制取水痘病毒原液的方法及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810420935.3 (22)申请日 2018.05.04 (71)申请人 上海荣盛生物药业有限公司 地址 201108 上海市闵行区向阳路888号 (72)发明人 朱绍荣 (51)Int.Cl. C12N 7/00(2006.01) A61K 39/25(2006.01) A61P 31/22(2006.01) (54)发明名称 制取水痘病毒原液的方法及其应用 (57)摘要 一种制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于 先在MRC-5细胞的细胞培养阶段于无血清培养基 加入5。

2、v/v牛血清， 然后接种VZV-OKa毒株， 改用 无血清培养基作为维持液培养病毒获得水痘病 毒原液。 本发明的制取水痘病毒原液的方法， 采 用合适的减血清培养基培养细胞， 无血清条件培 养VZV病毒， 将其应用于水痘减毒活疫苗的制取， 可以大幅降低疫苗中的牛血清白蛋白残留量 60以上。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 108753736 A 2018.11.06 CN 108753736 A 1.一种制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于先在MRC-5细胞的细胞培养阶段于无血 清培养基加入5v/v牛血清， 然后接种VZV-OKa毒株， 改用无血清培养基作为维持液培养病 毒获得水痘病。

3、毒原液。 2.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于先在27代所述的MRC-5 细胞的细胞培养阶段于无血清培养基加入5v/v牛血清， 按1:2或1:4的分种率连续传代扩 增至第34代和第35代， 然后接种所述的VZV-OKa毒株。 3.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于接种所述的VZV-OKa毒 株， 培养至病变率达到3050， 胰酶消化， 重悬后制备病变细胞悬液， 34代病变细胞与 35代细胞按照1:20比例， 将34代病变细胞悬液接种至第35代细胞， 细胞维持液置换为无血 清培养基后， 培养2天至病变率达到6580后， 使用EDTA消化， 离心处理，。

4、 加入疫苗保护 液重悬， 反复冻融后获得所述的水痘病毒原液。 4.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于所述的无血清细胞培 养液采用MCDB201无血清培养基。 5.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法， 其特征在于将27代MRC-5细胞于添 加5v/v牛血清的无血清细胞培养液中， 37静置培养35天至细胞单层成片， 按1:2或1: 4的分种率连续传代扩增至第34代和第35代； 待34代细胞生长成片后， 按照MOI 0.0010.01比例接种VZV-OKa毒株， 细胞维持液置 换为无血清培养基， 置36静止培养， 待病变率达到3050， 胰酶消化， 重悬后制备病 变细胞。

5、悬液， 34代病变细胞与35代细胞按照1:20比例， 将34代病变细胞悬液接种至第35代 细胞， 细胞维持液置换为无血清培养基后， 置36静止培养2天， 待病变率达到6580 后， 使用EDTA消化， 离心处理， 加入疫苗保护液重悬， 反复冻融后即得。 6.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法大幅降低疫苗中的牛血清白蛋白残 留量60以上。 7.根据权利要求1所述的制取水痘病毒原液的方法制得的水痘病毒原液所含的牛血清 白蛋白5ng/ml15ng/ml。 8.根据权利要求17之一所述的制取水痘病毒原液的方法在制取水痘减毒活疫苗中 的应用。 9.一种制取水痘疫苗的方法， 其以权利要求17之一所。

6、述的制取水痘病毒原液的方法 而制取水痘减毒活疫苗。 10.根据权利要求9所述的制取水痘疫苗的方法， 其特征在于以所述的制取水痘病毒原 液的方法而制取水痘减毒活疫苗的牛血清白蛋白含量为2ng/剂8ng/剂。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108753736 A 2 制取水痘病毒原液的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种制取生物制品的方法， 尤其涉及一种水痘疫苗的制取方法， 降低 牛血清白蛋白的残留量。 背景技术 0002 牛血清(FBS)是一种成分复杂的混合物， 其中主要成分有蛋白质类、 多肽类、 激素 类、 以及氨基酸、 葡萄糖、 微量元素等其他成分。 血清在细胞培养中具有极为。

7、重要的功能， 如： 可提供能促使细胞指数生长的激素、 基础培养基中没有或含量微小的营养物， 以及某些 低分子营养物质； 提供结合蛋白， 识别维生素、 脂类、 金属离子， 并与有毒金属和热源物质结 合， 起解毒作用； 是细胞贴壁、 铺展生长所需因子的来源； 起酸碱度缓冲液作用； 以及提供蛋 白酶抑制剂， 细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活， 保护细胞不受损伤。 0003 水痘减毒活疫苗是将水痘病毒OKA株接种至MRC-5细胞， 病毒经过扩增复制后收 获、 提取、 纯化和分装冻干制成。 MRC-5细胞为人胚肺成纤维细胞， 是一种贴壁细胞， 其贴壁 和生长过程对牛血清具有高度依赖性， 因此必须在细胞培养阶。

8、段添加牛血清。 目前水痘疫 苗的生产均采用MEM培养基， 在细胞培养阶段添加10FBS， 在病毒培养阶段降低牛血清浓 度为23。 0004 牛血清对细胞培养起到促进作用的同时， 其使用也给生物制品的生产带来很多问 题。 虽血清大部分成分已为人所知， 但还有一部分仍不清楚， 作为动物来源成分， 有携带外 源因子的风险； 血清蛋白增加了后续疫苗纯化工作的困难； 血清的组成及含量通常随供血 动物的性别、 年龄、 生理条件和营养条件不同而存在差异， 这种血清自身的批间差异必然导 致不同批次细胞生长效果的差别； 另外血清使用成本高， 每升培养液的成本中血清约占 80。 为了使与传染源相关的风险降到最低，。

9、 国际上存在多个国家之间限制进出口生物材 料的国际法规。 FDA目前已不受理利用血清进行细胞培养的新药申报， 并与美国农业部严密 控制胎牛血清在细胞培养中的使用； 一些会议在全球范围内号召减少FBS的使用。 我国药品 管理法对生物制品的质量和安全性也提出严格要求， 鼓励生产过程尽量降低血清的使用量 或寻找替代血清及动物组分的原材料。 0005 水痘疫苗是一种减毒活疫苗， 无法像灭活疫苗或亚单位疫苗一样进行精制纯化， 只能通过洗涤和离心尽可能去除杂质成分。 在细胞和病毒培养阶段所添加的牛血清成分一 般通过多次洗涤降低残留量。 但洗涤作为一个关键工序， 若洗涤不充分， 将直接导致该批次 牛血清残留。

10、超标而直接废弃。 若洗涤过度， 又使得病变细胞被冲掉， 导致某批次原液回收率 低， 滴度下降， 进而影响产量。 0006 无血清培养基(Serum Free Medium， SFM)是继天然培养基、 有血清合成培养基之 后研制的一类限定成分培养基， 一般无需添加血清既可满足细胞生长繁殖， 除特殊情况或 某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子， 如粘附因子、 生长因子、 必需的营养物质和激 素等。 无血清培养或减血清培养可以减少上述血清带来的不利因素， 降低外源物质污染风 险， 减少细胞培养批间差， 使细胞培养条件更为稳定。 说明书 1/5 页 3 CN 108753736 A 3 发明内容 0。

11、007 本发明的一个目的在于提供一种制取水痘病毒原液的方法， 以实现降低水痘减毒 活疫苗中牛血清白蛋白残留量。 0008 本发明的另一个目的在于提供一种制取水痘疫苗的方法， 采用减血清培养基和无 血清培养基制取水痘病毒原液。 0009 本发明提供的一种制取水痘病毒原液的方法， 先在MRC-5细胞的细胞培养阶段于 无血清培养基加入5v/v牛血清， 然后接种VZV-OKa毒株， 改用无血清培养基作为维持液培 养病毒获得水痘病毒原液。 0010 本发明提供的另一种制取水痘病毒原液的方法， 先在27代MRC-5细胞的细胞培养 阶段于无血清培养基加入5v/v牛血清， 按1:2或1:4的分种率连续传代扩增。

12、至第34代和第 35代， 然后接种VZV-OKa毒株， 改用无血清培养基作为维持液培养病毒， 获得水痘病毒原液。 0011 本发明提供的另一种制取水痘病毒原液的方法， 包括： 0012 将27代MRC-5细胞于添加5v/v牛血清的无血清细胞培养液中， 37静置培养3 5天至细胞单层成片， 按1:2或1:4的分种率连续传代扩增至第34代和第35代； 0013 待34代细胞生长成片后， 按照MOI 0.0010.01比例接种VZV-OKa毒株， 细胞维持 液置换为无血清培养基。 置36静止培养， 待病变率达到3050， 胰酶消化， 重悬后制 备病变细胞悬液， 34代病变细胞与35代细胞按照1:20。

13、比例， 将34代病变细胞悬液接种至第 35代细胞， 细胞维持液置换为无血清培养基后， 置36静止培养2天。 待病变率达到65 80后， 使用EDTA消化， 离心处理， 加入疫苗保护液重悬， 反复冻融后即得。 0014 无血清细胞培养液采用MCDB201无血清培养基， 购自甘肃健顺生物科技有限公司。 0015 无血清培养基是继天然培养基、 有血清合成培养基之后研制的一类既能满足细胞 在体外较长时间生长繁殖又无需添加血清避免外源物质污染的合成培养基。 无血清培养基 的成分虽然明确， 但比较复杂， 一般认为其由两部分组成， 即基础培养基和补充因子。 补充 因子即无血清培养基中用于代替血清的各种因子的。

14、总称， 如： 粘附因子、 生长因子、 必需的 营养物质和激素等， 可根据细胞种类及培养目的进行调整以达到更好培养效果。 无血清培 养或减血清培养可以减少细胞培养批间差， 使细胞培养条件更为稳定； 更为重要的是可以 降低外源因子污染风险， 降低或去除产品中外源蛋白的残留， 提高产品质量。 0016 但无血清培养基并非完美。 首先无血清培养基的开发设计需要根据不同种属细胞 单独制定， 甚至同一种细胞但处于不同的发育分化阶段也需要不同的配方， 对添加因子的 选择尤为重要。 同时引入第二个问题： 无血清培养基成分限定， 对新成分的引入、 去除和残 留需要进行分析定量。 中国药典2015版规定， 若无血。

15、清培养基中添加了转铁蛋白、 胰岛素、 生长因子等生物材料时， 应对其可能引入的潜在外源因子进行评估， 包括采用适宜的方法 进行检测等， 并应详细记录其材料来源。 第三， 无血清培养基虽然在悬浮细胞应用领域较为 广泛成熟， 但对贴壁细胞有其特殊性。 贴壁细胞的贴壁过程、 消化后终止胰酶活性、 生长过 程中解毒保护等都需要血清蛋白因子的作用。 去除血清后将增加对试剂、 水的纯度和仪器 清洁度的要求。 第四， 也是较为重要的一点， 无血清培养基的使用需要对细胞进行适应驯 化。 虽然在培养基的开发设计初首先要考虑细胞特性， 但在某种培养(基)条件下的连续传 代也是一种细胞适应培养(基)的过程。 在规模。

16、化生产中， 首先采用无血清培养(基)驯化、 筛 说明书 2/5 页 4 CN 108753736 A 4 选细胞适应株并建库， 才可能为长期生产提供保障。 0017 虽然无血清培养(基)已有大量应用， 如抗体工程、 狂犬疫苗、 风疹疫苗等， 但它们 大多为分泌性表达。 水痘疫苗具有其特殊性。 水痘病毒是一种胞内病毒， 在生产细胞基质的 感染增殖后， 细胞大部分仍聚集在细胞内部。 因此需要将病变细胞尽可能多的收获处理， 以 提高原液产量。 MRC-5细胞作为贴壁细胞， 贴壁过程对牛血清或粘附因子具有高度依赖性。 同时MRC-5细胞是一种二倍体细胞， 具有一定的生命代次， 在已有血清建库的基础上无。

17、法再 进行有效的适应性驯化。 因此该细胞暂无法做到牛血清的零使用。 0018 本发明结合水痘疫苗生产的特殊性， 探索无血清培养(基)条件的应用可行性。 通 过各项验证发现， 并非所有无血清培养基都能应用于MRC-5细胞培养水痘病毒。 0019 经验证， 本发明提供的各种方法制得水痘病毒原液中牛血清白蛋白残留量大幅降 低60以上， 所含的牛血清白蛋白5ng/ml15ng/ml， 并能适用于水痘减毒活疫苗的制取。 0020 一种制取水痘疫苗的方法， 其以本发明提供的方法制取的水痘病毒原液而制取水 痘减毒活疫苗， 其牛血清白蛋白含量显著降低， 为2ng/剂8ng/剂， 疫苗的安全性显著提 高。 附图。

18、说明 0021 图1为MRC-5细胞关键代次生长成片形态图； 0022 图2为各种培养基培养MRC-5细胞生长趋势示意图； 0023 图3为各种培养基培养MRC-5细胞关键代次病变形态图。 具体实施方式 0024 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。 本发明实施例仅用以说明本发明的技 术方案而非限制， 尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明， 本领域的普通技术人员 应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的精 神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。 0025 本发明以下实施例采用的MRC-5细胞和病毒毒株信息如下： 0026 MRC-5细胞来。

19、源上海荣盛生物药业有限公司， 其原始来源于ATCC， 工作种子批代次 为27代。 VZV-OKa株毒种来源上海荣盛生物药业有限公司， 工作代次为32代， 病毒滴度为 5.1Lg PFU/ml。 0027 本发明以下实施例采用的试剂信息如下： 0028 MEM培养基购买自上海旭太生物工程有限公司； MCDB201无血清培养基(本实施例 记为： SFM01)， BD008无血清培养基(本实施例记为： SFM03)购买自甘肃健顺生物科技有限公 司； M08011无血清培养基(本实施例记为： SFM02)购买自四川百诺吉科技有限公司； 新生牛 血清购买自兰州民海生物工程有限公司； 0.25胰蛋白酶购买。

20、自Gibco公司； 牛血清白蛋白 检测试剂盒购买自无锡博生医用生物技术开发有限公司； 一次性细胞培养瓶、 细胞培养板 等购买自Corning。 0029 MEM细胞培养液添加10v/v牛血清， 调节pH为7.27.4。 MEM细胞维持液添加3v/ v牛血清， 调节pH为7.47.6。 无血清细胞培养液添加5v/v牛血清， 调节pH为7.27.4。 无血清细胞维持液调节pH为7.47.6。 说明书 3/5 页 5 CN 108753736 A 5 0030 将27代MRC-5细胞复苏后， 分别使用MEM和无血清细胞培养液， 37静置培养35 天至细胞单层成片， 按1:2或1:4的分种率连续传代扩。

21、增至34代和35代。 0031 镜检观察34代细胞， 待细胞生长成片后取一瓶计数。 其他细胞分别倒去细胞培养 液， 按照MOI 0.0010.01比例接种VZV-OKa毒株， 置换为细胞维持液。 置36静止培养2天， 待病变率达到3050， 胰酶消化， 重悬后制备病毒悬液， 按照1:20(瓶)比例将病毒悬液 接种至35代细胞， 同样置换为细胞维持液后， 置36静止培养2天。 待病变率达到65 80后， 使用EDTA消化， 离心处理， 加入疫苗保护液重悬并速冻置于-70保存待检。 0032 取待检样品， 置于37和-70速融速冻三次， 通过反复冻融裂解细胞， 离心后取 上清， 制备病毒原液。 0。

22、033 采用噬斑法进行病毒滴定。 将MRC-5细胞进行复苏并扩增， 传代接种至6孔板中37 5CO2培养箱内静置培养34天至生长成片。 将待测样品进行1000倍和300倍稀释， 每个 稀释度平行接种至双孔细胞表面， 37吸附90min， 添加细胞维持液， 继续培养710天。 使 用亚甲蓝染色液染色， 计算每孔蚀斑数， 统计计算样品滴度。 0034 0035 使用ELISA试剂盒及其操作说明书检测牛血清白蛋白残留。 0036 使用无血清培养基培养MRC-5细胞， 接种24h可达到90以上的贴壁率， 与对照 组相似。 连续培养中无血清组细胞生长快， 细胞收获更为致密。 SFM01和SFM02组细胞。

23、形态清 晰， 状态良好， 呈典型纤维状致密排列。 但SFM03组细胞在连续培养至34代和35代时， 形态较 杂乱， 折光差， 细胞培养面逐渐累积较多细胞碎片和黑色颗粒物的聚集， 参见图1。 0037 在细胞连续传代过程中， 取样进行细胞计数。 由于35代细胞需要进行接毒培养， 因 此在统计数据中不含35代细胞的数据。 通过统计数据可以看出， 三种无血清培养基与对照 组细胞培养趋势相似， 对MRC-5细胞培养各代次收获密度均值维持在0.80.3105个/cm2。 随着细胞代次增加， 细胞生长状态都有减缓。 但SFM03组细胞在32代后细胞下降趋势明显， 参见图2。 0038 通过34代和35代细。

24、胞接毒后观察， 可以看出SFM01和SFM02组两种无血清细胞维持 液同样可以维持MRC-5正常病变， 病变形态和病变程度与对照组无明显差异， 病变形态为局 部细胞发生珠状融合病变， 细胞圆缩、 肿大、 折光性增强。 病变率约为3080。 但SFM03 组无血清培养基病变形态为单个细胞圆缩， 出现空斑， 折光更强； 在第二次病毒接种35代细 胞时， 细胞严重拉丝、 脱落， 参见图3。 0039 由上述实验可见， SFM03无血清培养基培养细胞病变杂乱， 有大量死细胞或碎片聚 集， 并且病变不正常， 因此不适合于水痘病毒原液的制取， 并非所有无血清培养基都能应用 于MRC-5细胞培养水痘病毒。 。

25、这也佐证了上述无血清培养基设计开发的针对性、 特殊性， 现 有获得的信息暂无法明确判断是何种原因造成了SFM03的差异。 0040 采用噬斑法和ELISA分别检测制备的水痘疫苗原液滴度和牛血清白蛋白残留量。 由于SFM03组病变异常， 未能制备原液。 结果显示， SFM01无血清培养基制备的原液滴度为 4.5Lg PFU/ml， 与对照组无显著差异并符合药典规定(滴度4.0Lg PFU/ml)。 牛血清白蛋 白残留量检测值为8.9ng/ml和13.0ng/ml， 相比MEM对照组(32.7ng/ml)降低72.8和 60.2， 结果如表1所示。 说明书 4/5 页 6 CN 108753736。

26、 A 6 0041 0042 减少血清添加量的SFM01测试组无血清培养基可以满足MRC-5细胞的正常生长， 细 胞状态、 生长趋势均与对照组相似。 两组减血清后培养制备的细胞基质可以发生典型的VZV 病变。 完全去除血清后， 无血清培养基可以维持细胞病变， 并且病变状态和病变程度、 收获 原液滴度与对照组相似。 在不影响原液滴度的情况下， 无血清培养(基)的应用大幅降低了 原液中牛血清白蛋白残留量60以上。 同时在收获的过程中， 细胞不需要过度洗涤， 回收率 亦有提高。 在整个培养周期中， 相比对照组， 无血清培养(基)血清使用量减少55。 以上数 据证明， 细胞培养采用减血清培养(基)， 。

27、病毒培养采用无血清培养(基)， 两种培养方式的合 理使用可以有效提高水痘疫苗质量。 0043 无血清培养基是继天然培养基、 有血清合成培养基之后研制的一类既能满足细胞 在体外较长时间生长繁殖又无需添加血清避免外源物质污染的合成培养基， 是当前生物工 程领域的一大趋势。 无血清培养基的成分明确， 但比较复杂， 一般认为其由两部分组成， 即 基础培养基和补充因子。 补充因子即无血清培养基中用于代替血清的各种因子的总称， 如 粘附因子、 生长因子、 必需的营养物质和激素等， 可根据细胞种类及培养目的进行调整以达 到更好培养效果。 无血清培养或减血清培养可以减少细胞培养批间差， 使细胞培养条件更 为稳。

28、定； 更为重要的是可以降低外源因子污染风险， 降低或去除产品中外源蛋白的残留， 提 高产品质量。 0044 但无血清培养基并非完美。 首先无血清培养基的开发设计需要根据不同种属细胞 单独制定， 甚至同一种细胞但处于不同的发育分化阶段也需要不同的配方， 对添加因子的 选择尤为重要。 同时引入第二个问题： 无血清培养基成分限定， 对新成分的引入、 去除和残 留需要进行分析定量。 中国药典2015版规定， 若无血清培养基中添加了转铁蛋白、 胰岛素、 生长因子等生物材料时， 应对其可能引入的潜在外源因子进行评估， 包括采用适宜的方法 进行检测等， 并应详细记录其材料来源。 第三， 无血清培养基虽然在悬。

29、浮细胞应用领域较为 广泛成熟， 但对贴壁细胞有其特殊性。 贴壁细胞的贴壁过程、 消化后终止胰酶活性、 生长过 程中解毒保护等都需要血清蛋白因子的作用。 去除血清后将增加对试剂、 水的纯度和仪器 清洁度的要求。 0045 第四， 也是较为重要的一点， 无血清培养基的使用需要对细胞进行适应驯化。 虽然 在培养基的开发设计初首先要考虑细胞特性， 但在某种培养(基)条件下的连续传代也是一 种细胞适应培养(基)的过程。 在规模化生产中， 首先采用无血清培养(基)驯化、 筛选细胞适 应株并建库， 才可能为长期生产提供保障。 0046 采用本实施例提供的方法制取的水痘病毒原液而制取水痘减毒活疫苗， 其牛血清 白蛋白含量为2ng/剂8ng/剂， 显著低于现行所要求的含量规范(残留量50ng/剂)。 说明书 5/5 页 7 CN 108753736 A 7 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 8 CN 108753736 A 8 。