构建、 QTL定位、 分子标记辅助育种等。 背景技术 0002 杜鹃花(Rhododendron simsii Planch)为杜鹃花科(Er。
6、icaceae)杜鹃花属 (Rhododendron)常绿或者落叶灌木， 重要的园林绿化和观赏植物。 杜鹃花一般春季开花， 每 簇花2-6朵， 花冠漏斗形， 有红、 淡红、 杏红、 雪青、 白色等， 花色繁茂艳丽， 为著名的花卉植 物， 具有较高的观赏价值。 该物种全株供药用有行气活血、 补虚， 治疗内伤咳嗽， 肾虚耳聋， 月经不调和风湿等。 长期以来， 众多育种学者对杜鹃花种质资源的收集、 分类和鉴定做了大 量工作， 为杜鹃花育种研究提供了大量优良性状材料， 选育出了多种符合生产需求的杜鹃 花品种。 分子标记作为材料品种鉴定、 遗传图谱构建和基因定位的基础， 已经成为花卉研究 和应用的重要技。
7、术手段， 但是目前对杜鹃花育种中应用的分子标记十分有限， 限制了其在 杜鹃花优质品种资源快速、 有效的选育和应用开发。 0003 简单重复序列(Simple sequence repeats,SSR)广泛分布在真核生物基因组上， 由于其序列重复类型和次数不同， 使其具有高度的多态性。 与其他分子标记相比， SSR标记 具有多态信息量高， 共显性遗传、 重复性好、 特异性强和技术简单等特点， 是较为可靠的分 子标记类型。 但是使用该技术必须要有相应的SSR序列做支撑， 目前SSR标记可分为基因组 SSR(gSSR)和转录组SSR(EST-SSR)， 由于杜鹃花的基因组尚未测序或者测序数据尚未公布。
8、， 而其同源物种基因组开发的SSR尚无确定是否能与其通用， 所以目前现有技术中尚未有利 用杜鹃花基因组SSR或转录组数据开发SSR标记的相关报道。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物筛选方法 和引物。 我们利用高通量测序技术对杜鹃花花蕾材料进行转录组测序， 转录组数据进行组 装拼接后挖掘带有SSR标记的序列， 将符合SSR引物设计要求的序列进行批量SSR引物开发， 并随机选取部分对SSR引物进行适用性验证。 该引物的开发为后续杜鹃花的品种鉴定、 分子 标记辅助育种、 重要性状基因定位和克隆等方面具有重要意义。 0005 为了实现上述目的， 本发。
9、明首先提供了一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标 记引物的筛选方法， 包括以下步骤： 0006 (1)提取总RNA； 0007 (2)构建杜鹃花转录组测序文库， 再对所述转录组测序文库进行高通量测序； 0008 (3)对所述转录组测序文库的数据进行过滤与组装， 得到Unigene数据库； 0009 (4)对所述Unigene数据库的序列进行SSR位点搜索， 筛选出符合SSR引物设计的序 说明书 1/8 页 4 CN 105969767 B 4 列； 0010 (5)对含有SSR位点的所述Unigene数据库的序列进行批量SSR引物设计， 获得SSR 分子标记引物。 0011 优选地， 本发明。
10、的基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(1)的RNA选自杜鹃花早期花蕾材料； 所述早期花蕾材料为获取后用锡箔纸包裹置于液 氮中速冻， 迅速转移至-70冰箱保存； 采用高盐Trizol试剂和RNA结合柱的方法提取总 RNA。 0012 优选地， 本发明的基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(2)中， 使用特异性转录组文库构建试剂盒构建了所述杜鹃花转录组测序文库， 所述特 异性转录组文库构建试剂盒的操作步骤为： 采用特异性试剂盒对总RNA先进行mRNA Oligo (dT)磁珠富集； 富集到的mRNA进行双链cDNA合成、 末端修复和接头。
11、连接； 再用USER酶对所述 双链cDNA第二链降解， 保留真实转录的mRNA第一链信息； 后续进行PCR扩增和2的琼脂糖 凝胶电泳， 回收300-500bp的片段， 即转录组测序文库； 所述转录组文库采用Illumina Hiseq2500PE125进行高通量测序。 0013 优选地， 本发明的基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(3)中， 所述数据的过滤采用FASTX和CUTADAPT软件， 所述数据的组装采用Trinity软 件。 0014 优选地， 本发明的基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(4)中， 使用MISA软件对Un。
12、igene数据库的序列进行SSR位点搜索， 所述搜索的标准为二 核苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸、 六核苷酸最少重复次数分别为10、 7、 5、 5和5次。 0015 优选地， 本发明的基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(5)中， 用primer 3.0软件批量设计所述含有SSR位点的Unigene数据库的序列设计引 物， 并且所述SSR位点离侧翼序列长度大于50bp， 所述引物退火温度54-65之间， PCR产物 大小80-300bp， 所述引物长度18-25bp之间， 所述引物的CG含量40-60。 0016 更优选地， 本发明杜鹃花SSR引物开发。
13、和应用的具体流程为： 选取杜鹃花材料提取 总RNA， 构建了杜鹃花转录组测序文库， 采用Illumina二代测序仪对转录组文库进行高通量 测序。 测序数据进过严格的数据过滤后， 对转录组数据进行组装， 得到Unigene基因库序列， 将其作为后续SSR引物开发的背景数据。 对Unigene基因库序列进行SSR位点搜索， 筛选出符 合SSR引物设计的序列。 利用相关软件对含有SSR位点的Unigene序列进行SSR引物设计， 并 将设计好的SSR引物对多个杜鹃花品种进行PCR扩增验证其有效性。 0017 本发明的另一目的在于， 本发明通过上述筛选方法获得了一种基于杜鹃花转录组 数据的SSR分子标。
14、记引物， 包括以下引物对： 说明书 2/8 页 5 CN 105969767 B 5 0018 0019 0020 优选地， 本发明所述的SSR分子标记引物中， 所述引物对的退火温度54-65之间， 所述引物长度18-25bp之间， 所述引物的CG含量40-60， PCR产物大小80-300bp。 0021 优选地， 本发明所述的SSR分子标记引物中， 所述引物对退火温度为： 说明书 3/8 页 6 CN 105969767 B 6 0022 0023 0024 本发明的一种基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物筛选方法， 是大规模SSR 引物开发中效率最高和最为切实可行的策略之一。 本发明。
15、中开发了40对杜鹃花SSR引物， 并 对7个不同杜鹃花品种进行PCR扩增效率和多态性检测。 本发明的特点在于： 0025 1、 本发明通过转录组数据获取杜鹃花的SSR引物开发的背景数据， 与基因组上的 gSSR相比具有更高的通用性； 0026 2、 本发明的筛选方法获得的SSR分子标记引物， 具有以下特点： 引物退火温度54- 65之间， PCR产物大小80-300bp， 引物长度18-25bp之间， CG含量40-60， 通过本发明的 后续实施例表明， 本发明设计的引物可以避免产生二聚体结构， 更有利于后续的操作； 0027 3、 本发明的40个EST-SSR分子标记引物在7个杜鹃花品种中有。
16、多态性， 可将本发明 提供的标记应用于更多的杜鹃花植物进行种质资源遗传多样性、 遗传图谱构建、 重要性状 定位和分子标记辅助育种等方面。 附图说明 0028 图1是本发明基于转录组SSR引物筛选方法的流程示意图； 0029 图2是实施例中40对引物在7个杜鹃花品种中6PAGE胶电泳检测。 具体实施方式 0030 本发明实施例中基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法， 包括以 说明书 4/8 页 7 CN 105969767 B 7 下步骤： 0031 (1)提取总RNA； 0032 (2)构建杜鹃花转录组测序文库， 再对所述转录组测序文库进行高通量测序； 0033 (3)对所述转录。
17、组测序文库的数据进行过滤与组装， 得到Unigene数据库； 0034 (4)对所述Unigene数据库的序列进行SSR位点搜索， 筛选出符合SSR引物设计的序 列； 0035 (5)对含有SSR位点的所述Unigene数据库的序列进行批量SSR引物设计， 获得SSR 分子标记引物。 0036 本发明实施例中基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(1)的RNA选自杜鹃花早期花蕾材料； 所述早期花蕾材料为获取后用锡箔纸包裹置于液 氮中速冻， 迅速转移至-70冰箱保存； 采用高盐Trizol试剂和RNA结合柱的方法提取总 RNA。 0037 本发明实施例中基于杜鹃花转录。
18、组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(2)中， 使用特异性转录组文库构建试剂盒NEB Next Poly(A)mRNAMagnetic Isolation Module构建了所述杜鹃花转录组测序文库， 其他可商购的转录组文库试剂盒也 可以用于本发明， 所述特异性转录组文库构建试剂盒的操作步骤为： 采用特异性试剂盒对 总RNA先进行mRNA Oligo(dT)磁珠富集； 富集到的mRNA进行双链cDNA合成、 末端修复和接头 连接； 再用USER酶对所述双链cDNA第二链降解， 保留真实转录的mRNA第一链信息； 后续进行 PCR扩增和2的琼脂糖凝胶电泳， 回收300-500bp。
19、的片段， 即转录组测序文库； 所述转录组 文库采用Illumina Hiseq2500PE125进行高通量测序。 0038 本发明实施例中基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(3)中， 所述数据的过滤采用FASTX和CUTADAPT软件， 所述数据的组装采用Trinity软 件。 0039 本发明实施例中基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(4)中， 使用MISA软件对Unigene数据库的序列进行SSR位点搜索， 所述搜索的标准为二 核苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸、 六核苷酸最少重复次数分别为10、 7、 5、 5和5次。
20、。 0040 本发明实施例中基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选方法中， 所述 步骤(5)中， 用primer 3.0软件批量设计所述含有SSR位点的Unigene数据库的序列设计引 物， 并且所述SSR位点离侧翼序列长度大于50bp， 所述引物退火温度54-65之间， PCR产物 大小80-300bp， 所述引物长度18-25bp之间， 所述引物的CG含量40-60。 0041 本发明实施例中杜鹃花SSR引物开发和应用的具体流程为： 选取杜鹃花材料提取 总RNA， 构建了杜鹃花转录组测序文库， 采用Illumina二代测序仪对转录组文库进行高通量 测序。 测序数据进过严格的数据过滤。
21、后， 对转录组数据进行组装， 得到Unigene基因库序列， 将其作为后续SSR引物开发的背景数据。 对Unigene基因库序列进行SSR位点搜索， 筛选出符 合SSR引物设计的序列。 利用相关软件对含有SSR位点的Unigene序列进行SSR引物设计， 并 将设计好的SSR引物对多个杜鹃花品种进行PCR扩增验证其有效性。 0042 实施例基于杜鹃花转录组数据的SSR分子标记引物的筛选和在检测杜鹃花品种多 态性的应用 0043 本实施例中提供了40对SSR引物是从杜鹃花转录组数据中挖掘得到， 使用MISA软 说明书 5/8 页 8 CN 105969767 B 8 件对Unigene进行SSR。
22、位点搜索， 搜索标准为： 二、 三、 四、 五、 六核苷酸最少重复次数分别为 10、 7、 5、 5和5次。 用primer 3.0软件设计含有SSR位点的Unigene序列设计引物， 并且SSR位 点离侧翼序列长度大于50bp， 引物退火温度54-65之间， PCR产物大小80-300bp， 引物长度 18-25bp之间， CG含量40-60， 引物避免产生二聚体结构。 0044 具体包括以下步骤： 0045 (1)DNA提取。 利用2CTAB法提取7种杜鹃花叶片组织的基因组DNA。 叶片经液氮研 磨、 酚/氯仿(体积比1:1)抽提、 异丙醇沉淀、 75乙醇洗涤和RNA酶处理等步骤后， 将D。
23、NA溶 于50 L TE溶液中。 本发明实验方案中所用到的不同杜鹃花品种信息见表1。 0046 表1本发明所采用的7个杜鹃花品种信息 0047 0048 0049 (2)转录组SSR序列筛选。 选取杜鹃花材料提取总RNA， 构建杜鹃花转录组测序文 库， 采用Illumina二代测序仪对转录组文库进行高通量测序。 测序数据进过严格的数据过 滤后， 对转录组数据进行组装， 得到Unigene基因库， 将其作为后续SSR引物开发的背景数 据。 对Unigene序列进行SSR位点搜索， 筛选出符合SSR引物设计的序列。 其中， 拼接得到的 Unigene基因库的59620个序列， 含SSR序列的Uni。
24、gene序列有9930个， 从中统计出SSR信息， 见表2。 0050 表2 Unigene基因库中SSR重复序列和重新次数统计 0051 0052 使用MISA软件对获得的Unigene基因库基因进行SSR位点搜索， 搜索标准为： 二核 苷酸、 三核苷酸、 四核苷酸、 五核苷酸、 六核苷酸最少重复次数分别为10、 7、 5、 5和5次。 用 primer 3.0软件批量设计含有SSR位点的Unigene序列引物， 并且SSR位点离侧翼序列长度 说明书 6/8 页 9 CN 105969767 B 9 大于50bp， 引物退火温度54-65之间， PCR产物大小80-300bp， 引物长度18。
25、-25bp之间， CG含 量40-60， 引物避免产生二聚体结构。 SSR引物序列见表3。 引物合成由南京金斯瑞合成， 采用RPC的方式进行纯化。 0053 表3 SSR引物序列 0054 0055 0056 (3)PCR扩增。 15 l反应体系包含： ddH2O 11.9 l， 10Buffer(含Mg2+)1.5 l， dNTPs 说明书 7/8 页 10 CN 105969767 B 10 (10mM),0.2 l， 10 M正反引物各0.2 l， Taq聚合酶0.2 l， DNA模板(50ng/ l)1 l。 反应程序 为： 94 5min； 94 30sec， 退火温度(见表3)30。
26、sec， 72 30sec， 30cycles； 72 5min； 4 hold。 所选引物序列见表3。 0057 (4)6PAGE胶检测。 将上述扩增产物取3 l， 加2 l 6DNA loading buffer， 进行 6PAGE胶电泳， PAGE胶分别用硝酸银溶液和氢氧化钠溶液进行染色和显色。 结果见图2： 6 个随机挑选的EST-SSR引物(SSR1-6:RhE-1、 RhE-12、 RhE-14、 RhE-15、 RhE-19、 RhE-22)在7个 杜鹃花品种中DNA的扩增结果： 六个标记在不同杜鹃品种内的扩增条带存在明显的多态性； 其中SSR1、 SSR2、 SSR4、 SSR。
27、5、 SSR6五个标记还能区分出纯合子和杂合子。 0058 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应 视为本发明的保护范围。 说明书 8/8 页 11 CN 105969767 B 11 0001 序列表 1/17 页 12 CN 105969767 B 12 0002 序列表 2/17 页 13 CN 105969767 B 13 0003 序列表 3/17 页 14 CN 105969767 B 14 0004 序列表 4/17 页 15 CN 105969767 B 。
28、15 0005 序列表 5/17 页 16 CN 105969767 B 16 0006 序列表 6/17 页 17 CN 105969767 B 17 0007 序列表 7/17 页 18 CN 105969767 B 18 0008 序列表 8/17 页 19 CN 105969767 B 19 0009 序列表 9/17 页 20 CN 105969767 B 20 0010 序列表 10/17 页 21 CN 105969767 B 21 0011 序列表 11/17 页 22 CN 105969767 B 22 0012 序列表 12/17 页 23 CN 105969767 B 23 0013 序列表 13/17 页 24 CN 105969767 B 24 0014 序列表 14/17 页 25 CN 105969767 B 25 0015 序列表 15/17 页 26 CN 105969767 B 26 0016 序列表 16/17 页 27 CN 105969767 B 27 0017 序列表 17/17 页 28 CN 105969767 B 28 图1 图2 说明书附图 1/1 页 29 CN 105969767 B 29 。