技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及赤芝萜类合酶 GL22395编码基因cDNA序列及其应用。
背景技术
灵芝为担子菌纲(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyproraceae)灵芝 属(Ganoderma)真菌赤芝(Ganodermalucidum)和紫芝(G.sinense)的总 称。灵芝作为我国传统的药用真菌，几千年来一直被用于疾病治疗和 养生保健，具有悠久的药用历史。对于灵芝的药用记载最早出现在两 千多年前的《神农本草经》中，目前灵芝已被《美国草药药典与治疗 纲要》(AmericanHerbalPharmacopoeiaandTherapeuticCompendium) 收录，其药用价值已得到世界各国的广泛认可。灵芝中含有多种生物 活性物质，截止目前，已有400多种不同的化合物被鉴定出来，包括 150余种萜类化合物、灵芝多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸等，因此 灵芝又被称为“生物活性成分细胞工厂”。现代药理学研究已经证明， 灵芝具有多种重要的医学价值，例如抗肿瘤、降血压、抗病毒以及增 强免疫能力等，其在疾病治疗、新药研发等领域中具有广阔的应用前 景。
灵芝萜类与灵芝多糖是灵芝药用活性成分的主要组成部分。灵芝 萜类中主要活性成分是灵芝三萜，其他萜类如单萜、倍半萜以及二萜 也具有较强的药理活性。这三类萜在灵芝中的含量极少，并且提取分 离困难，化学合成亦面临着巨大挑战。同位素标记实验显示：灵芝萜 类通过甲羟戊酸途径(MevalonicAcidPathway，MVP)合成，羊毛 甾醇是萜类化合物和麦角甾醇(真菌细胞膜的重要组分)的共同环状 前体，但是目前对于灵芝萜类下游特异性合成途径的研究还是空白， 对于从单一前体羊毛甾醇形成种类繁多的灵芝萜类的分子机制还不 清楚。灵芝萜类生物合成途径相当复杂，参与其中的关键酶、限速酶 亦数目繁多。
近年来，研究人员已经展开了对灵芝萜类合成的MVP途径中关键 酶基因的克隆及特征描述等相关研究，并取得了显著的进展。 HongmeiLuo等构建了灵芝子实体cDNA文库，并对其做表达序列标 签(ExpressedSequenceTag，EST)分析。研究人员从文库中随机抽 取了1023个克隆，最终获得879条高质量的ESTs，经序列比对后发现 这些ESTs与多种已知功能的基因具有极高的相似度，其中包括编码鲨 烯环氧酶(SE)以及法呢基焦磷酸合成酶(FPPS)的基因。Changhua Shang等从灵芝中分离得到了编码3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶 (HMGR)的基因，并获得了其cDNA全长以及基因组序列全长。 HMGR编码基因的cDNA序列(GenBank编号：EU263989)中开放阅 读框(OpenReadingFrame，ORF)全长为3681bp，编码一条包含1226 个氨基酸的多肽链；HMGR编码基因的DNA序列(GenBank编号： EU263990)全长为4262bp，包含7个外显子和6个内含子。此外，Ding YX等以及ZhaoMW等则分别从灵芝中克隆得到了法呢基焦磷酸合成 酶(FPPS)编码基因的cDNA序列全长以及鲨烯合成酶(SQS)编码 基因的cDNA序列全长和基因序列全长。这些基因的获得对后续进行 灵芝萜类生物合成途径的异源构建及表达等相关研究提供了极其宝 贵的数据和资料。
发明内容
本发明的目的是提供赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列 及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的赤芝萜类合酶GL22395，其为：
1)由SeqIDNo.1所示的氨基酸序列构成的蛋白；或
2)SeqIDNo.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几 个氨基酸且同等功能的由1)衍生的蛋白。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395的编码基因。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列， 其为：
i)SeqIDNo.2所示的核苷酸序列；或
ii)SeqIDNo.2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或 多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或
iii)在严格条件下与SeqIDNo.2所示序列杂交的核苷酸序列；
所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1 ×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤 芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的载体。
本发明还提供含所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤 芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的宿主细胞、工程菌及转基 因细胞系。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝 萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列在调控真菌及植物萜类化合物 合成中的应用。
本发明还提供所述赤芝萜类合酶GL22395编码基因或所述赤芝 萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列在调控萜类化合物体外合成中 的应用。
所述应用是以大肠杆菌内源性FPP(法尼基焦磷酸)为底物，通 过转化赤芝萜类合酶GL22395的编码基因或其cDNA序列，实现在大 肠杆菌内异源合成萜类化合物(倍半萜)。
本发明还提供用于PCR扩增所述赤芝萜类合酶GL22395编码基 因cDNA序列的特异性引物对，包括：
正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′
反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′
本发明利用同源序列搜索和结构域搜索的方法，根据灵芝基因组 (GenBank编号：AGAX00000000.1)公开的序列信息，获得候选萜 类合酶基因cDNA序列，使用引物设计软件LasergenePrimerSelect对该 基因序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻 找最适引物对，最终确定引物序列为：
正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′
反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′
所述萜类合酶编码基因cDNA克隆方法为：提取赤芝菌丝总 RNA，反转录合成cDNA，利用上述引物对，以赤芝菌丝cDNA为模 板进行PCR反应，回收PCR扩增产物与载体链接，转化大肠杆菌感受 态细胞，挑选阳性克隆并测序。
本发明提供的赤芝萜类合酶GL22395的开放阅读框(ORF)长度为 1260bp(SeqIDNo.2)，编码419个氨基酸(SeqIDNo.1)。将GL22395 全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该 基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL22395基因编 码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能 验证的DichomitussqualensLYAD-421SS1(污叉丝孔菌)相似度最高， 达85％。
萜类合酶基因是一类以GPP(牻牛儿基焦磷酸)、FPP(法尼基焦 磷酸)和GGPP(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸)为底物，分别催化单萜、 倍半萜及二萜生物合成的一类酶家族成员。本发明的赤芝萜类合酶 GL22395能够催化上述萜类物质的合成，通过以大肠杆菌内源性FPP 为底物，转化赤芝萜类合酶基因GL22395，从而实现在大肠杆菌内异 源合成萜类化合物。
附图说明
图1为本发明实施例2中GL22395基因在赤芝不同组织部位(菌丝 mycelia、原基primordia、子实体fruitingbodies)的表达情况。
图2为本发明实施例3中重组质粒pET28a-GL22395的PCR鉴定结 果；其中，M为DL2000DNAMaker，1为pET28a-GL22395重组质粒。
图3为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(色谱图)。
图4为本发明实施例3中酶促反应产物的GC-MS分析结果(质谱图)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验 手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1赤芝萜类合酶GL22395编码基因cDNA序列的获得
1、材料及试剂
1.1实验材料
所用灵芝菌种--赤芝购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，以 组织培养获得的灵芝单倍体菌丝为材料提取总RNA。
1.2酶及化学试剂
DNA聚合酶、dNTPMixture、重组DNaseI (RNase-free)、DL5000DNAMaker、DL2000DNAMaker购自TaKaRa 公司；2×EasyTaqPCRSuperMix购自北京TransGen生物技术有限 公司；Trgptone(OXOID,England)、酵母提取物(OXOID,England)、 维生素B1(Sigma)、X-gal(Sigma)、IPTG(Merck)；其他所需药品 均为国产分析纯。
1.3试剂盒
总RNA提取试剂盒、PCR纯化及凝胶提取试剂盒购自QiaGen公 司；1stStrandcDNA合成试剂盒、DNAA-Tailing试剂盒均购自 TaKaRa公司；质粒小提试剂盒(离心柱型)购自TianGen生物技术有 限公司。
1.4菌株及质粒
E.coli转化所用菌株为DH5α型，感受态细胞购自TianGen生物技 术有限公司；所用质粒为pGEM-TEasy型克隆载体，购自Promega公 司。
2、实验方法
2.1培养基及试剂配制
(1)PDA液体培养基(1L)
配方：马铃薯浸取液1.0L(取去皮马铃薯200g，切成小块，加水 1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L)、葡萄糖20g、 KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O1.5g、维生素B1微量。
调节pH至6.0；将培养基分装至100mL玻璃三角瓶，每瓶40mL； 121℃高压蒸汽灭菌15min。
(2)PDA固体培养基
在PDA液体培养基的基础上，每升培养基加琼脂15.0g；121℃高 压蒸汽灭菌15min。在超净工作台内将培养基分装至玻璃平皿中，封 口后倒置于4℃保存备用。
(3)LB液体培养基(1L)
配方：胰酪蛋白胨(Trgptone)10g、酵母提取物5g、NaCl10g。
将pH调节至7.2～7.5，121℃高压蒸汽灭菌灭菌15min。置于4℃ 保存备用。
(4)LB固体培养基(+Amp)
在LB液体培养基的基础上，加入1.5％的琼脂，即每升培养基加 琼脂15g；121℃高压蒸汽灭菌15min。
待培养基冷却至50℃左右时，在超净工作台内加入.氨苄青霉素 (Amp)母液使终浓度为100μg/ml，充分混匀后将培养基分装至玻璃 平皿中，封口后倒置于4℃保存备用。
2.2菌种培养
1)取含有灵芝单倍体菌丝的固体培养基2-3块接于液体培养基 中，28℃、160rpm摇床培养3-4天，转移至250ml培养瓶(含有100ml 液体培养基)继续培养7天，收取菌丝。
2)使用四层纱布过滤，真空抽滤器抽滤灵芝菌丝培养液，并用 灭菌超纯水清洗3次，然后将水分挤干，铝箔纸包好后立即置于液氮 中速冻。放置在-80℃冰箱中保存备用。
2.3灵芝菌丝RNA提取
使用QiaGenMini试剂盒，操作步骤如下：
(1)液氮研磨，取50-100mg粉末放入2ml预冷的EP管中。
(2)加入450μlRLT缓冲液(加1％的β-巯基乙醇，56℃预热 1-3min)。
(3)将样品转移至QiashredderSpinColumn上，最大转速离心 2min，取上清转移至新的EP管中。
(4)加入0.5倍体积的无水乙醇，并混匀。
(5)将样品转移至RNeasySpinColumn上(每次650μl)，≥8000g (≥10000rpm)离心15s，弃掉废液。
(6)加入700μlRW1缓冲液，离心15s，弃废液。
(7)加入500μlRPE缓冲液，≥8000g离心15s，弃掉废液。
(8)加入500μlRPE缓冲液，≥8000g离心2min，弃掉废液。
(9)将RNeasySpinColumn放到新的收集管中，最大转速离心 1min。
(10)将RNeasySpinColumn到新的1.5ml的EP管中，加入30μl RNase-freeddH2O，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(11)取2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并测定浓度。
2.4除去RNA中的基因组DNA
(1)在微量离心管中配制下列反应液，总体积50μl。
(2)37℃反应20～30分钟。
(3)重组DNaseI失活(热处理)：
i.加入0.5MEDTA液2.5μl，混匀，80℃加热处理2min。
ii.用RNase-freeddH2O定容至100μl。
(4)加入10μl3M醋酸钠和250μl冷乙醇，-80℃放置20min。
(5)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
(6)加入70％冷乙醇洗净，4℃，12000rpm离心5min，弃上清。
(7)沉淀干燥。
(8)用10μlRNase-freeddH2O溶解后，进行Agarose电泳检验 RNA提取质量，同时使用NanoDrop测定A260/A280及RNA的浓度。
2.5第一链cDNA合成
使用TaKaRa1stStrandcDNA合成试剂盒，操作步骤 如下：
(1)在微量离心管中配制下列混合液。
(2)在PCR仪上进行变性反应：65℃5min，冰上预冷。
(3)在上述微量离心管中配制下列反转录反应液：
(4)在PCR仪上进行反转录反应：
30℃10min→42℃60min→95℃5min(酶失活)，然后于-20℃ 保存备用。
2.6目的基因的PCR扩增
2.6.1引物序列的设计
根据已经测得的灵芝全基因组(GenBank编号： AGAX00000000.1)数据，通过拼接、注释等操作，获得候选萜类合 酶基因cDNA序列，使用引物设计软件LasergenePrimerSelect对该基因 序列进行分析，在其开放阅读框(ORF)前后100bp的范围内寻找最 适引物对，最终确定引物序列为：
正向引物：5′-GCAGAAGCCGCCAGGCAAAG-3′
反向引物：5′-GCTAAATACGGGCACAGG-3′
引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。将引物配制成 100μM母液，使用时稀释10倍，终浓度10μM。
2.6.2PCR反应
以灵芝菌丝cDNA为模板进行PCR反应，反应体系(50μl)如下：
PCR反应程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min， 共30个循环；72℃10min。于4℃保存。
PCR反应结束后，取2μl样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.7PCR产物回收
使用QiaGenQIAquickPCR纯化试剂盒，操作步骤如下：
(1)向PCR产物中加入5倍体积的PB缓冲液，混匀。
(2)将混合液转移到吸附柱中，吸附柱置于收集管中，离心30-60s。
(3)倒掉收集管中的废液，向吸附柱中加入0.75mlPE缓冲液， 离心30-60s。
(4)倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中，离心 1min。
(5)将吸附柱放入一个新的1.5mlEP管中，向柱子中部加入30μl 无菌超纯水，静置2min后，离心收集。
(6)取2μl样品进行琼脂糖凝胶电泳检测。
2.8PCR产物末端加碱基A
在微量离心管中配制下列加A反应体系(10μl)：
于72℃反应30min。
2.9目的基因与克隆载体连接
在微量离心管中配制下列连接反应体系(10μl)：
于16℃连接过夜。
2.10E.coli转化及蓝白斑筛选
(1)从-80℃冰箱中取出感受态细胞并使其在冰上融化后，每 100μl感受态细胞加入10μl连接产物，冰浴30min。
(2)42℃水浴热激90s，然后快速将离心管转移到冰上，冰浴 5min。
(3)在超净工作台内，每100μl感受态细胞加入600μlLB液体培 养基(不含Amp)，37℃、110rpm震荡培养1h。
(4)在LB固体平板(+Amp)上，加入X-gal40μl、IPTG4μl， 混匀涂板，37℃黑暗放置1h。
(5)向上述处理过的平板上加入150μl感受态菌液，涂板并做好 标记。
(6)倒置平板，于37℃温箱中培养过夜，12-16h出现菌落。
(7)菌落平板倒置于4℃保存。
2.11菌落PCR检测阳性克隆
在微量离心管中配制下列PCR反应体系(10μl)：
在超净工作台内，使用灭菌牙签挑取白色单菌落在LB固体平板 (+Amp)上划线，同时在上述PCR反应体系中搅动2-3次，将微量离 心管置于PCR仪中反应。反应条件与2.6.2中的PCR反应条件一致。
PCR反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳检测。划线平板倒置于37 ℃温箱中培养，菌落长成后于4℃保存。
2.12挑选阳性克隆摇菌并测序
根据菌落PCR结果，挑选4个阳性克隆，使用灭菌玻璃管摇菌， 每管加LB液体培养基(+Amp)2ml，37℃、220rpm震荡培养12h 后送测序。测序单位为北京农业科学院测序中心。
3、GL22395基因cDNA序列的生物信息学分析以及组织表达分析
本发明的赤芝萜类合酶GL22395的开放阅读框(ORF)长度为 1260bp(SeqIDNo.2)，编码419个氨基酸(SeqIDNo.1)。将GL22395 全长开放读码框用BLAST程序在NCBI数据库中进行同源性检索，该 基因在氨基酸水平上进行BLASP比对分析显示，赤芝GL22395基因编 码的蛋白质氨基酸序列与其它物种的同源性较高，其中与已进行功能 验证的DichomitussqualensLYAD-421SS1(污叉丝孔菌)相似度最高， 达85％。
实施例2GL22395基因cDNA序列的组织表达分析
提取赤芝三个不同生长时期菌丝、原基和子实体的总RNA，利用 逆转录试剂盒(PROMEGA)进行逆转录，以蛋白磷酸酶2A(PP2A)基 因为内参基因，进行荧光定量PCR分析，正向引物为： 5′-CTCGCACGCTACAACAAAG-3′，反向引物为： 5′-AGTCGGAAGTGGGTGGG-3′，结果表明该基因在菌丝中的表达明 显高于其在原基和子实体期的表达(图1)。
实施例3GL22395基因cDNA序列的原核表达
1、根据赤芝萜类合酶的全长cDNA序列，设计PCR扩增完整开放 阅读框的引物，分别在正、反向引物上加入限制性酶切位点BamHⅠ 和XholⅠ。所设计的引物为：
正向引物：5′-CGCGGATCCATGAGCGTC-3′
反向引物：5′-CCGCTCGAGTCAGATCGA-3′
以全长cDNA片段为模板，经PCR扩增后，保证赤芝萜类合酶基 因的阅读框完全正确，并用BamHⅠ和XholⅠ内切酶进行酶切反应， 回收目的片段1260bp；大肠杆菌表达载体pET28a用BamHⅠ和XholⅠ 内切酶进行酶切反应，回收目的片段5kb。将经过酶切的赤芝萜类合 酶基因的目的片段克隆至酶切的pET28a表达载体上，转化大肠杆菌 BL21，提取重组子的质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。图2为重组质 粒pET28a-GL22395的PCR鉴定结果。
2、蛋白表达的诱导及产物分析
挑取单克隆接种于3mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37 ℃振荡培养至摇床培养过夜，次日按照1:100稀释加入到50mL液体培 养基中，继续37℃培养，待OD600为0.6-1.0时，加入IPTG至终浓度 0.5mM，28℃诱导目的蛋白表达6-8小时后，50℃水浴，固相微萃取 15min后，手动进样，GC-MS分析催化产物(图3和图4)。所得萜类 化合物--倍半萜的结构如式(I)所示：
在大肠杆菌内异源合成倍半萜的过程如下：
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
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