技术领域
本发明涉及遗传和基因工程领域，尤其是利用gma-miR172c培育转基因固氮植物的方法。
背景技术
大豆是豆科大豆属一年生草本植物，是世界上广泛栽培的重要的粮食和油料作物；不仅如此，大豆根部生长着许多根瘤，能把空气中的游离氮素固定成为氨态氮，为大豆生长发育提供养料。由根瘤菌生产出来的氮素，在大豆的一生中只能吸收一半，剩下的一半留在土壤里，留给下茬作物使用，除此以外还可给与之间、套、轮作的禾本科作物及其他经济作物提供氮素营养，活化矿质元素，并能减少病、虫危害。因而由根瘤介导的共生固氮不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。
miRNA是近年来研究发现的一种长20～24nt的内源性非蛋白编码RNA。miRNA基因最初转录产生具有颈环结构的pre-miRNAs。随后pre-miRNA被转运出核，在细胞质中被Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通过序列互补与特定靶基因的mRNA结合，引起mRNA降解或抑制mRNA翻译从而对基因的表达起到负调节作用。已有研究表明miR169-a及其靶基因MtHAP2-1对根瘤的发育起重要调节作用；miR166在Medicago truncatula对侧根及根瘤的发育具有调控作用，从而可以看出miRNA在侧根及根瘤发育过程中起到了很重要的调控作用，豆科植物miRNA的研究将为阐明大豆根及根瘤发育的分子机制提供重要的参考。
miR172作为比较保守的一类miRNA，负调控其靶基因AP2/ERF家族基因，从而在花器官的发育，开花时间的调控，植物体的时态转换，育性和种子的重量(Chen，2004；Jung et al.，2007；Zhao et al.，2007，Chuck et al.，2007b，Wu et al.，2009；，Zhu et al.，2009，Nair et al.，2010)等等方面起重要的调控作用。虽然目前miR172的研究相对较多，但是主要集中地上部分的研究方面，而针对地下的功能尤其是miR172c在大豆中的功能尚未见详细报道，亦不清楚miR172c在根瘤发育和固氮中的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种培育转基因固氮植物的方法，基于申请人发现的gma-miR172c的新功能，通过基因工程方法使gma-miR172c在目的植物中过表达，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
一种培育转基因固氮植物的方法，使序列表中SEQ ID NO：1所示的miRNA，即gma-miR172c，在目的植物中过表达，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物。
作为本发明的一种优选技术方案，利用SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列和带有烟草花椰菜花叶病毒35S启动子的载体构建重组表达载体，并将此重组表达载体导入到目的植物中，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物；其中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列为gma-miR172c前体的序列，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列为gma-miR172c前体的编码序列，其可在植物体内转录为gma-miR172c的前体。
作为本发明的一种优选技术方案，构建所述重组表达载体所用的空载体为pEGAD载体。
作为本发明的一种优选技术方案，通过发根农杆菌K599介导的毛状根转化系统将所述重组表达载体导入到目的植物中。
作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：申请人通过大量的科学研究揭示了gma-miR172c在根瘤发育和固氮中的新功能，为培育高固氮能力大豆新品种提供了新的高效基因资源；本发明以这些新发现为基础，开发了利用gma-miR172c培育转基因高固氮大豆的方法，通过基因工程方法使gma-miR172c在目的植物中过表达，得到与正常目的植物相比固氮能力增强的转基因植物。
附图说明
图1为gma-miR172c前体的茎环结构，其中，横线指示成熟gma-miR172c的序列。
图2为gma-miR172c的实时荧光定量PCR结果。
图3为gma-miR172c的Promoter-GUS分析结果，其中，abc为gma-miR172c的GUS染色结果，def为对照，对照为转入空载体的毛状根。
图4为过表达gma-miR172c后对大豆结瘤的表型分析结果，其中，A：每个转化的毛状根的结瘤数；B.：过表达35S::miR172c的复合苗结瘤数量显著比CK多，CK为转空载体的复合苗。
图5为pCAMBIA3301载体图谱。
图6为pEGAD载体图谱。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。以下实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。另外，实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：大豆植株中gma-miR172c的组织表达特性分析
1、gma-miR172c的实时荧光定量PCR：通过实时荧光定量PCR技术分析gma-miR172c在大豆不同组织中的表达特性
(1)材料获取，实验所用材料为Wilimas82(威廉姆斯82，下文简称W82)，材料按照以下流程进行处理：
大豆种子用70％的洒精灭菌30秒，ddH2O冲洗6遍后播种于铺有无菌滤纸的培养皿中，ddH2O浸湿，28℃暗萌发3天；
待芽长至2cm时，移至放有湿润滤纸的试管中催芽，以使豆苗生长较直，待芽长至4～5cm，移至活化的根瘤菌USDA110的菌液(OD：0.08)中，侵染30min，低N水培，10,000lx，温度为26℃，相对湿度为70％，培养28天，取材；
取材组织：叶、茎、根、根瘤；
(2)大豆叶、茎、根、根瘤组织中miRNA的分离：取上步所得大豆的叶、茎、根、根瘤组织，分别使用百泰克公司出品的microRNA提取试剂盒(Cat # RP5301)提取小片段RNA，具体提取方法如下：
匀浆处理：取大豆的叶、茎、根、根瘤组织，依次分别用液氮在研钵中快速磨碎，每50～100mg植物组织中加1ml裂解液；
将匀浆样品剧烈震荡混匀，在15～30℃条件下孵育5min以使核蛋白体完全分解；
4℃条件下12,000rpm离心10min，小心取上清转入一个新RNase free离心管中；
每1ml裂解液加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈振荡15s并将其在室温下孵育3min；
样品于4℃条件下12,000rpm离心10min；会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色水相，RNA存在于水相中；水相层的容量大约为所加裂解液体积的60％，把水相转移到新管中，进行下一步操作；
加入0.6倍体积70％乙醇，颠倒混匀，此时会出现沉淀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱RA中；
10,000rpm离心45s，收集下滤液，下滤液中含有miRNA，准确估计下滤液的体积，加入2/3倍体积的无水乙醇，颠倒几次混匀，将混合液倒入到吸附柱II中，吸附柱RB容量约为700μl，所以要分几次离心加入同一吸附柱，10,000rpm离心30s弃掉废液；
加入700μl漂洗液RW，12,000rpm离心60s，弃掉废液；
加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60s，弃掉废液；
将吸附柱RB放回空收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
取出吸附柱RB，放入一个RNase free离心管中，在吸附膜中间部位加60-80μl RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热)，室温放置2min，然后12,000rpm离心1min，依次分别收集得到大豆叶、茎、根、根瘤组织的纯净miRNA，保存于-80℃冰箱中；
(3)反转录PCR：使用TIANGEN公司出品的miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂盒(目录号：KR201)对上步所得大豆四组织的miRNA进行反转录克隆：
首先将miRNA末端进行加poly(A)处理，在20μl体系中加入miRNA 6μl，E-PAP 0.4μl，10×PAP Buffer 2μl，5×rATP solution 4μl，Nuclease-free Water 7.6μl，轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后，37℃反应60min；所得反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存，如需长期保存建议存放于-80℃；然后将poly(A)修饰后的miRNA进行逆转录反应，获取miRNA的cDNA，在20μl体系中加入Poly(A)反应液2μl，10×RT primer2μl，10×RT Buffer 2μl，超纯dNTP Mixture(2.5Mm)1μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，Quant Rtase 0.5μl，RNase-free ddH2O 12μl，轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后，37℃反应60min；合成的cDNA反应液放置-20℃保存，也可以直接进行下游荧光定量检测；
(4)实时荧光定量PCR分析，使用TaKaRa公司出品的SYBR PremixEx TagTM进行定量PCR分析：
在20μl体系中加入上步所得cDNA模板2μl、正反向引物各0.4μl、SYBR Primix Ex taqTM(2×)10μl、ROX Reference Dye II(50×)0.4μl、ddH2O 6.8μl；扩增程序为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，45 cycles；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s；其中，正向引物为：GGAATCTTGATGATGCTGCAGA(SEQ ID NO：4)；反向引物为：GCGAGCACAGAATTAATACGACT(SEQ ID NO：5)；
(5)结果：
gma-miR172c在大豆根，茎，叶，根瘤中的表达模式如图2所示，结果显示其在大豆根瘤组织中高表达。
2、gma-miR172c的组织化学分析：将gma-miR172c的启动子连接到带有GUS基因的载体pCAMBIA3301上，通过检测GUS的表达情况定位gma-miR172c在大豆根及根瘤中的表达模式
(1)gma-miR172c的启动子序列的克隆
根据http://www.phytozome.net/上提供的gma-miR172c的启动子序列设计引物对，根据载体pCAMBIA3301多克隆位点，引物末端分别引入EcoRI I和BglII酶切识别位点，以CTAB法提取的大豆测序品种W82的DNA为模板，PCR扩增gma-miR172c的启动子；
扩增程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃2分钟，26个循环；72℃ 7分钟；
引物序列为：
Pro-gma-miR172c-F：5’-CGGAATTCAACATGGTCGGTGATGAC-3’(SEQID NO：6)
Pro-gma-miR172c-R：5’-GAAGATCTCTTTAGTTTATTTAGGACTTC-3’(SEQ ID NO：7)
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化2Kb左右的条带；
回收的DNA片段与pMD19-T载体(Takara公司)连接，10μl体系中加入T vector 1μl，solution I 5μl，回收片段4μl，混匀混合液，16℃连接过夜，42℃热击法转入E.coli感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交invitrogen公司测序；
(2)重组表达载体的构建
1)、提取含有正确测序的gma-miR172c启动子序列的T载体质粒，用限制性内切酶EcoRI I和BglII酶切，回收酶切产物；
2)、用限制性内切酶EcoRI I和BglII酶切空载体pCAMBIA3301，回收载体骨架；
3)、用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
4)、将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pCAMBIA3301-PmiR172c::GUS；
(3)农杆菌K599介导的毛状根转化：
1)、农杆菌K599感受态的制备
a.生长良好的单菌落接种于小管5ml LB液体培养基28℃振荡培养过夜活化；
b.过夜活化的菌液按1∶100接种于100ml LB液体培养基，28℃振荡培养1.5-3h至OD600为0.6左右(大于0.5即可)；
c.冰上冷却后，将菌液转至50ml离心管，离心收集菌体(4000rpm，8min，4℃)；
d.弃去上清，加入1ml冰冷的氯化钠溶液(0.15M NaCl)轻轻悬浮菌体，再加入约10ml上述溶液使菌体分散均匀，离心收集菌体(4000rpm，8min，4℃)；
e.弃去上清，加入2ml预冷的氯化钙溶液(20mM CaCl2，含有15％甘油)悬浮菌体；
f.将制好的感受态细胞分装到灭菌的Eppendorf管中，200μl每管经液氮速冻后直接保存于-80℃备用；
2)、将构建好的重组质粒转化农杆菌K599
采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：
a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放30min；
b.液氮中速冻5min取出，迅速转入37℃(5min)后，加入800μl LB(无抗性)液体培养基中，28℃低速振荡(150rpm)4-5h；
c.10000rpm，30sec，去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素)；
d.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
3)农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398)，pH调至5.7左右；)上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min(OD：0.6左右)后，将外植体转至1/2MS培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：G519)，pH调至5.7左右；)上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7，8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入无土基质(蛭石∶珍珠岩＝3∶1)中，培养1周后接种根瘤菌USDA110(OD：0.08)20ml/株，培养28天后收取根及根瘤进行GUS染色分析；
(4)GUS染色
GUS染液的配制：首先配制GUS反应缓冲液Tris Buffer I，其中包括100mM Tris和50mM NaCl，以浓盐酸调pH至7.4；然后在Tris buffer I中加入0.5mM K3[Fe(CN)6]，配制成Tris buffer II；按1mg/ml的浓度称取x-glu(5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖醛酸苷)，按照每mg加入10μl DMSO(二甲基亚砜)的比例完全溶解x-glu后，加入Tris buffer II溶液定容，迅速分装后于-20℃避光保存；
GUS染色：取待检测毛状根植物样品放入GUS反应缓冲液中，浸没，37℃暗中保温；每隔半小时在解剖镜下观察显色效果；当显色强度足够后，吸出GUS反应缓冲液，加入70％乙醇终止反应并在37℃脱色，每隔数小时更换一次；
(5)结果：
GUS染色结果如图3所示，表明gma-miR172c在大豆根中表达量较低，在根瘤中表达量高。
上述实施例分别从实时荧光定量PCR角度和组织化学分析角度分析了gma-miR172c的表达模式，表明其在根瘤中表达量最高。
实施例2：基于gma-miR172c的功能培育高固氮能力大豆的方法
1、Wilimas82大豆功能根瘤组织中总RNA的提取
研钵经180℃高温处理8小时或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1‰ DEPC水处理过夜后121°高温湿热灭菌30分钟，枪头，离心管65°烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：
(1)取50mg材料(叶片)用液氮研磨材料，加入1ml redzol试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5ml离心管，室温放置5min；
(2)加200μl氯仿，震荡混匀，静置2-3min，12000g 4℃离心10min；
(3)取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，-20°放置30min，12000g 4℃离心10min；
(4)1ml 75％乙醇洗沉淀，7500g离心5min，两次重复；室温风干10min左右，加20μl左右DEPC处理过的无菌水溶解沉淀。
2、反转录PCR
(1)在用DEPC处理过的的200μl PCR管中顺序加入5μL RNA和3μL oligo(dt)18；4μLdNTPs，65℃温育5min后迅速置于冰上冷却；
(3)按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer(invitrgen公司出品)4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；
(4)将上述反应液混匀，37℃反应1.5小时；
(5)反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链可用作PCR反应模板。
3、构建重组表达载体
(1)gma-miR172c基因的克隆
根据gma-miR172c的前体序列(SEQ ID NO：2)在http://www.phytozome.net/上比对得到gma-miR172c前体的编码序列，再加上上游23bp下游27bp，总共203bp的序列(SEQ ID NO：3)，根据该序列设计引物对，根据载体pEGAD多克隆位点，引物末端分别引入Age I和Spe I酶切识别位点，以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增gma-miR172c前体的编码基因；引物序列为：
gma-miR172c-F：5’-TGC ACCGGT ATGAAGTCCTAAATAAAC-3’(SEQ ID NO：8)
gma-miR172c-R：5’-GGACTAGT TCCTCCTCAAGCAATATCTG-3’(SEQ ID NO：9)
扩增程序为：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃40秒，26个循环；72℃ 7分钟；
PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化203bp左右的条带；
回收的DNA片段与pMD19-T载体(Takara公司)连接，10μl体系中加入T vector 1μl，solution I 5μl，回收片段4μl，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入E.coli感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交invitrogen公司测序，测序结果如SEQ ID NO：3所示；
(2)重组表达载体的构建
1)、提取含有正确测序的gma-miR172c前体基因序列的T载体质粒，用限制性内切酶Age I和Spe I酶切，回收酶切产物；
2)、用限制性内切酶Age I和Spe I酶切空载体pEGAD，回收载体骨架；
3)、用T4连接酶将步骤1的酶切产物和步骤2的载体骨架连接；
4)、将步骤3的连接产物热激转化感受态DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒pEGAD-355::gma-miR172c。
4.农杆菌K599介导的毛状根转化：
(1)农杆菌的转化
采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下：
a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；
b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃(5min)融化后，加入800μl LB(无抗性)液体培养基，28℃低速振荡(150rpm)4-5h；
d.10000rpm，30sec，去上清，加100μl LB液体培养基，悬浮菌体后涂板(含50mg/ml卡那霉素)；
e.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化；
(2)农杆菌K599介导的毛状根转化
以大豆品种吉林小粒1号为材料，取种子材料用氯气消毒10小时后，在B5培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，1×GAMBORG B-5BASAL(Phyto Technology Laboratories，货号：G398)，pH调至5.7左右；)上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30min(OD：0.6左右)后，将外植体转至1/2MS培养基(培养基配方：2％蔗糖，0.8琼脂粉(sigma)，0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS(Phyto Technology Laboratories，货号：G519)，pH调至5.7左右；)上共培生长3天后，再转至1/2MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7，8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入无土基质(蛭石∶珍珠岩＝3∶1)中，培养1周后接种根瘤菌USDA110(OD：0.08)20ml/株，培养28天后收取根瘤，统计根瘤数量。
5.结果观察
结果如图4所示，表明在完全相同的实验环境下，过表达gma-miR172c的转基因根同对照相比，根瘤数量显著增多。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。